שיטה חדשנית לExosome כימות ומדידה גודל

מטרת הליך זה היא לנתח אקסוזומים לפי גודלם ולכמת אותם באמצעות ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים או מכשיר NTA בשיטה חצי אוטומטית. זה מושג על ידי שימוש בשלבי צנטריפיקציה דיפרנציאליים כדי להשיג כדור אקסוזום מדם אנושי. האקסוזומים מושעים מחדש בריכוז שנקבע מראש לכמות הפלזמה ההתחלתית כדי להשיג את עוצמת הפיזור המתאימה.

במהלך NTA, התרחיף מסונן לאחר מכן כדי להפריד אקסוזומים מחלקיקים גדולים יותר. לאחר מכן, כיול של מכשיר ה-NTA מתבצע באמצעות מתלה בקרה המכיל חלקיקי פוליסטירן בגודל 200 ננומטר. לאחר מכן מוזרק תמיסת האקסוזום למכשיר ה-NTA וההגדרה האידיאלית של ה-NTA נבחרת על ידי ביצוע בדיקה מוקדמת לפני ביצוע הבדיקה הסופית.

בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות כימות של כל החלקיקים הנמדדים ורישום החלקיקים לפי גודלם. ההדגמה של שיטה זו היא קריטית שכן יש לבצע את הפתרון וההגדרה עבור כל תמיסת אקסוזום מוכנה בנפרד כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר. האקסוזומים הנמדדים צריכים להיות בריכוז I כך שמצב התצוגה החיה יציג כ-600 חלקיקים למסך.

כמו כן, יש לבצע בדיקה מקדימה כדי למצוא את טווח הרגישות האופטימלי למדידה. הגדרה גבוהה של רגישות מובילה להדמיה של חלקיקים קטנים יותר, ותגדיל גם את רעשי הרקע הקשורים לבעיות. ההליך יודגם על ידי אנטו מאי, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלנו כדי להתחיל בהכנת אקסוזום, אסוף דם מלא בשלושה צינורות ציטראט באמצעות ניקור ורידים בסך הכל תשעה מיליליטר.

לאחר מכן שפכו את הדם לצנטריפוגה של צינור פלקון בנפח 15 מיליליטר את הדגימה ב-1,500 גרם למשך 20 דקות של ארבע מעלות צלזיוס כדי להתחיל הפרדת תאים מפלזמה. העבירו את ה-S המתהווה לצינור פלקון חדש של 15 מיליליטר. לאחר מכן צנטריפוגה את הדגימה שוב ב-2, 800 גרם למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר את כל התאים מהפלזמה.

העבירו את הפלזמה נטולת התאים או CFP לצינורות אולטרה-צנטריפוגה במיליליטר אחד לכל צינור. לאחר מכן צנטריפוגה את ה-CFP ב-100,000 גרם למשך 90 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לדלל את האקסוזומים. הסר 900 מיקרוליטר של סופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה ב-100 המיקרוליטר הנותרים בצינור האולטרה-צנטריפוגה.

לאחר הוספת 900 מיקרוליטר של צנטריפוגת PBS, אתה מרוויח ב-100,000 גרם למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. כמו קודם, הסר 900 מיקרוליטר מחומר השכיבה והשהה מחדש את הכדורים עם 100 המיקרוליטר הנותרים. העבירו חמישה עד 20 מיקרוליטר של תרחיף Resus ל -40 מיליליטר מים מזוקקים.

סנן את המתלה דרך מסנן של 450 ננומטר כדי להפריד אקסוזומים מחלקיקים גדולים יותר. השתמש במתלה הסופי הזה למדידת חלקיקים כדי להשתמש במכשיר מעקב החלקיקים. ראשית, הפעל את התוכנית על ידי לחיצה כפולה על סמל התוכנה.

לחץ על כרטיסיות התוכנה השונות כדי לעבור ביניהן לאורך הפרוטוקול. בצע את ההוראות שעל המסך. ליישום אוטומטי של הליך האתחול, בחר את התיבות הן עבור בדיקת איכות התא והן עבור יישור אוטומטי.

ניתן לחזור על כל אחד מהשלבים הללו בנפרד במידת הצורך על ידי לחיצה על כפתור A או B בכרטיסיית בדיקת התא. הנח מתחת ליציאת Outlook כדי לאסוף תמיסת פסולת ואל תזריק בועות אוויר למערכת. פתח את יציאת הכניסה והיציאה של ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים או מכשיר NTA והזריק 10 מיליליטר מים מזוקקים על ידי מזרק לתעלת התא דרך יציאת הכניסה.

סגור את יציאת הכניסה והיציאה מיד עם הזרקת כמות המים האחרונה. ודא שתא המדידה נקי מבועות אוויר. בצע את בדיקת איכות התא על-ידי לחיצה על. בסדר.

התוכנה תציג את תוצאת איכות התא לאחר מספר שניות, אם חלקיקים כלשהם עדיין מוצגים במסך החי view של התוכנה, או אם תוצאת בדיקת האיכות היא רק טובה או גרועה, חזור על הזרקת המים הדיסטלית עד להסרת החלקיקים הנותרים מתא המדידה L.כמו כן, חזור על שלב זה לאחר כל מדידה כדי למנוע הצטברות של חלקיקים. לאחר מכן, הכינו מתלה בקרה המכיל חלקיקי פוליסטירן אחידים בגודל 200 ננומטר. כדי ליישר את מוקדי הלייזר והמיקרוסקופ, הוסף טיפה אחת של תרכיז המתלים שסופק על ידי יצרן המכשיר ל-500 מיליליטר של מים מזוקקים וכתוצאה מכך הריכוז הנדרש כך ש-600 פלוס מינוס 100 חלקיקים מוצגים לכל מסך בתצוגה חיה.

