Name: זיהוי של subpopulation מועשר Murine Erythroblast באירועי Enucleating ידי Multi-רפאים הדמיה תזרים cytometry (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: למדו לזהות אירועי enucleation באריתרובלסטים אורתוכרומטיים מעכברים באמצעות ציטומטריית זרימה עם הדמיה מולטי-ספקטרלית. שיטה זו מאפשרת ניתוח מפורט של תהליך ההבשלה האריתרואידית והבנת מנגנונים מולקולריים בדם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים זרימת מחקר Cytometry Core בבית החולים לקרן המחקר לילדים בסינסינטי וריצ&#39;רד דימרקו, Sherree חבר, וסקוט מרדכי מחברת Amnis (חלק מEMD Milllipore) לקבלת תמיכה טכנית מומחה. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות מעניק K08HL088126 וR01HL116352 (TAK) וDK090971 P30 (YZ).

<ol><li>McGrath, K. E., Kingsley, P. D., Koniski, A. D., Porter, R. L., Bushnell, T. P., Palis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enucleation+of+primitive+erythroid+cells+generates+a+transient+population+of+%26%2334%3Bpyrenocytes%26%2334%3B+in+the+mammalian+fetus%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enucleation of primitive erythroid cells generates a transient population of &#34;pyrenocytes&#34; in the mammalian fetus.</a> Blood. 111, 2409-2417 (2008).</li>
<li>Chasis, J. A., Mohandas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythroblastic+islands%3A+niches+for+erythropoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Erythroblastic islands: niches for erythropoiesis.</a> Blood. 112, 470-478 (2008).</li>
<li>Koury, S. T., Koury, M. J., Bondurant, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+distribution+and+function+during+the+maturation+and+enucleation+of+mammalian+erythroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal distribution and function during the maturation and enucleation of mammalian erythroblasts.</a> J Cell Biol. 109, 3005-3013 (1989).</li>
<li>Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enucleation+of+cultured+mouse+fetal+erythroblasts+requires+Rac+GTPases+and+mDia2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2.</a> Nat Cell Biol. 10, 314-321 (2008).</li>
<li>Keerthivasan, G., Small, S., Liu, H., Wickrema, A., Crispino, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+trafficking+plays+a+novel+role+in+erythroblast+enucleation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Vesicle trafficking plays a novel role in erythroblast enucleation.</a> Blood. 116, 3331-3340 (2010).</li>
<li>McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multispectral+imaging+of+hematopoietic+cells%3A+where+flow+meets+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology.</a> J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).</li>
<li>Konstantinidis, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+and+cytoskeletal+requirements+in+erythroblast+enucleation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Signaling and cytoskeletal requirements in erythroblast enucleation.</a> Blood. 119, 6118-6127 (2012).</li>
<li>Giarratana, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+generation+of+fully+mature+human+red+blood+cells+from+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 23, 69-74 (2005).</li>
<li>Chen, K., Liu, J., Heck, S., Chasis, J. A., An, X., Mohandas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+the+distinct+stages+in+erythroid+differentiation+based+on+dynamic+changes+in+membrane+protein+expression+during+erythropoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2009).</li>
<li>Kalfa, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac1+and+Rac2+GTPases+are+necessary+for+early+erythropoietic+expansion+in+the+bone+marrow+but+not+in+the+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Rac1 and Rac2 GTPases are necessary for early erythropoietic expansion in the bone marrow but not in the spleen.</a> Haematologica. 95, 27-35 (2010).</li>
<li>Koulnis, M., Pop, R., Porpiglia, E., Shearstone, J. R., Hidalgo, D., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+analysis+of+mouse+erythroid+progenitors+using+the+CD71%2FTER119+flow-cytometric+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Yoshida, H., Kawane, K., Koike, M., Mori, Y., Uchiyama, Y., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylserine-dependent+engulfment+by+macrophages+of+nuclei+from+erythroid+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylserine-dependent engulfment by macrophages of nuclei from erythroid precursor cells.</a> Nature. 437, 754-758 (2005).</li>
<li>Ortyn, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+measurement+and+compensation+in+spectral+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging.</a> Cytometry A. 69, 852-862 (2006).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

בשנים האחרונות המחקר של אנוקלאציה erythroblast צבר תאוצה גוברת שכן הוא הצעד במבחנת תרבויות erythropoiesis שהוא קשה ביותר להתרבות ביעילות על מנת להשיג ייצור של תאי דם אדומים לשעבר vivo מוצלח, בקנה מידה גדולה. עד לאחרונה, המחקר של אנוקלאציה erythroblast מנוצל מיקרוסקופיה בעיקר הקרינה וזרימת cytometry שיטות. שיטות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אם כי מועיל בזיהוי מולקולות משתתפות, דורשות ימים של התבוננות מיקרוסקופית כדי לזהות מספר קטן של erythroblasts אורתוכרומטי עובר אנוקל...

