מיקרוסקופיה אופטית כמותי: מדידה נייד Biophysical תכונות עם תקן מיקרוסקופ אופטי

המטרה הכללית של הליך זה היא לכמת מאפיינים פיזיקליים בסיסיים של דגימות תאיות, כולל מסה ונפח, באמצעות מיקרוסקופ אופטי סטנדרטי ועיבוד תמונות. הדבר משיג תחילה על ידי העמדת דגימות תאיות שגדלו על לוחות כיסוי זכוכית על גבי סנניות מיקרוסקופ. לאחר מכן, מתקבלות תמונות במיקוד שונה (through focus) בשיטות של שדה בהיר (brightfield) וניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC).

לאחר מכן, כל ערימת תמונות Z stack מוזנת לתוכניות נפרדות לעיבוד תמונות ב-MATLAB השולפות את הנתונים הפיזיקליים. בסופו של דבר, התכונות הפיזיקליות הבסיסיות של דגימות תאיות מתקבלות באמצעות מדידות עוצמה במיקוד משתנה (through focus), תחת מיקרוסקופיה בניגוד שדה (brightfield contrast) ומיקרוסקופיית ניגוד התאבכות דיפרנציאלית (differential interference contrast). היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מיקרוסקופיית פלואורסצנציה, הוא שאין צורך בקיבוע, חדירה (permeation) או צביעה של הדגימות התאיות.

שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של התא, כגון האופן שבו הצפיפות התת-תאית מאורגנת במהלך מחזור התא או בין אוכלוסיות תאים שונות התורמות למצב מחלה. באמצעות מיקרוסקופ בעל יכולות DIC וגם שדה בהיר (brightfield) ומפרטים נוספים בהתאם לפרוטוקול הכתוב, התחילו בפתיחת תוכנת ה-slide book וצרו שקף חדש לאיסוף תמונות. לאחר מכן, פתחו את חלון המיקוד (focus window) ותחת סעיף הגדרת המסנן (filter set) בחרו ב-DIC. בלשונית ה-scope, תחת סעיף המעבה (condenser), כוון את סרגל הצמצם (aperture slide bar) למצב הימני ביותר. פעולה זו מספקת תאורה בעלת מפתח מספרי (numerical aperture) גבוהה ומשפרת את החיתוך האופטי של הדגימה.

לאחר לכידת סדרת תמונות DIC של הדגימה, פתחו את חלון המיקוד ובחרו ב-open. תחת סעיף הגדרות המסנן, העבירו את סרגל הצמצם למצב השמאלי ביותר (סגור לחלוטין) כדי לספק תאורה ב-NA נמוך. לאחר התאמת עוצמת האות, פתחו את חלון לכידת התמונה.

הגדרות הלכידה התלת-ממדית מרכישת ה-DICZ stack יוצגו בחלק של מערכת הפילטרים בחלון לכידת התמונה. סמנו את תיבת הסימון וקבעו את זמן החשיפה. בחלק של מידע התמונה, תנו שם לתמונה ובחרו ב-start כדי להתחיל ברכישת תמונת Zack.

לאחר מכן, ייצאו את ה-Z stacks בהתאם לפרוטוקול הכתוב כדי לבצע מדידות נפח בתוכנית ה-MATLAB מסוג H-T-D-I-C שנקראת JoVE HT DCO V one M. תחת סעיף zero, עדכנו את המשתנה dependencies directory על ידי העתקה והדבקה של הנתיב למסמך המכיל את הקבצים hilbert. Transform DM ו-sobel edge Detect M מה-explorer. בתוך הגרש הבודדים המופיעים לאחר dependencies directory =, הריצו את סעיף zero של תוכנית ה-joco HT DCO V one M.

בסעיף הראשון, עדכנו את ספריית התמונות על ידי העתקה והדבקה של הספריה המכילה את תמונות ה-through focus בפורמט dot TIF. בתוך הגרש הבודדים, הריצו סעיף זה פעם אחת בלבד כדי ליישר ולסובב את התמונות. עבור התמרת הילברט (hilbert transform), הריצו את סעיף שתיים של הקוד. תופיע תיבת דו-שיח בשם Define HT DIC parameters.

