Name: ויזואליזציה של תחומי משנה reticulum endoplasmic בתאים בתרבית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-18T13:45:00.000+00:00
Duration: 16 min 43 s
Description: חקור את התפלגות ותנועת חלבונים פלואורסצנטיים ברטיקולום האנדופלזמי בתאים בתרבית באמצעות מיקרוסקופיית קונפוקל חיה ו-FRAP. השיטה מאפשרת ניתוח מבנה אולטרה-מבני ודינמיקה תאית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לFondazione Filarete לעזרתה ותמיכה בפרסום של מאמר זה. כמו כן, אנו רוצים להודות לCentro di Europeo Nanomedicina לשימוש במיקרוסקופ האלקטרונים הילוכים Tecnai G2.

1. פלסמיד, תרבית תאים, וtransfection עם חלבונים ניאון ER <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלסמיד המשמש במחקר זה מורכב מגרסה משופרת של ה-GFP התמזגו בC-הסופית שלה לאזור הזנב של איזופורם ER של b ציטוכרום חולדה (5) (מקוצר כאן ב (5)) באמצעות רצף מקשר. אזור הזנב מכיל את כל הרצף (Pro94-Asp134) שנשאר קרום הקשורים לאחר מחשוף טריפסין של b ילידים (5), ובכלל זה TMD 17 השאריות (תחום הטרנסממברני), מוקף ברצפי קוטב מעלה או במורד (UPS ו DPS) . מקשר מורכב מepitope myc אחריו [4 Ser (גלאי)] 3, וכל cDNA מוכנס לתוך אתרי Hind3-Xba1 של pCDNA3 וקטור ביטוי של היונקים. פרטי הבנייה של פלסמיד זה תוארו בפרסום קודם שבו הוא מכונה ה-GFP-ER 16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול COS-7 תאים בנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM) בתוספת פטה 10%סרום שור l, L-גלוטמין 2 מ&quot;מ, 1% פניצילין / סטרפטומיצין בחממה על 37 מעלות צלזיוס ו10% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfection. צלחת 3 x 10 5 תאים על coverslip זכוכית עגול בצלחת 6 היטב ו, ביום שלאחר מכן, transfect עם מערכת JetPEI כפי שתוארו על ידי היצרן. שים לב שיחס JetPEI / DNA האופטימלי נבדק על מנת לבסס את יעילות transfection המרבית בהתאם לפלסמיד והקו סלולרי בשימוש: במקרה שלנו, JetPEI: יחס ה-DNA של 2:1 מוביל ל70-80% יעילות transfection. </li></ol> 2. בשידור חי הקרינה סריקת מיקרוסקופיה confocal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Live-תא הדמיה. שים את coverslip על שתאי transfected היו זורעים לתוך תא תא תרבות פלדה ל24 coverslips מ&quot;מ מלא DMEM w / o פנול אדומה, בתוספת 10% FBS, 2 מ&quot;מ L-גלוטמין, 1% עט / סטרפטוקוקוס, 25 HEPES מ&quot;מ , 50 מיקרוגרם / מיליליטר cycloheximide ו1:100 OxyFluor כדי למנוע את הדגימות מphotobleaching. Microscop confocal SP5הדואר מצויד בחממה בטמפרטורה מבוקרת CO 2 (37 ° C ו 5% CO 2) משמש לניסויי הדמיה תא חי, עם GFP-ER ד שדמיין באמצעות לייזר 488 ננומטר ומסנן 525/50 פליטה לעבור להקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאוששות הקרינה לאחר photobleaching (FRAP). צייר אזור של עניין (ROI), המקביל למבנה Oser, ולהלבין אותו באמצעות 20 חזרות ושילוב של 488 ננומטר (של לייזר 30 mW ארגון 100%, המקביל ל 5.5-6 μW במדגם) ו405 ננומטר (60% לייזר דיודה 405 30 mW, המקביל ל 11.6 μW במדגם) לייזרים אשר, בניסיון שלנו, מוביל לphotobleaching יעיל והמהיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את ההתאוששות של הקרינה בROIs המולבנת על ידי לקיחת מסגרת אחת כל 10 שניות ל10 דקות (זמן = פיקסל 1.61 μsec / px). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אובדן הקרינה photobleaching (פליפ). לצייר את ההחזר על ההשקעה המתאימה למבנה Oser, ואקונומיקה כמתואר לעיל. הלבנת חוזרת על עצמו כל 30 שניות,ותמונות שלאחר הלבנת-נרשמות כל 10 שניות ל30 דקות (זמן = פיקסל 1.61 μsec / px). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> FRAP וניתוח FLIP. כל התמונות נותחו באמצעות תוכנת ImageJ <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">(http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html).</a> בניסויים FRAP, התאוששות הקרינה של ההחזר על ההשקעה המולבנת נמדדת לאורך זמן ומנורמל לקרינה הכוללת של תא מולבן, שתמיד בדקה כדי להיות קבוע לאורך זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניסויי FLIP, לצייר את ההחזר על ההשקעה מחוץ לOser מולבן ומכסה את כל התא. למדוד עוצמת הקרינה שלה לאורך זמן ולנרמל את רמות הקרינה של החזר על השקעה שצוירו על תא מולבן על מנת לתקן את כל ירידה בקרינה הנגרמת על ידי ההדמיה עצמו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל הניסויים, מופחתים אות הרקע (שנקבעה באזור שמחוץ לתאים) מעוצמות הניאון של ROIs. לבסוף, תשרטט את התוצאות באמצעות Grתוכנת aphPad פריזמה. </li></ol> 3. Ultrastructural ניתוח באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים לאור רעילותם של רבים מהחומרים הכימיים, כל ההליכים צריכים להתבצע לובשים מעבדה מתאימה. מעיל וכפפות מתחת למכסת מנוע קטר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסרת coverslip מצלחת פטרי, לתקן את התאים שנותרו גדלו על תחתית הצלחת כmonolayer באמצעות glutaraldehyde 2% מסוננים ב0.1 חיץ cacodylate מ &#39;, pH 7.4, ל10 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרד את התאים באמצעות מגרד טפלון ולהעביר אותם לתוך 1.5 צינורות מיליליטר Eppendorf. גלולה התאים באמצעות צנטריפוגה ב9,000 גרם ל10 דקות. הסר את supernatant, להוסיף מקבע טרי, ולהשאיר לילה בשעה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את כדורים עם החיץ, אז פוסט לתקן עם תמיסה של 1% tetroxide אוסמיום במאגר cacodylate במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם מים MilliQ, וחדר כתם גוש עם1% אצטט uranyl במים מזוקקים לבין 20-60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבשים את הדגימות בסדרת אתנול (70%, 80%, 90%, 100%, ו10 דקות כל אחד 100%) הולך וגדל, ולשטוף בקצרה פעמיים בפרופילן אוקסיד (15 דקות כל אחד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחדור דגימות בתערובת של תחמוצת פרופילן + קומיטה (1:1) (משעה 2 ללילה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע בשרף אפוקסי קומיטה רפא ב60 מעלות צלזיוס במשך לפחות 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיף גושי שרף הגזוז באופן ידני באמצעות ultramicrotome LEICA UC6 מצויד בסכין יהלום 45 ° להשיג חלקים בעובי של 60-70 ננומטר. לאסוף את החלקים ב300 רשתות נחושת רשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכתים את החלקים ברשת עם תמיסה רוויה של אצטט uranyl (20 דקות) ולהוביל ציטרט (7 דקות), לשטוף ביסודיות את הרשתות על ידי טבילתם במים מזוקקים דו מסוננים, ולאפשר להם להתייבש בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרשתות המוכתמות הם נצפו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים Tecnai G2, והתמונות שנתפסו באמצעות בוטמצלמת CCD רכוב אום בהגדלות שונות סופיות (נעות בדרך כלל בין 6,000-39,000 X). </li></ol>

