מח עצם נגזרות Macrophage הפקה

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור מקרופאגים מתרביות תאים שמקורן בשתן, מח עצם. זה מושג תחילה על ידי חילוץ מח העצם מהרגליים האחוריות של העכבר. בשלב השני, המקרופאגים השוכנים במח העצם מוסרים, ולאחר מכן תאי מח העצם עוברים תרבית נוספת בתנאי התמיינות מקרופאגים.

לאחר מכן, כאשר תאי מח העצם התמיינו למקרופאגים, ניתן לאסוף אותם לניתוח ניסיוני. בסופו של דבר, ניתן להשתמש במיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להדגים לוקליזציה של LPS חיידקי בתוך מקרופאגים שמקורם במח עצם, תאים חומציים סופיים. היתרון העיקרי של השיטה הזו על פני שיטות קיימות כמו גידול מקרופאגים, קווי תאים, הוא המספר הגדול הזה, כך שניתן להשיג מקרופאגים ראשוניים.

הדגמה חזותית של השיטה היא קריטית מכיוון ששלבי ייצור עצמי קשים ללמידה ודורשים תרגול, וכדי להשיג הצלחה, יש לחטא את עורו של עכבר שעבר המתת חסד עם 70% אתנול. בצע חתך בחלק העליון של כל רגל אחורית ומשוך את העור כלפי מטה לכיוון כף הרגל כדי לחשוף את השריר. לאחר מכן, חתכו את הרגליים האחוריות והשתמשו במספריים ומלקחיים סטריליים.

להסרת העור, הניחו את הרגליים בצלחת פטרי סטרילית בגודל 35 מילימטר המכילה חמישה מיליליטר קרח סטרילי. PBS קר. הסר את כל העור והשריר המחוברים לעצמות, ולאחר מכן העביר את העצמות לצלחת פטרי סטרילית חדשה המכילה חמישה מיליליטר קרח.

PBS קר וסטרילי. שוטפים את העצמות פעמיים עם חמישה מיליליטר PBS נוספים ואז מעבירים אותן למרגמה סטרילית המכילה חמישה מיליליטר קרח. PBS קר וסטרילי.

כעת חותכים את השוקה מעצם הירך במפרק והשתמשו בעלי כדי לרסק בעדינות את העצמות. אסוף את הסופרנטנט בצינורות קרים של 15 מיליליטר שלוש פעמים. לאחר מכן סנן את תרחיף הרקמה דרך מסננת תאי ניילון של 70 מיקרון.

כדי להסיר את השברים המוצקים, סובב את המסנן והשליך בעדינות את הסופרנטנט. נתק את הגלולה עם מאגר ליזה של כדוריות דם אדומות, הוסף 20 מיליליטר של DMEM קר כקרח לאחר 30 שניות כדי לעצור את התגובה לאחר צנטריפוגה של התאים, אנו משעים את הגלולה ב-20 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס, משלימים DMEM, ואז מפצלים את תרחיף התאים בין שתי צלחות פטרי של 100 מילימטר. דגרו את הכלים במשך ארבע שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן אספו את הסופרנטנטים לצינורות של 50 מיליליטר בטמפרטורת החדר.

לאחר סיבוב הסופרנטנטים, השעו מחדש את הגלולה ב-10 מיליליטר של DMEM שלם בתוספת תאי L 9 29 שהוכן קודם לכן, ולאחר מכן סננו את התאים דרך מסננת תאי ניילון של 40 מיקרון. הוסף את המסנן ל -140 מיליליטר של DMEM שלם ומדיה תאית L 9 29, ולאחר מכן חלק 10 מיליליטר מתרחיף התאים לכל מנה ל -15 צלחות פטרי של 100 מילימטר. לאחר דגירה של התאים במשך שלושה ימים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני ב-10 מיליליטר של DMEM מלא בתוספת L 9 29 supernatant ודגירה על התאים למשך ארבעה ימים נוספים.

ניטור צמיחת התאים מעת לעת במיקרוסקופ הפוך כדי לקצור את מח העצם, המקרופאגים שמקורם במח העצם שואבים תחילה ומשליכים את הסופרנטנט. לאחר מכן שטפו את כלי הפטרי פעמיים עם DMEM מלא. לאחר מכן, הוסיפו חמישה מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס והשתמשו בשוטר גומי כדי לנתק בעדינות את התאים, לאסוף את המקרופאגים שמקורם במח העצם בצינורות של 50 מיליליטר, ואז לסובב את התאים.

Resus משהה את הכדורים ב-20 מיליליטר של DMEM שלם. לבסוף, ספור את התאים לפי אי הכללה של טריאם כחול. בשיטה זו, ניתן להשיג מספר רב של מקרופאגים תוך מספר ימים בלבד לאחר בידוד וציפוי תאי מח העצם העגולים שאינם נדבקים פחות המקרופאגים השוכנים במח העצם כפי שהודגם זה עתה.

תאי מבשר BMDM מייצגים אלה הודגרו עם G-M-C-S-F. לאחר שלושה ימים, התאים החלו להיצמד ולהתמיין למקרופאגים. לאחר שבעה ימים, נצפתה שכבה חד-שכבתית של מקרופאגים שמקורם במח עצם.

ניתוח זרימה ציטומטרי עבור F 4 80 ו-H-L-A-D-R גילה כי המקרופאגים שמקורם במח העצם ביטאו את שני הסמנים המאשרים את ההתמיינות של תאי מח העצם למקרופאגים. להעריך את היכולות החומציות של PHA של מקרופאגים שמקורם במח העצם. יכולתם של התאים להפנים מהירויות לטקס נוטרה כצפוי.

נקבע כי מספר החרוזים לתא גדל עם הזמן כדי להעריך את הפוטנציאל האנדוציטי שלהם. המקרופאגים שמקורם במח העצם היו גם בתרבית משותפת עם קוקסיאלה. LPS עין ברנט באדום נצפה ממוקם בתא המכיל את חלבון הממברנה הליזוזומלי הקשור אחד בכחול, אך לא קטפסין D בירוק, מה שמדגים כי ה-LPS היה קיים באנדוזומים המאוחרים, שאינם מסוגלים להתמזג עם ליזוזומים כצפוי מקרופאג שמקורו במח עצם.

אינטראקציות פתוגנים חיידקיים נותחו עוד יותר באמצעות הזיהום שלהם על ידי עין TMA Wiley. כצפוי, החיידקים באדום לא היו ממוקמים בתא שמכיל את KPS ו-D, שמופיע שוב בירוק. בכתם חיסוני מייצג זה, הוערכו מסלולי העברת אותות מקרופאגים שמקורם במח העצם והראו כי מקרופאגים שמקורם במח עצם דמויי רקמה, מקרופאגים מבודדים מווסתים את רמות הזרחן P 38 אלפא מפת קינאז בתגובה לגירוי ESIA coli LPS.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המיקרוביולוגיה התאית, כגון לאיזה תא תוך-תאי התמקם.