מיקרוסקופיה אופטית כמותי: מדידה נייד Biophysical תכונות עם תקן מיקרוסקופ אופטי

המטרה הכוללת של הליך זה היא לכמת תכונות פיזיקליות בסיסיות של דגימות תאיות, כולל מסה ונפח, עם מיקרוסקופ אופטי סטנדרטי ועיבוד תמונה. זה מושג על ידי הרכבה ראשונה של דגימות סלולריות הגדלות על החלקות כיסוי זכוכית על שקופיות מיקרוסקופ. לאחר מכן, באמצעות מיקוד מתקבלות תמונות ניגודיות של שדה בהיר והפרעות דיפרנציאליות.

לאחר מכן כל ערימת Z של תמונות מוזנת לתוכניות עיבוד תמונה נפרדות של MATLAB המחלצות את הנתונים הפיזיים. בסופו של דבר, התכונות הפיזיקליות הבסיסיות של דגימות תאיות מתקבלות באמצעות מדידות עוצמת מיקוד, תחת ניגודיות שדה בהיר ומיקרוסקופ ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, הוא שדגימות תאיות אינן צריכות להיות קבועות, לחלחל או לצבוע.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של התא, כגון כיצד מאורגנת צפיפות תת-תאית במהלך מחזור התא או בקרב אוכלוסיות תאים שונות התורמות למצב מחלה באמצעות מיקרוסקופ בעל יכולות DIC ו-brightfield ומפרטים נוספים בהתאם לפרוטוקול הטקסט התחל בפתיחת תוכנת ספר שקופיות ויצירת שקופית חדשה לאיסוף תמונות. לאחר מכן, פתח את חלון המיקוד ותחת קטע ערכת המסננים בחר DIC בכרטיסיית ההיקף תחת קטע הקבל, כוונן את פס ההחלקה של הצמצם למיקום הימני הרחוק ביותר. זה מספק תאורת צמצם מספרית גבוהה ומשפר את החיתוך האופטי של הדגימה.

לאחר לכידת ערימת DIC של הדגימה, פתח את חלון המיקוד ובחר פתח. מתחת לקטע ערכת המסננים, כוונן את פס ההחלקה של הצמצם למצב השמאלי הרחוק ביותר סגור עד הסוף כדי לספק תאורת NA נמוכה. לאחר התאמת עוצמת האות, פתח את חלון לכידת התמונה.

הגדרות לכידת התלת מימד מרכישת מחסנית DICZ יוצגו בקטע ערכת המסננים של חלון לכידת התמונה. סמן את התיבה הפתוחה וציין זמן חשיפה. בקטע פרטי התמונה, תן שם לתמונה ובחר התחל כדי להתחיל רכישת תמונות Zack.

לאחר מכן ייצא את ערימות ה-Z לפי פרוטוקול הטקסט כדי לבצע מדידות נפח פעם אחת בתוכנית H-T-D-I-C MATLAB בשם JoVE HT DCO V one M תחת סעיף אפס, עדכן את משתנה ספריית התלות על ידי העתקה והדבקה של הספרייה המכילה את הילברט. שנו קובצי DM ו-sobel edge Detect M מהסייר. בין המרכאות הבודדות הבאות ספריית התלות שווה לביצוע סעיף אפס של תוכנית joco HT DCO V one M.

בסעיף הראשון, עדכן את ספריית התמונות על ידי העתקה והדבקה של הספרייה המכילה את תמונות המיקוד בצורת TIF נקודה. בין המרכאות הבודדות הפעל את החלק הזה רק פעם אחת כדי ליישר ולסובב תמונות. עבור התמרת הילברט הפעל את החלק השני של הקוד תופיע תיבת דו-שיח שכותרתה הגדרת פרמטרים של HT DIC.

