ויזואליזציה של תחומי משנה reticulum endoplasmic בתאים בתרבית

אנו מתארים את גישות ההדמיה אנו משתמשים כדי לחקור את ההפצה וניידות של חלבוני ניאון transfected תושב בreticulum endoplasmic (ER) באמצעות confocal ההדמיה של תאי חיים. אנחנו גם ultrastructurally לנתח את ההשפעה של הביטוי שלהם על הארכיטקטורה של תא subcellular זה.

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לחקור כיצד חלבונים פלואורסצנטיים שעברו טרנספטציה מופצים ונעים ברטיקולום האנדופלזמי ולהעריך את השפעת הביטוי על הארכיטקטורה האולטרה-מבנית. לשם כך, תאים מתורבתים עוברים טרנספטציה חולפת עם חלבונים תושבים מעוגנים בזנב עם GFP. לאחר טרנספקציה מבוצעת הדמיה קונפוקלית של תאים חיים כדי להעריך את התאוששות הקרינה לאחר פוטוהלבנה או אובדן frap ופלואורסצנטי.

בפוטוהלבנה או היפוך, ניתוח אולטרה מבני מבוצע באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור. הנתונים המתקבלים מראים כי הביטוי של מבנה GFP המתויג B חמש משנה באופן דרמטי את הארגון והמבנה של הרטיקולום האנדופלזמי, וגורם להיווצרות אגרגטים. השיטה שאנו מדגימים כאן יכולה לספק תובנה לגבי תהליכים בסיסיים בביולוגיה של התא, כגון ניידות חלבונים ושומנים וסחר בהם.

זה יכול לשמש גם לחקר תגובות לטיפולים פרמקולוגיים כדי להעריך חלבון פלואורסצנטי, מודרניזציה של אוליגו, או לחקור את תפקידם של חלבונים מוטנטיים פתוגניים ביצירת אגרגטים תוך-תאיים של המקור שעשויים להיות רלוונטיים לפתוגניות שלהם, כגון בטרשת צידית אטרופית. הפלסמיד המשמש במחקר זה מורכב מגרסה משופרת של GFP המותכת בקצה C שלה לאזור הזנב של ה-er, איזופורם של ציטוכרום B של חולדה חמש באמצעות רצף מקשר. אזור הזנב של B five מכיל את כל הרצף שנשאר ממברנה המקושרת לאחר מחשוף על ידי טריפסין.

זה כולל את 17 התחום הטרנסממברני של שאריות, המוקף ברצפים קוטביים במעלה הזרם ובמורד הזרם. המקשר מורכב מאפיטופ M ואחריו GLY ארבע S3. ה-CDNA כולו מוכנס לתוך ההינדי שלושת האתרים XO אחד של וקטור הביטוי של היונקים PC DNA שלוש. כהכנה לגידול טרנספקציה עלה שבעה תאים בתוספת DMEM ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 ביום שלפני צלחת הטרנספקציה שלוש פעמים 10 עד חמישית תאים על כיסוי זכוכית עגול של 24 מילימטר מחליק בצלחת שש בארות למחרת.

העבירו את התאים עם מערכת הסילון PEI כפי שמתואר על ידי היצרן כאן, נעשה שימוש ביחס סילון, PEI ל-DNA של שניים לאחד. זה מוביל בדרך כלל ליעילות טרנספקציה של 70 עד 80%שמור על התאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 במשך 24 שעות לפני ההדמיה. לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי להעביר החלקת כיסוי עם תאים שעברו טרנספטציה לתוך תא ההדמיה.

החזר את צלחת תרבית הרקמות לחממה כדי לשמור את התאים הנותרים. לניתוח אולטרה מבני על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים. להדמיית תאים חיים, הוסף שני מיליליטר של מדיום הדמיה לתא תרבית תאי פלדה.

Xi Fluor כלול במדיום ההדמיה כדי למנוע מהדגימות להלבין תמונות. יש לבצע ניסויים בנוכחות smide, מעכב תרגום כדי למנוע כל עלייה באות הקרינה A וכתוצאה מכך פלואורסצנטיות מוחלטת עקב חלבון. ביוסינתזה. הנח את תא ההדמיה על הבמה של מיקרוסקופ קונפוקלי, המצויד בחממת CO2 מבוקרת טמפרטורה ולייזרים מתאימים עם הגדרות מכפיל פוטו מתאימות לביצוע התאוששות פלואורסצנטית.

לאחר פוטו-הלבנה או פראק הביאו את התאים למיקוד, הגדר את פרמטרי הרכישה כדי למנוע רוויה של פיקסלים. כמו כן, ודא שעוצמת הלייזר מוגדרת נמוכה ככל האפשר כדי למנוע הלבנת תמונות עקב רכישת תמונה. לאחר הגדרת פרמטרי ההדמיה, עבור לשדה ראייה חדש עם שני תאים או יותר.

תא אחד בכל שדה רכישה צריך להישאר לא מולבן, כך שניתן יהיה להשתמש בו כדי לנרמל את האות הפלואורסצנטי של התא או התאים המולבנים. להלבנה. צייר אזור עניין או החזר ROI המתאים לרטיקולום אנדופלזמי חלק מאורגן או OSER.