לאחר מכן, הזינו את מספר מישור המוקד שבו תמונת ה-DIC של הדגימה נמצאת במיקוד, את הרזולוציה הלטרלית, את הרזולוציה האקסיאלית, את זווית הסיבוב של תמונת ה-DIC הדרושה לביצוע התמרת הילברט, ולבסוף, את גודל אזור העניין (ROI). לאחר מכן לחצו על Okay. תמונת מישור המוקד של ה-DIC שצוינה לפי מספר מישור המוקד תופיע עם תיבה כחולה.

מקמו את התיבה מעל המאפיין המעניין, כגון תא. לאחר שהתיבה ממוקמת מעל האזור הרצוי, לחצו פעמיים בתוך ה-B. הניגודיות של התמונה צריכה להיות כזו שמאפיינים כהים יופיעו משמאל בעוד שמאפיינים בהירים יופיעו מימין. גררו את התיבה הכחולה מעל האזור המעניין ושנו את צורתה במידת הצורך.

בשלב הבא, תחת סעיף שלוש, כדי ליצור מסכה מלבנית, הסירו את סימן ההערה משורה 167 והוסיפו סימן הערה לשורה 170. הפעילו את סעיף שלוש של התוכנית על ידי לחיצה על התמונה וגרירת העכבר כדי להתחיל בהגדרת המסכה המלבנית. לאחר מכן, לחצו פעמיים על התיבה כדי לאשר אותה. כדי ליצור מסכה בשרטוט ידני, הוסיפו סימן הערה לשורה 167 והסירו את סימן ההערה משורה 170 לפני הפעלת סעיף שלוש. על ידי לחיצה ושרטוט של המסכה הרצויה באמצעות העכבר, לחצו פעמיים על המסכה כדי לאשר אותה. לאחר הרצת סעיף ארבע, כדי לבנות ערימות תמונות שעברו התמרת הילברט (hilbert transformed) בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הפעילו את סעיף חמש.

כדי למטב את סגמנטציית התמונה של תמונות החתך הרוחבי xz של אזור העניין. תמונה 500 המופקת על ידי התוכנית מציגה שלושה סוגים שונים של ניגודיות. הצלחת האלגוריתם במציאת גבולות התא תלויה בשילוב של המסכה שבה נעשה שימוש ובערך הסף בשורה 2, 2, 9 של התוכנית; התחילו בערך של 0.5, כווננו את ערך הסף והריצו שוב חלק זה של התוכנית עד להשגת התוואית הנכונה באחת מהעמודות.

אם תיחום המתאר היה הטוב ביותר בעמודה אחת, בסגמנטציית DIC, השתמשו בסעיף שש כדי לקבוע את הנפח. אם עמודה שתיים סיפקה תוצאות אופטימליות, הריצו את סעיף שבעה כדי לקבוע את נפח התא מתוך hilbert; המירו דימות DIC. אם עמודה שלוש סיפקה את התוצאות האופטימליות, השתמשו בדימות DIC עם התמרת hilbert שעברה סינון forer בזמן הרצת סעיף שמונה כדי לקבוע את הנפח לצורך מדידות מס בתוכנת NIQ PM MATLAB ובקובץ שכותרתו JO VCO NI qpm V1 M תחת סעיף אפס. עדכנו את המיקום של שלוש התשויות של הספריות, ספריית BRIGHTFIELD וספריית DIC. לאחר הרצת סעיף אחד, הריצו את סעיף שני; בתיבת הדיאלוג שכותרתה define N-I-Q-P-M parameters, הזינו את מספר מישור המיקוד שבו תמונת השדה המואר (bright field) של הדגימה נמצאת במיקוד, את הרזולוציה הלטרלית, את הרזולוציה האקסיאלית ואת גודל אזור העניין (region of interest).

לאחר מכן לחצו על אישור (Okay). תמונה של מישור המוקד בשיטת שדה בהיר (brightfield), כפי שהוגדר על ידי מספר מישור המוקד, תופיע עם תיבה כחולה. לאחר כיוון הפוקוס במידת הצורך על ידי הרצה חוזרת של סעיף שתיים, גררו את התיבה על פני התמונה, בחרו את נקודות הקצה של התיבה וגררו אותן כדי לשנות את גודלה, לפני לחיצה כפולה בתוך התיבה כדי לאשר אותה.