לאחר מכן הזן את מספר מישור המוקד שבו תמונת ה-DIC של הדגימה נמצאת במוקד, הרזולוציה הרוחבית, הרזולוציה הצירית, זווית הסיבוב של תמונת ה-DIC הדרושה לביצוע התמרת הילברט, ולבסוף, גודל אזור העניין. לאחר מכן לחץ על אישור. תמונה של מישור המוקד של DIC שצוין על ידי מספר מישור המוקד תופיע עם תיבה כחולה.

מקם את התיבה מעל התכונה המעניינת, כגון תא. לאחר שהתיבה הוצבה מעל האזור הרצוי, לחץ פעמיים בתוך ה-B.הניגודיות של התמונה צריכה להיות כזו שתכונות כהות מופיעות משמאל ואילו תכונות בהירות מופיעות בצד ימין. גרור את התיבה הכחולה מעל אזור העניין ושנה את הצורה בהתאם לצורך.

לאחר מכן, תחת סעיף שלוש, כדי ליצור מסיכה מלבנית, בטל את שורת ההערה 1 6 7 ושורת ההערה 1 7 0 בצע את החלק השלישי של התוכנית על ידי לחיצה על התמונה וגרירת העכבר כדי להתחיל להגדיר את המסיכה המלבנית. לאחר מכן לחץ פעמיים על התיבה כדי לקבל אותה. כדי ליצור מסיכה מצויירת ביד, הערה שורה 1 6 7 ובטל הערה שורה 1 7 0 לפני ביצוע סעיף 3 על ידי לחיצה וציור המסכה הרצויה עם העכבר, לחץ פעמיים על המסכה כדי לקבל אותה לאחר הפעלת סעיף 4, כדי לבנות ערימות תמונות שעברו טרנספורמציה של הילברט בהתאם לפרוטוקול הטקסט מריץ את סעיף 5.

כדי למטב את פילוח התמונה של תמונות חתך xz של אזור העניין. איור 500 המופק על ידי התוכנית מופיע ומציג שלושה סוגים שונים של ניגודיות. הצלחת האלגוריתם למצוא את גבולות התא תלויה בשילוב של המסכה המשמשת וערך הסף בשורה 2, 2, 9 של התוכנית להתחיל בערך של 0.5 ולהתאים את ערך הסף ולהפעיל מחדש חלק זה של התוכנית עד להשגת המתאר הנכון באחת העמודות.

אם החלוקה לרמות הייתה הטובה ביותר בעמודה הראשונה, בפילוח DIC, השתמש בסעיף שש כדי לקבוע את עוצמת הקול. אם העמודה השנייה נתנה תוצאות אופטימליות, הפעל את סעיף 7 כדי לקבוע את נפח התא מהילברט, שנה תמונות DIC אם העמודה השלישית נתנה את התוצאות האופטימליות, השתמש בתמונות DIC של הילברט המסוננות תוך כדי הפעלת קטע שמונה כדי לקבוע נפח לביצוע מדידות מסה בתוכנית NIQ PM MATLAB וכותרתו JO VCO NI qpm V1 M תחת סעיף אפס. עדכן את המיקום של שלושת התלות בספריות, ספריית BRIGHTFIELD ו-DIC לאחר הפעלת קטע ראשון, הפעל את החלק השני בתיבת הדו-שיח שכותרתה הגדר פרמטרים של N-I-Q-P-M הזן את מספר מישור המוקד שבו תמונת השדה הבהיר של הדגימה נמצאת במוקד, הרזולוציה הרוחבית, הרזולוציה הצירית וגודל אזור העניין.

לאחר מכן לחץ על אישור. תמונה של מישור המוקד של השדה הבהיר שצוין על ידי מספר מישור המוקד תופיע עם תיבה כחולה. לאחר התאמת המיקוד במידת הצורך על ידי הפעלה מחדש של החלק השני, גרור את התיבה סביב התמונה ובחר את הצמתים של התיבה וגרור אותה כדי לשנות את גודלה לפני לחיצה כפולה בתוך התיבה כדי לקבל אותה.