הגדר את תוכנית ההדמיה להלבנה באמצעות מספר מתאים של איטרציות להלבנת פוטו יעילה ומהירה במידת הצורך, ניתן להשתמש בשילוב של לייזרים של 488 ננומטר ו-405 ננומטר. הנחו את התוכנה ללכוד פריים בודד כל 10 שניות למשך 10 דקות לאורך כל מהלך הניסוי. זה כולל את תקופות הקדם, האקונומיקה וההתאוששות.

לאחר שהכל מוכן, התחל הלבנה ולכידה. לאחר השלמת הלכידה, עבור לשדה ראייה חדש וחזור על תהליך זה. לכוד ארבעה עד חמישה שדות ראייה עבור כל כריכה.

החלק ליד כדי למדוד אובדן פלואורסצנטי בהלבנת תמונות או היפוך. הורה לתוכנית לבצע רצף של הלבנה והדמיה לאחר הלבנה למשך 10 שניות כל 30 שניות למשך 10 דקות, לעבור לשדה ראייה חדש. צייר החזר ROI המתאים למבנה OSER והתחל הלבנה ולכידה כמו קודם לצורך ניתוח.

ייבא את התמונות וההפוך לתוכנת Image J. ראשית, העריכו את התאוששות הקרינה של ה-ROI המולבן לאורך זמן עבור ניסויי הפרק, ולאחר מכן קבעו את הקרינה ברקע על ידי בחירת אזור מחוץ לתאים ומדדו את עוצמתו הממוצעת לאורך זמן. לאחר מכן, הפחיתו את אות הרקע מעוצמות הפלואורסצנט של החזר ה-ROI.

נרמל את הנתונים לפלואורסצנטיות הכוללת של התא המולבן, שאמור להיות קבוע לאורך זמן. לאחר מכן התאם את המשוואה האקספוננציאלית המונו המוצגת כאן כאשר F post הוא האות הפלואורסצנטי לאחר הלבנת תמונה. F rec הוא ערך התאוששות הקרינה המקסימלי שהושג לאחר ההלבנה T הוא הזמן האחרון של הרישום, וטאו הוא זמן אמצע הרישום.

לניתוח ניסויי ההיפוך, צייר החזר ROI מחוץ ל-OSER המולבן, המכסה את כל התא ומדוד את עוצמת הקרינה שלו לאורך זמן. באשר לניסויי פראק, הפחיתו רקע על ידי שימוש באזור מחוץ לתאים. נרמל את הנתונים לרמות הקרינה של החזר ROI שצויר על תא לא מולבן כדי לתקן כל ירידה בקרינה הנגרמת על ידי ההדמיה עצמה.

לבסוף, שרטט את התוצאות באמצעות GraphPad prism או תוכנה דומה. רבים מהריאגנטים המשמשים להכנת הדגימות למיקרוסקופיה אלקטרו-מיקרוסקופיה הם רעילים. לכן, יש לבצע את השלבים הבאים בלבישת מעיל מעבדה וכפפות תוך כדי עבודה מתחת למכסה אדים.

לאחר הסרת החלקת הכיסוי מצלחת הפטרי למיקרוסקופיה אופטית, יש לתקן את התאים הנותרים הגדלים בתחתית הכלי כשכבה חד-שכבתית למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, בעזרת מגרד טפלון, נתק את התאים והעביר אותם לצינורות מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר כדור התאים על ידי צנטריפוגה ב-9,000 פעמים G למשך 10 דקות לאחר הסיבוב. מסירים את הסופרנטנט, מוסיפים קיבוע טרי ומשאירים לילה בארבע מעלות צלזיוס למחרת.

שטפו את הכדורים על ידי שאיבת הקיבוע בעדינות עם פיפטה קודמת והוספת מאגר קאט. כדי למנוע הפרעה לגלולה, אפשר למאגר לזרום לאורך דופן הצינור עם הוספתו. שאפו את תמיסת הכביסה והשאירו את התיקון על ידי הוספת תאים בתמיסה של 1% טטרוקסיד אוסמיום ב-Cate Buffer למשך שעה בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, יש לשטוף במי Milli Q ולהוסיף 1% אצטט משתנה במים מזוקקים ישירות לצינור המיקרו צנטריפוגה. שחרר את חסימת הכתם למשך 20 דקות עד שעה, יבש את הדגימות בסדרת אתנול הולכת וגדלה של 70%80%90%100% ו-100%שוב למשך 10 דקות כל אחת. לאחר מכן שוטפים את הכדורים פעמיים בתחמוצת פרופילן למשך 15 דקות בכל פעם.

הסתנן לדגימות על ידי החלפת תחמוצת הפרופילן בתערובת אחד לאחד של תחמוצת פרופילן ודגירה של אפון למשך שעתיים לפחות וכל עוד הלילה. לאחר מכן, כדי להטמיע את הדגימות, הנח את שברי כדורי התא בתבניות הטבעה הממולאות מראש בריפוי שרף אפוקסי אפון בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפחות. למחרת, הרכיבו את גוש השרף על מיקרוטום אולטרה המצויד בסכין יהלום 45 מעלות.