<ol><li>Fasana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+VAPB+mutant+linked+to+amyotrophic+lateral+sclerosis+generates+a+novel+form+of+organized+smooth+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">A VAPB mutant linked to amyotrophic lateral sclerosis generates a novel form of organized smooth endoplasmic reticulum.</a> FASEB J. 24, 1419-1430 (2010).</li>
<li>Borgese, N., Francolini, M., Snapp, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+architecture%3A+structures+in+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum architecture: structures in flux.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 18, 358-364 (2006).</li>
<li>Ronchi, P., Colombo, S., Francolini, M., Borgese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+domain-dependent+partitioning+of+membrane+proteins+within+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transmembrane domain-dependent partitioning of membrane proteins within the endoplasmic reticulum.</a> J. Cell Biol. 181, 105-118 (2008).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+protein+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 444-456 (2001).</li>
<li>Lee, M. C., Miller, E. A., Goldberg, J., Orci, L., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bi-directional+protein+transport+between+the+ER+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Bi-directional protein transport between the ER and.</a> 20, 87-123 (2004).</li>
<li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+stacked+ER+cisternae+by+low+affinity+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions.</a> J. Cell Biol. 163, 257-269 (2003).</li>
<li>Papiani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restructured+endoplasmic+reticulum+generated+by+mutant+amyotrophic+lateral+sclerosis-linked+VAPB+is+cleared+by+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Restructured endoplasmic reticulum generated by mutant amyotrophic lateral sclerosis-linked VAPB is cleared by the proteasome.</a> J. Cell Sci. 125, 3601-3611 (2012).</li>
<li>Almsherqi, Z. A., Kohlwein, S. D., Deng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cubic+membranes%3A+a+legend+beyond+the+Flatland%2A+of+cell+membrane+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cubic membranes: a legend beyond the Flatland* of cell membrane organization.</a> J. Cell Biol. 173, 839-844 (2006).</li>
<li>Federovitch, C. M., Ron, D., Hampton, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+ER%3A+experimental+approaches+and+current+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The dynamic ER: experimental approaches and current questions.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 17, 409-414 (2005).</li>
<li>Takei, K., Mignery, G. A., Mugnaini, E., Sudhof, T. C., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate+receptor+causes+formation+of+ER+cisternal+stacks+in+transfected+fibroblasts+and+in+cerebellar+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor causes formation of ER cisternal stacks in transfected fibroblasts and in cerebellar Purkinje cells.</a> Neuron. 12, 327-342 (1994).</li>
<li>Feldman, D., Swarm, R. L., Becker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+study+of+rat+liver+and+liver+neoplasms+after+long-term+treatment+with+phenobarbital%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural study of rat liver and liver neoplasms after long-term treatment with phenobarbital.</a> Cancer Res. 41, 2151-2162 (1981).</li>
<li>Sprocati, T., Ronchi, P., Raimondi, A., Francolini, M., Borgese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+reversible+restructuring+of+the+endoplasmic+reticulum+induced+by+PDMP+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Dynamic and reversible restructuring of the endoplasmic reticulum induced by PDMP in cultured cells.</a> J. Cell Sci. 119, 3249-3260 (2006).</li>
<li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13, 643-649 (2012).</li>
<li>Pyszniak, A. M., Welder, C. A., Takei, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+distribution+of+high-avidity+LFA-1+detected+by+soluble+ICAM-1-coated+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cell surface distribution of high-avidity LFA-1 detected by soluble ICAM-1-coated microspheres.</a> J. Immunol. 152, 5241-5249 (1994).</li>
<li>Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+proteins+in+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Toxic proteins in neurodegenerative disease.</a> Science. 296, 1991-1995 (2002).</li>
<li>Winklhofer, K. F., Tatzelt, J., Haass, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+faces+of+protein+misfolding%3A+gain-+and+loss-of-function+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The two faces of protein misfolding: gain- and loss-of-function in neurodegenerative diseases.</a> EMBO J. 27, 336-349 (2008).</li>
<li>Borgese, N., Gazzoni, I., Barberi, M., Colombo, S., Pedrazzini, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+a+tail-anchored+protein+to+endoplasmic+reticulum+and+mitochondrial+outer+membrane+by+independent+but+competing+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Targeting of a tail-anchored protein to endoplasmic reticulum and mitochondrial outer membrane by independent but competing pathways.</a> Mol. Biol. Cell. 12, 2482-2496 (2001).</li>
<li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol Rev. 90, 1103-1163 (2010).</li>
<li>Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+perturbation+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells+FRAP%2C+photoactivation%2C+photoconversion%2C+and+FLIP%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).</li>
<li>Michida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelin+1+in+hemorrhagic+shock-induced+gastric+mucosal+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Role of endothelin 1 in hemorrhagic shock-induced gastric mucosal injury in rats.</a> Gastroenterology. 106, 988-993 (1994).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