לאחר שנבנתה ערימה של תמונות שדה בהיר על ידי הפעלת קטע שלוש, הפעל את קטע ארבע כדי ליצור את מפת הפאזה, תמונות DIC פסאודו והשוואות לתמונות שדה בהיר ותמונת ה-DIC האמיתית כאשר תמונות ה-DIC הפסאודו-ו-DIC האמיתיות דומות ככל האפשר, הפעל את קטע חמש A או חמש B המאפשר למשתמש לשרטט את התא כדי ליצור את מפת צפיפות המסה, המסה הכוללת וההיסטוגרמה של צפיפות התא נכונים. תאורה לדוגמה במהלך רכישת תמונה ממוקדת היא קריטית למימוש מוצלח של אלגוריתם N-I-Q-P-M ו-H-T-D-I-C. איור זה ממחיש תאורת NA נמוכה וגבוהה הן תחת ניגודיות DIC והן תחת ניגודיות שדה בהיר עבור כדור פוליסטירן וקו תאי אדנוקרצינומה של המעי הגס האנושי SW 6 20.

לוחות אלה מדגימים הדמיה אופטימלית עבור N-I-Q-P-M ואלה מציגים הדמיה אופטימלית עבור HT DIC. תמונות אלה מדגימות את תלות הפרמטרים של אלגוריתם NIQ PM המדגישות יישומים מוצלחים ולא מוצלחים כאחד. כאן אנו בוחנים את פרופיל הפאזה של כדור פוליסטירן בקוטר 4.8 מיקרומטר.

הפרופיל הצפוי ידוע תיאורטית ולכן ניתן להשוות אותו ישירות לשחזור NIQ PM. לוחות אלה מציגים את השחזור הטוב ביותר שניתן להשיג עבור אפקטי עקיפה של הכדור הן בגבולות הכדור והן בתוכו מונעים שחזור יציב בכל הנקודות על הכדור. ניתן ללכוד את האזור המרכזי של הכדור עם N-I-Q-P-M עם אחוז שגיאה של 1 עד 5% כפי שניתן לראות בדגימות סלולריות של פאנל L שתכונות הפאזה שלהן אינן ידועות.

ניתן לשחזר אפריורי באמצעות NIQ PMM בשילוב עם הליך להשוואת תמונת DIC פסאודו לתמונת DIC אמיתית. ל- N-I-Q-P-M יש פרמטר חופשי אחד. המישור בערימת תמונות השדה הימני שבו ממורכז החישוב.

יש לכוונן את מישור המוקד המרכזי הזה עד שתמונות ה-DIC המדומות וה-DIC האמיתיות ייראו דומות ככל האפשר. מוצגות כאן תמונת פסאודו DIC לא ממוקדת, תמונת פסאודו DIC אופטימלית ותמונת ה-DIC המתאימה של התא שצולמה עם NA תאורה של 0.9. מעניין שמפת הפאזה הטובה ביותר ותמונת הפסאודו-DIC המתאימה אינן תואמות בהכרח לתמונת שדה בהיר ממוקדת כפי שמוצג בפאנלים אלה.

לבסוף, מוצגים כאן השלבים הכרוכים באלגוריתם עיבוד התמונה H-T-D-I-C מה-DIC דרך תמונות מיקוד תחת NA שווה ל-0.9 תאורה, טרנספורמציה של הילברט מתבצעת כדי להסיר את תבליט הבסיס של תמונות ה-DIC. זה מגיע עם טשטוש מסוים לאורך הציר האופטי שניתן להסיר מסינון פורר מעבר גבוה. תמונות סופיות אלה מפולחות בקלות כדי לקבוע את השטח בכל מישור חתך של הדגימה כדי להסיק את הנפח הסלולרי הכולל.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור את התאורה הנכונה להדמיית ניגודיות דיפרנציאלית של עפרות בהירות לאחר הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מיקרוסקופיה פלואורסצנטית על מנת לענות על שאלות נוספות באמצעות לוקליזציה של כוח הרצפה עם מפות צפיפות של הדגימה.