בעזרת סכין חיתוך, חתוך ידנית את גושי השרף כדי להסיר את החלקים של גוש השרף שבהם הדגימה המוטבעת אינה קיימת. לאחר מכן באמצעות המיקרוטום האולטרה, השג קטעים של 60 עד 70 ננומטר. אסוף את החלקים על 300 רשתות נחושת רשת כדי להכתים את החלקים.

הניחו את הרשתות על 30 טיפות מיקרוליטר של תמיסה רוויה של משתנה, אצטט ודגירה למשך 20 דקות. לאחר מכן שטפו שלוש פעמים במי מילי Q ודגרו שוב את הרשתות על טיפות קטנות של ציטראט עופרת למשך שבע דקות. לאחר הדגירה יש לשטוף היטב את הרשתות על ידי טבילתן במי מילי Q ולאפשר להן להתייבש בטמפרטורת החדר.

התבונן ברשתות המוכתמות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור וצלם תמונות באמצעות מצלמת CCD המותקנת בתחתית בהגדלה סופית, הנעה בין 6,000 ל-39,000 x כדי לחקור דיפוזיה רוחבית של D-E-G-F-P ER ברטיקולום אנדופלזמי מאורגן וחלק. טרנספטציה חולפת גרמה לשבעה תאים משלוש החלקות כיסוי נותחו על ידי frap כמתואר בסרטון זה כפי שמוצג ברצף זמן-lapse זה, שני מבני OSER הולבנו והתאוששות פלואורסצנטית נרשמה לאורך זמן. התאוששות פלואורסצנטית ברורה זוהתה דקה לאחר ההלבנה עם עלייה נוספת באות ארבע דקות לאחר מכן כדי לקבוע את מחצית ההתאוששות ולכמת את החלק הנייד של D-E-G-F-P-E-R.

התמונות שצולמו נותחו כמתואר בסרטון זה כפי שניתן לראות כאן. עוצמת הפלואורסצנט של האזור המולבן גדלה עם הזמן, מה שמדגים כי החלבון הפלואורסצנטי נייד מאוד בתוך האגרגטים. כדי לחקור את ההמשכיות בין תת-תחומים שונים של הרשתית האנדופלזמית, בוצעו ניסויי היפוך כפי שמוצג ברצף זמן-lapse זה.

ההלבנה המתמשכת של OSER המסומנת כאן על ידי החץ הצהוב גורמת לירידה הדרגתית בקרינה בשאר חדר המיון ובמבנים אחרים של OSER באותו תא. החץ האדום מציין חלק מתא לא מולבן שבו האות הפלואורסצנטי קבוע לאורך זמן. ניתוח כמותי של נתונים אלה חשף ריקון הדרגתי ומהיר של ה-ER הרשתית, והראה כי האגרגטים מחוברים פיזית לשאר חדר המיון כדי לבחון את הארכיטקטורה העדינה של אגרגטים אלה נצפו תאים המבטאים רמות גבוהות של D-E-G-F-P ER באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור.

מיקרוגרף זה מציג תצוגת הגדלה נמוכה של ציטופלזמה של תאים המכילה מצבור של ממברנות. האגרגט מורכב מערימה cyi וממברנות סינוסואידיות גליות. כפי שניתן לראות כאן.

ניתן לראות מיטוכונדריה מקובצים סביב מבני ה-OSER, בעוד שהריבוזומים המסומנים על ידי ראשי החץ מעטרים רק את הממברנות של ה-cyi החיצוני ביותר. שימו לב שהחלל הצפוף באלקטרונים בעובי 11 ננומטר בין הממברנות רציף עם הציטופלזמה. מערכת הפעלה ER עשויה להיווצר על ידי lamellar er, שהן ערימות של er cyi שטוחות שיכולות להיות רציפות או מקוטעות במראה שלהן בקטעים דקים, ניתן להבחין מדי פעם בשלפוחיות, הנובטות מהבור החיצוני ביותר של הערימה כפי שמוצג כאן.

יחד, נתונים אלה מדגימים כי האגרגטים הפלואורסצנטיים שנצפו בתאים מתורבתים שעברו טרנספטציה עם D-E-G-F-P ER מייצגים טלאים של סטרי חלק ושטוח המארגנים את עצמם מרחבית לגיאומטריות תלת מימדיות מוגדרות היטב. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לרכוש את כל התמונות ללא פיקסלים רוויים, מה שעלול לשנות את ההתאוששות הפלואורסצנטית וכתוצאה מכך את ניתוח ניידות החלבון. הקפד תמיד לנרמל את האות הפלואורסצנטי באקונומיקה, אזור העניין לפלואורסצנטיות הכוללת של אותו תא על מנת לקחת בחשבון שינויים בעוצמת הקרינה עקב הלבנה במהלך רכישת תמונה או שינויים קטנים במישור המיקוד.