הפרוטוקולים וגישות הדמיה מתוארות במאמר זה נעשו שימוש כדי לחקור את ההפצה וניידות של חלבוני ניאון ת&quot;א transfected תושב בחדר המיון של תאי חיים. יש לנו גם ניתחתי את ההשפעה של ביטוי יתר של חלבונים אלה על הארכיטקטורה של תא subcellular זאת באמצעות ניתוחי ultrastructural. השילוב של הדמיה confocal לחיות תאים במיקרוסקופ אלקטרונים מייצג הוא אמצעי חזק מאוד של חוקר את התכונות דינמיות של חלבונים, ועשוי לספק מידע חשוב הנוג...

גילוי חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) וריאנטים הרפאים שלה, ופיתוח המקביל של מיקרוסקופ פלואורסצנטי של, נפתח אפיקים חדשים לחלוטין לחקירה של חלבון התנהגות בתאים. טכניקות כגון התאוששות הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) וירידה בקרינה בphotobleaching (פליפ), שהם אפשריים בגלל היכולת הפנימית של fluorophores לכבות הקרינה שלהם תחת תאורה אינטנסיבית, מבוססות על הדמיה לחיות תאי confocal והשימוש בtransfected חלבוני היתוך ניאון 1-3. הם נמצאים בשימוש נרחב כדי להעריך לא רק את הלוקליזציה של חלבונים, אלא גם הניידות שלהם והובלת ועי, אשר יכול לחשוף רמזים חשובים הנוגעים לתפקודם 4. התכונה הייחודית של תאי אוקריוטים היא נוכחותם של תאים תאיים שיש לי קומפוזיציות שומנים וחלבונים ספציפיות. למרות האברונים הם בידוד ע פיזיאד, הם צריכים לתקשר אחד עם השני ולשתף את המרכיבים מולקולריים על מנת לשמור על הומאוסטזיס הסלולר. מסלול ההפרשה מבטיח שהחלבונים והשומנים מסונתזים בחדר המיון להגיע ליעד הסופי הנכון שבו הם מפעילים את תפקידם. יכולים גם להיות מחוברים אברונים תאיים על ידי אתרים ליצירת קשר דינמיים המאפשרים למולקולות (שומנים) שתוחלפנה ישירות בין תאים. יתר על כן, חלבונים רבים להתאספו במתחמי heteromeric גדולים או הקשורים למיני שומנים מסוימים (רפסודות שומנים בדם / microdomains) בכדי להפוך לפונקציונלי פעיל או להיות מועבר ליעדן הסופי. כל היבטים ביולוגיים אלה משפיעים באופן משמעותי את מאפייני הקינטית של חלבונים, ולכן ניתן לחקור כראוי באמצעות הטכניקות מתוארות להלן. הקבוצה שלנו בשימוש נרחב FRAP ולהעיף בשילוב עם מיקרוסקופ אלקטרונים כדי ללמוד את הארכיטקטורה של חדר המיון ותת השונים שלהתחומים. חדר המיון הוא התחנה הראשונה של מסלול ההפרשה וממלא תפקיד מרכזי בחלבון ושומני מיון 5. זהו אברון דינמי מאוד משנה שברורה לשקף את תפקידיה הרבים ושונים (כלומר חלבון וביוסינתזה שומנים וסחר, קיפול חלבונים, Ca 2 + אחסון ולשחרר, וחילוף חומרי xenobiotic). עם זאת, למרות שהם מורפולוגית, מרחבית, ותפקודיים שונים, תחומים אלה הם רציפים אחד עם השני, והשפע היחסי שלהם יכול להיות שונה בתאים בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. ידוע ביותר ותחומים בדרך כלל במרחב נפרד מחדר המיון הם מעטפת הגרעין, וER החלק ומחוספס, עם זאת, אנחנו ואחרים הראינו כי יש מבני ER עם ארכיטקטורה משוכללת יותר וארגון תלת ממדים בסוגי תאים שונים ו רקמות בתנאים פיסיולוגיים שיכול גם להיגרם על ידי אמצעים של גירויים מלחיצים כגון היפוקסיה, סמיםממשל, או על הביטוי של חלבוני ER-תושב הטרנסממברני 2,6 (והפניות בו). יש לנו גם לאחרונה הפגין את נוכחותם של מבנים כאלה במודלים של תא של מחלות אנושיות 1,7. מקורם cisternae המוערמות של ER חלק, הם קבלו את השם הקולקטיבי של reticulum המאורגן החלק endoplasmic (Oser) ב2003 6, למרות שהם ידועים גם בשם karmellae, lamellae, וER גבישן על בסיס הארכיטקטורה שלהם, אשר, כמוהם גודל, יכול להשתנות. אחרי התאים transfected עם GFP התמזגו לאזור cytosolic של חלבונים (ת&quot;א) ER-תושב (ד EGFP-ER) מעוגני זנב, הנטייה החלשה dimerizing של ה-GFP בטרנס באופן דרמטי משנה את הארגון ומבנה של חדר המיון. FRAP והניסויים FLIP הראו כי EGFP-ER ד הוא בחינם כדי לפזר בתוך OSERs, והעובדה שהוא נע מחדר מיון רשתי לOser ולהיפך &lt;/ Em&gt; מצביע על כך שהמצרפים הם רציפים עם ER הרשתית שמסביב. ניתוח Ultrastructural אפשר לנו לתאם את נתוני הקרינה עם תיאור מפורט של אדריכלות Oser וארגון ברמת ננו: OSERs תמיד בנוי מערמות של cisternae לזווג של ER החלק אבל ייתכן שיש לי צורות שונות של ארגון המרחבי, כגון מסודר באופן קבוע סינוסי מערכים או מערבולות, או מערכים צינורי משושה &quot;גבישן&quot;. שחלופים אלה להוביל למורפולוגיות מעוקב 8 אשר, כפי שהם כבר נמצאים בתאים בתנאים פיסיולוגיים 9 ולחצים כגון היפוקסיה 10, טיפול תרופתי 11, וסרטן 9 הבאים, ייתכן שיש פוטנציאל משמעותי כסמני ultrastructural. לאחר הפגנה ראשונה זה באמצעות חלבוני GFP היתוך, השתמשנו ניסויי הדמיה כדי לנתח את ההתפשטות של תחומים ER בתגובה לטיפולים תרופתיים 12, assess הנטייה של חלבוני ניאון לoligomerise בתאי 13, וכדי לחקור את התפקיד של מוטציה, חלבון ת&quot;א ALS צמוד להיווצרות של אגרגטים תאיים ממוצא ER שעשויה להיות רלוונטי ל1,8 פתוגניות שלה. היה מי שהציע כי היווצרות של אגרגטים תאיים (אשר מתרחשת במחלות ניווניות רבות 14) עשויה להיות מנגנון הגנה שנועד למנוע האינטראקציות בין חלבוני מוטציה רעילים ומרכיבי התא המקיפים 15. להלן תיאור של שילוב של שיטות מיקרוסקופית אופטיות ואלקטרונים לחקירת מבנים בטרמינל C-שתחומים הידרופובי מוכנסים לתוך הקרום של ER, וניתוח של ההתנהגות הדינמית שלהם ואת ההשפעות של יתר הביטוי שלהם בתחום ER אדריכלות בתאים בתרבית (ראה תרשים 1 לתרשים זרימה של פרוטוקול הניסוי).