לאחר שבניית סדרת תמונות בשדה בהיר (brightfield) הושלמה על ידי הרצת חלק שלושה, הרץ את חלק ארבעה כדי להפיק את מפת הפאזה, תמונות pseudo DIC והשוואות לתמונות השדה הבהיר ולתמונת ה-DIC המקורית. כאשר תמונות ה-pseudo DIC וה-DIC המקורית דומות ככל האפשר, הרץ את חלק חמש א' או חמש ב', המאפשר למשתמש להקיף את התא כדי להפיק את מפת צפיפות המסה, את המסה הכוללת ואת ההיסטוגרמה של צפיפות התא בצורה נכונה. תאורה מדגמית במהלך רכישת תמונות במיקוד משתנה (through focus) היא קריטית ליישום מוצלח של אלגוריתם ה-N-I-Q-P-M וה-H-T-D-I-C. איור זה מדגים תאורה ב-NA נמוך וגבוה תחת ניגודיות DIC ושדה בהיר עבור כדור פוליסטירן ומערך תאי אדנוקרצינומה של המעי הגס האנושי SW six 20.

לוחות אלו מדגימים דמיוּן אופטימלי עבור N-I-Q-P-M ואלו מציגים דמיוּן אופטימלי עבור HT DIC. תמונות אלו מדגימות את התלות בפרמטרים של אלגוריתם ה-NIQ PM, תוך הדגשת יישומים מוצלחים ובלתי מוצלחים. כאן אנו בוחנים את פרופיל הפאזה של כדור פוליסטרין בעוביית 4.8 micrometer.

הפרופיל הצפוי ידוע תיאורטית ולכן ניתן להשוואתו ישירות לשחזור ה-NIQ PM. פנלים אלו מציגים את השחזור הטוב ביותר שניתן להשיג עבור אפקטי עקיפה של הכדור, כאשר הן בגבולות הכדור והן בתוכו הם מונעים שחזור יציב בכל נקודות הכדור. ניתן ללכוד את האזור המרכזי של הכדור באמצעות N-I-Q-P-M עם אחוז שגיאה של 1% עד 5%, כפי שניתן לראות בפאנל L, עבור דגימות תאיות שתכונות הפאזה שלהן אינן ידועות.

ניתן לשחזר a priori באמצעות NIQ PMM בשילוב עם פרוצדורה להשוואה בין תמונת pseudo DIC לבין תמונת DIC ממשית. ל-N-I-Q-P-M יש פרמטר חופשי אחד: המישור בערימת תמונות השדה הימני שבו מרוכז החישוב.

יש לכוון את מישור המוקד המרכזי עד שתמונות ה-pseudo DIC ותמונות ה-DIC האמיתיות ייראו דומות ככל האפשר. מוצגות כאן תמונת pseudo DIC מחוץ למוקד, תמונת pseudo DIC אופטימלית ותמונת DIC תואמת של התא שצולמה עם NA של התאורה בערך 0.9. באופן מעניין, מפת הפאזה הטובה ביותר ותמונת ה-pseudo DIC התואמת לה אינן בהכרח תואמות לתמונת שדה בהיר (bright field) שנמצאת במוקד, כפי שמוצג בלוחות אלו.

לבסוף, מוצגים כאן השלבים המעורבים באלגוריתם עיבוד התמונות H-T-D-I-C מתוך תמונות DIC דרך מיקוד (through focus) תחת תאורה של NA equals 0.9; מבוצעת התמרת הילברט (hilbert transform) כדי להסיר את תבליט הבסיס של תמונות ה-DIC. שלב זה מלווה בטשטוש מסוים לאורך הציר האופטי שניתן להסיר באמצעות סינון מעביר גבוה (high pass filter). ניתן לבצע סגמנטציה בקלות לתמונות סופיות אלו כדי לקבוע את השטח בכל מישור חתך של הדגימה, לצורך הסקת נפח התא הכולל.

בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור את התאורה הנכונה עבור הדמיית שדה בהיר (brightfield) או ניגודיות דיפרנציאלית (differential contrast) לאחר ביצוע הפרוטוקול. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, על מנת להשיב על שאלות נוספות באמצעות קולוקליזציה (colocalization) של כוחות הרצפה עם מפות צפיפות של הדגימה.