הזרקו את מתלה היישור למכשיר ה-NTA כפי שנעשה עבור מכבש המים המזוקקים. אוקיי להתחיל גם יישור, שהיא שגרה אוטומטית שדרכה המערכת תמצא אוטומטית את המיקום האופטימלי של שני המוקדים. כאשר מופיעה הנחיה המציינת שהמערכת מוכנה כעת לניסויים, לחץ על אישור כדי להתחיל במדידה.

מדי פעם נקו את תעלת התא באופן ידני בין ניסויים על ידי שטיפת התא בתמיסה של 30% אתנול. נקה את הערוץ בכל פעם שהתוכנה מציגה דוח שגיאות אוטומטי. לביצוע מדידה של המערכת.

ראשית, שטפו את התעלה במים מזוקקים לפני כל מדידת דגימה. לאחר מכן הזרקו את המתלה האקסוזומי לתעלה. השלב הבא הוא התאמת הפרמטרים העיקריים בתוכנה כדי להתאים את הרגישות.

מצא את טווח הרגישות האופטימלי על ידי לחיצה על מספר החלקיקים לעומת הרגישות כדי להציג עקומה עבור חלקיקים נמדדים למסך עבור רמות רגישות שונות. בחר רמת רגישות לפני השיפוע המרבי של העקומה. רמת רגישות גבוהה יותר מאפשרת הדמיה של חלקיקים קטנים יותר, אך גם מגבירה בעיות הקשורות לרעשי רקע.

כדי לכוונן את הבהירות המינימלית, בחר בהירות התחלתית של 20 למדידת אקסוזום. כדי להשתמש בפונקציה זו כמסנן, יש לווסת פרמטר זה כדי לרוקן חלקיקי פיזור אור חזקים. לווסת אותו כדי להגביר את חפצי הפיזור השבועיים, בהירות רבה לפי הצורך לאורך כל הניסוי.

לאחר מכן, הגדר מסנן דיגיטלי כדי למנוע רעשי פיקסלים וחלקיקים לא רצויים המפזרים יתר על המידה. על ידי ויסות הגודל המינימלי והמקסימלי, השתמש בטווח של 10 עד 500 פיקסלים למדידת אקסוזומים. כוונן את התריס על ידי שינוי פרק הזמן שבו המצלמה פתוחה על ידי הגדרת התריס ל-300, השווה ל-3.3 אלפיות השנייה.

כדי להתאים את פרמטרי הקריאה החיה, עבור בין דיגיטלי לאנלוגי view מודוס בכל נקודה על ידי לחיצה על כפתור התמונה החיה. לאורך כל הניסוי. עקוב אחר סרגל עוצמת הפיזור, המציג את מצב הרוויה של הדגימה כמחוון מקודד צבע.

אל תנתח אקסוזומים אם סרגל הפיזור אדום. כדי להתחיל במדידה, לחץ על לשונית המדידה. בחר הגדרות במערך אפשרויות ההפעלה.

לפני כל רכישה, בחר תנועת בדיקה, בדיקת סחיפה חוזרת של חלקיקים, בחר את מספר הניסויים ואת עיכוב הזמן ביניהם. בצע בדיקה לדוגמה במידת הצורך. לבסוף, לחץ על כפתור הפעל רכישת וידאו.

בחלון החדש הגדר את מספר המחזורים ומספר עמדות המדידה. אשר את משך הזמן המינימלי. חלקיק נמצא במעקב כדי להיספר כחלקיק בודד אחד.

על ידי הגדרת רזולוציית הווידאו, רזולוציה נמוכה יותר מביאה למשך מעקב קצר יותר. לבסוף, בחר שם קובץ ולחץ על אישור כדי להתחיל במדידה. מספר החלקיקים לעומת עקומת הרגישות מציג את החלקיקים במיקום אחד ברגע אחד.

במהלך סריקת רגישות אוטומטית, נבחר ערך רגישות לפני השיפוע המרבי של הגרף. חפצים אינם מסולקים בניסוי בדיקה זה ויכולים להשפיע על הגרף. הדמיה של חלקיקים במסך התצוגה החיה מועילה כדי להגדיר את ערך הרגישות הנכון.

ערך נמוך מדי מוביל לגילוי חלקיקים מעטים. בעוד שערך גבוה מדי מציג תמונה גרועה, חלקיקים איכותיים מופיעים בנקודות בודדות היטב זו מזו ברמת הרגישות האופטימלית. כרטיסיית התוצאה לאחר המדידה מאפשרת קריאת פרמטרים, כולל המספר הכולל של חלקיקים שעקבו אחריהם מספר ממוצע של חלקיקים למיקום וריכוז חלקיקים, כמו גם היחס המספרי בין גודל החלקיקים לאחוז מספרי החלקיקים.

הגרף המחושב לאחר המדידה מראה את התפלגות החלקיקים לפי גודל. ניתן להשתמש בסמלים במצב התצוגה כדי לשנות את הגדרות הגרף. כמו כן, ישנן דרכים שונות לנתח אקסוזומים.

שיטה זו מציגה שיטה פשוטה ואלגנטית מאוד לביצוע ניתוח שיטה דומה בתהליך מהיר כדי לייצר תוצאות בזמן קצר. על מנת להשוות בין מספר דגימות, אנו ממליצים לשמור על אותה רמת דילול עבור כל הדגימות. כל ההגדרות מקבלות את הרגישות וניתן לשנות את רזולוציית הווידאו לאחר מכן באמצעות סט של כמה תוכנות ניתוח.

בדרך זו, ניתוח השוואתי של נתונים שהתקבלו בניסויים שונים על כמות וגודל אקסוזומים הופך לזמין בצורה חצי אוטומטית.