<table><tbody><tr><td>דולבקו s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM) עם פנול אדום</td><td>Invitrogen</td><td>31053028</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>עט/סטרפטוקוקוס</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM תמיסה</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>jetPEI</td><td>Polyplus Transfection</td><td>PP10110</td><td></td></tr><tr><td>OxyFluor</td><td>Oxyrase בע"מ</td><td>OF-0005</td><td></td></tr><tr><td>גלוטראלדהיד דרגה I</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>נתרן קקודילאט טריהידראט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C0250</td><td></td></tr><tr><td>אוסמיום טטרוקסיד תמיסה 4%</td><td>מיקרוסקופיה אלקטרונית מדע</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>אורניל אצטט דיהידראט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>73943</td> מעט <td>רדיואקטיבי</td></tr><tr><td>פרופילן אוקסיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>82320</td><td></td></tr><tr><td>EPON הטמעת ערכה בינונית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>45359-1EA-F</td><td></td></tr><tr><td>עופרת ציטראט </td><td>אלקטרונים מיקרוסקופיה מדע</td><td>17800</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה עליונה ספסל</td><td>Eppendorf</td><td>5415 D</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרלי קונפוקלי מיקרוסקופ </td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>CO2 מערכת דגירה של כלוב מיקרוסקופ </td><td>OkoLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome </td><td>Leica Microsystems</td><td>UC6</td><td></td></tr><tr><td>סכין יהלום </td><td>דיאטומה</td><td>אולטרה 45 מעלות;</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אלקטרונים שידור </td><td>FEI</td><td>Tecnai G2</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad פריזמה תוכנה</td><td>GraphPad תוכנה, בע"</td><td></td><td></td></tr>מ <tr><td>תא תרבית פלדה תא עבור 24 מ"מ כיסוי</td><td>כלים ביו-מדעיים</td><td>CSC-25</td><td></td></tr><tr><td>רשתות מיקרוסקופיה אלקטרונית מיקרוסקופיה אלקטרונים</td><td>מדע</td><td>G300Cu</td><td></td></tr></tbody></table>

ויזואליזציה של תחומי משנה reticulum endoplasmic בתאים בתרבית

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

השומנים והחלבונים בתאי אוקריוטים הם החליפו ברציפות בין תאי תאים, אם כי אלה לשמור על ההרכב הייחודי שלהם ופונקציות למרות תנועת interorganelle המולקולרית האינטנסיבית. הטכניקות מתוארות במאמר זה הן אמצעי רב עוצמה של לימוד חלבון וניידות שומנים בדם וסחר in vivo ו בסביבה הפיזיולוגית שלהם. התאוששות הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) וירידה בקרינה בphotobleaching (פליפ) נמצאת בשימוש נרחב בטכניקות הדמיה לחיות תאים ללימוד סחר תאיים באמצעות מסלול Exo-endocytic,, לוקליזציה היווצרות של קומפלקסי חלבונים, והחלבונים ההמשכיות בין האברונים או subcompartments בmicrodomains שומנים בדם, אשר כולם יכולים להיות שנצפו בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. המגבלות של גישות אלו הן בעיקר כתוצאה מהשימוש בחלבוני היתוך ניאון, והחסרונות הפוטנציאליים שלהם כוללים artifactual מעל מפורשיון בתאים ואת האפשרות של הבדלים בקיפול והלוקליזציה של חלבונים מתויגים וילידים. לבסוף, כגבול של רזולוציה של מיקרוסקופיה אופטית (כ 200 ננומטר) אינו מאפשר חקירה של המבנה העדין של ER או subcompartments הספציפי שיכול לנבוע בתאים תחת לחץ (כלומר חוסר חמצן, מתן תרופה, ביטוי יתר של הטרנסממברני חלבוני תושב ER) או תחת מצבים פתולוגיים, אנו משלבים הדמיה לחיות תאים של תאי transfected תרבותיים עם ultrastructural ניתוחים הבוסס על מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים.

איור 2 מראה מחקר FRAP דוגמא לניידות חלבון. ניידות חלבון EGFP-ER ד של מודגמת על ידי התאוששות הקרינה המהירה לאחר photobleaching בOSERs המולבן. לניתוח כמוני, חצי מהזמן והחלק נייד נגזרו מנתונים שנמדדו באופן ניסיוני על ידי התאמת משוואת monoexponential הבאה: F (t) = F הודעה + (הודעה F rec-F) (1-e-t / τ) <p class="jove_content" style=";te...

אנו מתארים את גישות ההדמיה אנו משתמשים כדי לחקור את ההפצה וניידות של חלבוני ניאון transfected תושב בreticulum endoplasmic (ER) באמצעות confocal ההדמיה של תאי חיים. אנחנו גם ultrastructurally לנתח את ההשפעה של הביטוי שלהם על הארכיטקטורה של תא subcellular זה.

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לחקור כיצד חלבונים פלואורסצנטיים שעברו טרנספקציה מפוזרים ונעים ברשתית התוך-פלזמית (endoplasmic reticulum), ולהעריך את השפעת הביטוי על הארכיטקטורה העל-מבנית. לשם כך, תאים בתרבית עוברים טרנספקציה זמנית עם חלבונים תושבי ה-ER בעלי עיגון זנבי המסומנים ב-GFP. לאחר הטרנספקציה, מבוצע דימוי קונפוקאלי של תאים חיים כדי להעריך התאוששות פלואורסצנטית לאחר הלבנה פוטו-כימית (FRAP) ואובדן פלואורסצנציה.בבדיקת פוטובליצ'ינג (photobleaching) או פליפ (flip), מבוצע ניתוח אולטרה-מבני באמצעות מיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת. הנתונים המתקבלים מדגימים כי ביטוי של מבנה B five המסומן ב-GFP משנה באופן דרסטי את הארגון והמבנה של הרשת האנדופלזמית ומעורר יצירת אגרגטים. השיטה שאנו מדגימים כאן יכולה לספק תובנות לגבי תהליכים בסיסיים בביולוגיה של התא, כגון ניידות ותעבורה של חלבונים וליפידים.ניתן להשתמש בשיטה זו גם כדי לחקור תגובות לטיפולים פרמקולוגיים, להעריך חלבונים פלואורסצנטיים, מודרניזציה של אוליגו, או לחקור את תפקידם של חלבונים מוטנטיים פתוגניים בהיווצרות אגרגטים תוך-תאיים במקור שעשויים להיות רלוונטיים לפתוגניות שלהם, כגון בטרשת צדית ניוונית. הפלסמיד ששימש במחקר זה מורכב מגרסה משופרת של GFP המחוברת בקצה ה-C שלה לאזור הזנב של איזופורם er של cytochrome B five מחולדה, באמצעות רצף מקשר. אזור הזנב של B five מכיל את הרצף המלא שנותר קשור לממברנה לאחר עיכול על ידי trypsin.זה כולל את הדומיין הטרנס-ממברנלי בן 17 שאריות, המוקף ברצפים פולריים במעלה ובמורד הזרם. המקשר (linker) מורכב מהאפיטופ M ולאחריו GLY ארבעה S3. כל ה-CDNA מוחדר לאתרי Hindi three XO one של וקטור הביטוי היונקי PC DNA three. כהכנה לטרנספקציה, גדלו תאי cost seven ב-DMEM מועשר ב-37 °C וב-5% CO2; יום לפני הטרנספקציה, זרעו 3×10⁵ תאים על כיסויי זכוכית עגולים בקוטר 24 מילימטר בתוך פלטת 6 בארות ליום למחרת.בצע טרנספקציה לתאים באמצעות מערכת jet PEI כפי שמתואר על ידי היצרן כאן; נעשה שימוש ביחס של jet PEI ל-DNA של 2:1. דבר זה מוביל בדרך כלל ליעילות טרנספקציה של 70% עד 80%. שמור את התאים ב-37 °C ו-5% CO2 למשך 24 שעות לפני הצילום. לאחר מכן, השתמש בפינצטה כדי להעביר זכוכית כיסוי עם תאים שעברו טרנספקציה אל תא הצילום.החזירו את צלחת תרבית הרקמה לאינקובטור כדי לשמור על התאים הנותרים. לצורך אנליזה אולטרה-מבנית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני. לצורך דימוי תאים חיים, הוסיפו 2 mL של מדיום דימוי לתא תרבית תאים מפלדה.Xi Fluor נכלל במדיום הדימיוג כדי למנוע דהייה פוטוכימית (photobleaching) של הדגימות. יש לבצע את הניסויים בנוכחות smide, מעכב תרגום, כדי למנוע כל עלייה באות הפלואורסצנציה של A ובשלב זה בעליית הפלואורסצנציה הכוללת עקב ביוסינתזה של חלבונים. הנח את תא הדימיוג על משבתו של מיקרוסקופ קונפוקאלי, המצויד בדגרה עם בקרת טמפרטורה ו-CO2, ובלייזרים מתאימים עם הגדרות פוטו-מכפיל (photo multiplier) מתאימות לביצוע התאוששות פלואורסצנציה.לאחר הפוטובליצ'ינג (photobleaching) או הפריקה (frack), הגבירו את התאים למיקוד וקבעו את פרמטרי הרכישה כדי למנוע רוויה של פיקסלים. כמו כן, ודאו כי הספק הלייזר מוגדר לנמוך ככל האפשר כדי למנוע פוטובליצ'ינג עקב רכישת התמונה. ברגע שפרמטרי הדמיות נקבעו, עברו לשדה ראייה חדש המכיל שני תאים או יותר.תא אחד בכל שדה רכישה צריך להישאר ללא הבהרה, כדי שניתן יהיה להשתמש בו לנורמליזציה של האות הפלואורסצנטי של התא או התאים שהובהרו. לצורך ההבהרה, יש לסמן אזור עניין (ROI) המתאים לרשת אנדופלזמית חלקה מאורגנת (OSER).הגדירו את תוכנת ההדמיה לביצוע הלבנה (bleaching) באמצעות מספר איטרציות מתאים להלבנה פוטוכימית יעילה ומהירה. במידת הצורך, ניתן להשתמש בשילוב של לייזרים באורך גל של 488 nanometers ו-405 nanometer. הגדירו לתוכנה ללכוד פריים בודד בכל 10 seconds למשך 10 minutes לאורך כל מהלך הניסוי. הגדרה זו כוללת את תקופות הטרום-הלבנה (preble), ההלבנה וההתאוששות.לאחר שהכל מוכן, התחילו את ההבהרה (bleaching) והדגימה. כאשר הדגימה מסתיימת, עברו לשדה ראייה חדש וחזרו על תהליך זה. דגמו ארבעה עד חמישה שדות ראייה עבור כל כיסוי.החלק הלאה כדי למדוד איבוד פלואורסצנציה בבליaddEventListenerה פוטוכימית (photo bleaching) או בהיפוך. הגדר לתוכנה לבצע רצף של בליaddEventListenerה ודימוי לאחר בליaddEventListenerה למשך 10 שניות בכל 30 שניות למשך 10 דקות, ולאחר מכן לעבור לשדה ראייה חדש. סמן ROI המתאים למבנה OSER והתחל את הבליaddEventListenerה והלכידה כפי שבוצע קודם לכן לצורך ניתוח.ייבא את תמונות ה-frap וה-flip לתוכנת Image J. ראשית, העריך את התאוששות הפלואורסצנציה של ה-ROI שהולבנה לאורך זמן עבור ניסויי ה-frack, ולאחר מכן קבע את הפלואורסצנציית הרקע על ידי בחירת אזור מחוץ לתאים ומדוד את עוצמת הממוצע שלו לאורך זמן. לאחר מכן, החסר את אות הרקע מעוצמות הפלואורסצנציה של ה-ROIs.נרמלו את הנתונים אל מול הפלואורסצנציה הכוללת של התא המולבנן, שצריכה להישאר קבועה לאורך זמן. לאחר מכן, התאימו את המשוואה המונו-אקספוננציאלית המוצגת כאן, כאשר F post הוא אות הפלואורסצנציה לאחר הלבנה פוטו-כימית, F rec הוא ערך התאוששות הפלואורסצנציה המקסימלי שהושג לאחר ההלבנה, T הוא זמן הרישום הסופי, ו-tau הוא זמן אמצע הרישום.לניתוח ניסויי ה-flip, הגדירו ROI מחוץ ל-OSER שהולבנן, המכסה את התא כולו, ומדדו את עוצמת הפלואורסצנציה שלו לאורך זמן. כבניסויי frack, הפחיתו את הרקע באמצעות שטח מחוץ לתאים. נרמלו את הנתונים לרמות הפלואורסצנציה של ROI שהוגדר על תא שלא הולבנן, כדי לתקן עבור כל ירידה בפלואורסצנציה שנגרמה כתוצאה מהדמיה עצמה.לבסוף, שרטטו את התוצאות באמצעות GraphPad Prism או תוכנה דומה. רבים מהריאגנטים המשמשים להכנת הדגימות למיקרוסקופיה אלקטרונית הם רעילים. לכן, יש לבצע את השלבים הבאים תוך לבישת חלוק מעבדה וכפפות ועבודה תחת מ㠃 חוליות (fume hood).לאחר הסרת לביבת הזכוכית (cover slip) מבתרי הדש עבור מיקרוסקופיה אופטית, קבעו (fix) את התאים שנותרו שגדלו על תחתית הדש כשכבה אחת (monolayer) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, בעזרת מגרדת טפלון, נתקו את התאים והעבירו אותם למבחנות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 milliliter; השקיפו את התאים באמצעות צנטריפוגציה ב-9,000 ×g למשך 10 דקות. הסִירו את העלייה (supernatant), הוסיפו מקבע טרי והשאירו למשך הלילה ב-4 °C עד למחרת.שטפו את המשקעים על ידי שאיבה עדינה של המקבע באמצעות פסט-פיפט והוספת באפר Cate. כדי למנוע פגיעה במשקע, אפשרו לבאפר להחליק במורד הדופן הפנימית של המבחנה בעת הוספתו. שאבו את תמיסת השטיפה ובצעו קיבוע לאחר מכן (post fix) על ידי הוספת התאים לתמיסה של 1% Osmium tetroxide בבאפר Cate למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.בשלב הבא, שטפו במים מסוג Milli Q והוסיפו תמיסת 1% urinal acetate במים מזוקקים ישירות לנבוב המיקרו-צנטריפוגה. בצעו שחרור של הצביעה (unblock) למשך 20 דקות עד שעה, ובצעו דהידרציה לדגימות בסדרה עולה של אתנול בריכוזים של 70%, 80%, 90%, 100% ופעם נוספת 100% למשך 10 דקות בכל שלב. לאחר מכן, שטפו את המשקעים פעמיים ב-propylene oxide למשך 15 דקות בכל פעם.בצעו חדירה של הדגימות על ידי החלפת ה-propylene oxide בתערובת ביחס של אחד לאחד של propylene oxide ו-epon; הדגירו למשך שעתיים לפחות ועד ללילה שלם. לאחר מכן, כדי להטמיע את הדגימות, הניחו את חלקי משקע התאים בתבניות הטמעה הממולאות מראש בשרף אפוקסי epon; המתינו להקשחה בטמפרטורה של 60 °C למשך 24 שעות לפחות. למחרת, רכבו את בלוק השרף על ultra microtome המצויד בסכין יהלום של 45 מעלות.בעזרת סכין קיצוץ, קצצו ידנית את בלוקי השרף כדי להסיר את חלקי הבלוק שבהם הדגימה המוטמעת אינה נמצאת. לאחר מכן, באמצעות אולטרה-מיקרוטום, השגיחו חתכים בעובי של 60 עד 70 ננומטר. אספו את החתכים על רשתות נחושת בדרגת דחיסות של 300 mesh לצורך צביעת החתכים.הנח את הרשתות על טיפות של 30 µL של תמיסה רוויה של uranyl acetate, והדגר למשך 20 דקות. לאחר מכן, שטוף שלוש פעמים במים מזוקקים (milli Q) והדגר שוב את הרשתות על טיפות קטנות של lead citrate למשך שבע דקות. לאחר ההדגרה, שטוף את הרשתות ביסודיות על ידי טבילה במים מזוקקים (milli Q) והשאר אותן להתייבש בטמפרטורת החדר.יש לבחון את הרשתות הצבועות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני חודר (TEM) וללכוד תמונות באמצעות מצלמת CCD מותקנת בתחתית בהגדלה סופית, הנעה בין 6,000 ל-39,000 x, כדי לחקור דיפוזיה לטראלית של D-E-G-F-P ER ברשת אנדופלזמית חלקה ומאורגנת. שבעה תאים משלוש כיסויות זכוכית שעברו טרנספקציה זמנית נותחו בשיטת FRAP כפי שמתואר בסרטון זה; כפי שמוצג ברצף ה-time-lapse, שני מבני OSER הולבנו והתאוששות הפלואורסצנציה תועדה לאורך זמן. התאוששות ברורה של הפלואורסצנציה זוהתה דקה אחת לאחר ההלבנה, עם עלייה נוספת באות ארבע דקות מאוחר יותר, כדי לקבוע את זמן מחצית ההתאוששות ולכמת את הפרקציה הניידת של D-E-G-F-P-E-R.התמונות שנלכדו נותחו כפי שמתואר בסרטון זה, כפי שניתן לראות כאן. עוצמת הפלואורסצנציה של האזור שהולבנה עלתה עם הזמן, מה שמעיד על כך שהחלבון הפלואורסצנטי נייד מאוד בתוך האגרגטים. כדי לבחון את הרציפות בין תתי-מתחמים שונים של הרשתית האנדופלזמית, בוצעו ניסויי flip כפי שמוצג ברצף ה-time lapse זה.ההבהרה (bleaching) הרציפה של OSER, המסומן כאן על ידי החץ הצהוב, גורמת לירידה הדרגתית בפלואורסצנציה בשאר ה-ER ובמבני OSER אחרים בתוך אותו התא. החץ האדום מצביע על חלק מתא שלא עבר הבהרה, שבו האות הפלואורסצנטי קבוע לאורך זמן. ניתוח כמותי של נתונים אלו חשף התרוקנות הדרגתית ומהירה של ה-ER הרשתי, מה שמוכיח כי האגרגטים מחוברים פיזית לשאר ה-ER. כדי לבחון את הארכיטקטורה העדינה של אגרגטים אלו, נצפו תאים המבטאים רמות גבוהות של D-E-G-F-P ER באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים חודר (TEM).מיקרוגרפ זה מציג תצוגה בהגדלה נמוכה של ציטופלזמה של תא המכילה אגרגט של ממברנות. האגרגט מורכב ממחסניות cyi וממברנות סינוסואידליות גליות, כפי שניתן לראות כאן.ניתן לראות מיטוכונדריה מצטברות סביב מבני ה-OSER, בעוד שריבוזומים, המסומנים בחצי חצים, מעטרים רק את הממברנות של ה-cyi החיצוני ביותר. שימו לב כי המרווח הצפוף לאלקטרונים בעובי 11 nanometer בין הממברנות הוא רציף עם הציטופלזמה. OS ER עשוי להיווצר על ידי er למלרי, שהם ערמות של cyi של er שטוחים שיכולים להיראות רציפים או מקוטעים בחתכים דקים; לעיתים ניתן להבחין בבעבוע של וסיקולות מהקיסטרנה החיצונית ביותר של הערמה, כפי שמוצג כאן.בסיכומה, נתונים אלה מדגימים כי האגרגטים הפלואורסצנטיים שנצפו בתאים שעברו טרנספקציה עם D-E-G-F-P ER מייצגים אזורים של er steri חלקים ושטוחים, המארגנים את עצמם מרחבית לגאומטריות תלת-ממדיות מוגדרות היטב. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לרכוש את כל התמונות ללא פיקסלים רוויים, שכן אלה עלולים לשנות את ההתאוששות הפלואורסצנטית ובעקבות זאת את ניתוח ניידות החלבון. יש לוודא תמיד כי סיגנל הפלואורסצנציה באזור העניין (ROI) שעבר הבהרה (bleach) מנורמל ביחס לפלואורסצנציה הכוללת של אותו תא, וזאת כדי לקחת בחשבון שינויים בעוצמת הפלואורסצנציה כתוצאה מהבהרה במהלך רכישת התמונות או שינויים קלים במישור המיקוד.

visualization-of-endoplasmic-reticulum-subdomains-in-cultured-cells

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מתארים שיטה לדמיין mRNAs endoplasmic reticulum הקשורים בתאי תרבית רקמת יונקים. טכניקה זו כרוכה permeabilization סלקטיבית של קרום הפלזמה עם digitonin להסיר תוכן cytoplasmic אחרי...

ויזואליזציה של mRNAs לוקליזציה reticulum endoplasmic בתאי יונקים

אנדוציטוזיס בתיווך קלת'רין, תהליך מהיר ודינמי ביותר שמפנים חלבונים רבים, כולל קולטני איתות. הפרוטוקול המתואר כאן מדמיין ישירות את הקינטיקה של אירועים אנדוציטיים בודדים. זה חיוני להבנת האופן שבו חברי הליבה של המנגנון האנדוציטי מתאמים זה עם זה, וכיצד מטען החלבון משפיע על תהליך זה.

חזותי אנדוציטוזה בתיווך clathrin של רצפטורים מצמידים חלבון G בהחלטה חד אירוע באמצעות TIRF מיקרוסקופית

כאן, אנו מתארים הליך לחזות ולכמת עם רגישות גבוהה האינטראקציות אנדוגני בין הרטיקולום ואת המיטוכונדריה endoplasmic בתאים קבוע. הפרוטוקול כולל אופטימיזציה assay קשירת הקרבה באתרו מיקוד אינוסיטול 1,4,5-אדנוזין קולטן / גלוקוז מוסדר חלבון 75 / ערוץ אניון תלוי מתח / cyclophilin D מורכבים על ממשק הקרום קשור המיטוכונדריה.

לחקר endoplasmic reticulum ואת המיטוכונדריה אינטראקציות על ידי<em&gt; באתרו</em&gt; Assay קשירת הסמיכות בתאים קבועים

תיוג תחום תאי של חלבון הממברנה עם fluorophore pH רגיש, superecliptic pHluorin (ספטמבר), מאפשר לוקליזציה, ביטוי subcellular, וסחר שייקבע. הדמיה ספטמבר- שכותרתו חלבונים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימית מוחלטת (TIRFM) מאפשרת כימות של רמות חלבון בקרום ER ו פלזמה הפריפריה.

ניצול רצפטורים-tagged pHluorin לפקח subcellular לוקליזציה וסחר

אנו מציגים פרוטוקול כדי ללמוד את התפלגות המיטוסקופיה ורשתית העין בתאים שלמים לאחר שינוי גנטי באמצעות מיקרוסקופ האור והנפח האלקטרונים כולל ascorbate peroxidase 2 ו לחזרת peroxidase צביעת, שינוי סדרתי של תאים עם ובלי גן היעד באותו מקטע, והדמיה טורית דרך אלקטרון מיקרוסקופ.

הדמיה של מיקרוסקופיה ואנדופלזמית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים באור ונפח

פרוטוקול זה מתאר את שיטת ה-קריואיפקס, בה חלבון ממברנה APEX2 מתויג יכול להיות מקומי על ידי שידור אלקטרון מיקרוסקופ בתוך מבנה מיטבי משומר התא.

שיטת ה-קריואיפקס לניתוח מיקרוסקופ אלקטרוני של לוקליזציה של חלבון ממברנה בתוך תאים שהשתמרו באופן מבנית

פרוטוקול פשוט ומקיף לרכישת פרטים תלת מימדיים של אתרי מגע ממברנה בין אברונים בהפטוציטים מהכבד או תאים ברקמות אחרות.

אפיון תלת מימדי של אתרי מגע בין-אורגניים בהפטוציטים באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים חתך טורי

הצורך בגישות חדשות לחקר אתרי מגע עם ממברנות (MCS) גדל עקב העניין הגובר בחקר מבנים תאיים אלה ומרכיביהם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המשלב טכנולוגיות מיקרוסקופיה שהיו זמינות בעבר כדי לזהות ולכמת קומפלקסים של חלבונים תוך-אברונים ובין אברונים השוכנים ב-MCS.

ויזואליזציה וכימות של אינטראקציות חלבון תוך-אברוני אנדוגניות באתרי קשר של ER-מיטוכונדריה על ידי מבחני קשירת קרבה

טומוגרפיה Cryo-STEM מספקת אמצעי לדמיין אברונים של תאים שלמים ללא הטבעה, חתך או תכשירים פולשניים אחרים. הרזולוציה התלת-ממדית המתקבלת נמצאת כיום בטווח של ננומטרים בודדים, עם שדה ראייה של מספר מיקרומטרים ועובי נגיש בסדר גודל של 1 מיקרומטר.

הדמיה של אברונים באתרם על ידי טומוגרפיה Cryo-STEM

קביעת מספר התאים בתרבית חשוב סטנדרטיזציה של תנאים התרבות בביצוע ניסויים quantitation מדויק. בסרטון זה אנו מדגימים כיצד תאים נספרים באמצעות hemacytometer.

ספירת ועל קביעת הכדאיות של תאים בתרבית

חקור את התפלגות ותנועת חלבונים פלואורסצנטיים ברטיקולום האנדופלזמי בתאים בתרבית באמצעות מיקרוסקופיית קונפוקל חיה ו-FRAP. השיטה מאפשרת ניתוח מבנה אולטרה-מבני ודינמיקה תאית.

ויזואליזציה של תחומי משנה reticulum endoplasmic בתאים בתרבית

גלה סרטונים נוספים