בידול מסוף בתוך שושלת erythroid ביונקים מסתיים בתהליך הדרמטי של אנוקלאציה, שדרכו erythroblast אורתוכרומטי מגרש הגרעין שלה, עטוף בממברנה (pyrenocyte) 1, שהניבו reticulocyte 2. המנגנון המדויק של תהליך זה, שהוא גם הגבלת צעד שיעור מוצלח, בקנה מידה גדולה, ייצור כדוריות דם אדומים במבחנה, עדיין לא הובהר במלואו. הלוקליזציה של חלבונים ומבני מפתח בתוך erythroblasts enucleating מסתמכת על השימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי ואלקטרוני 3-5. תהליך מייגע זה בדרך כלל תוצאות בזיהוי של מספר מצומצם של אירועי אנוקלאציה ולא תמיד מאפשר ניתוח סטטיסטי משמעותי. הרחבת על שיטה של זיהוי erythroblast תוארה בעבר על ידי McGrath et al. 6, פיתחנו גישה חדשנית של זיהוי ולימוד אירועי אנוקלאציה ידי Multi-Spectral אמאגינג cytometry הזרימה (multiparameter הדמיה במהירות גבוהה תא בזרימה, בשיטה המשלבת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם cytometry זרימה) 7, אשר יכול לספק מספר מספיק של תצפיות כדי להשיג מדידות וביצוע ניתוחים סטטיסטיים. כאן, אנו מתארים שתי שיטות מבחנה הראשונות בerythropoiesis תרבות משמשות כדי לסנכרן erythroblasts ולהגדיל את ההסתברות ללכידת אנוקלאציה בעת ההערכה. לאחר מכן אנו מתארים בפירוט את ההכתמה של erythroblasts לאחר הקיבוע וpermeabilization כדי ללמוד את הלוקליזציה של חלבונים תאיים או רפסודות שומנים בדם במהלך אנוקלאציה ידי זרימת הדמיה רבת רפאים cytometry. דגימות מנוהלות על זרימת הדמיה cytometer והתאים שנאספו הם מגודרים כראוי לזהות erythroblasts אורתוכרומטי 6. אז erythroblasts אורתוכרומטי מנותחים המבוסס על היחס שלהם, כפי שהיא נמדדת בהר&quot;י brightfieldגינג, לעומת ערכם לcentroid דלתא פרמטר XY Ter119-DNA, אשר מוגדר כמרחק בין המרכזים של האזורים המוכתמים עבור Ter119 ו-DNA, בהתאמה. האוכלוסייה של תאים עם יחס נמוך וcentroid דלתא הגבוה XY Ter119/DNA היא מועשר בenucleating תאים. באמצעות wild-type (WT) erythroblasts לעומת erythroblasts עם מחיקת MX-Cre בתיווך מותנית של Rac1 על Rac2 - / - או בשילוב Rac2 - / -; Rac3 - / - רקע גנטי ופרוטוקול ניתוח הרומן הזה של זרימת הדמיה רבת רפאים cytometry, אנחנו הוכיחו לאחרונה כי אנוקלאציה דומה cytokinesis סימטרי וכי היווצרות טבעת actomyosin מוסדרת בחלקו על ידי GTPases RAC היא חשובה להתקדמות אנוקלאציה 7.

<table><tbody><tr><td>ואלפא; MEM בינוני</td><td>CellGro</td><td>15-012-CV</td><td></td></tr><tr><td>IMDM בינוני</td><td>Hyclone (Thermo Scientific)</td><td>SH30228.01</td><td></td></tr><tr><td>Stempro-34 SFM</td><td>GIBCO (Life Tech)</td><td>10640</td><td></td></tr><tr><td>תוסף תזונה Stempro-34</td><td>GIBCO (Life Tech)</td><td>10641-025</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>512450</td><td></td></tr><tr><td>BIT9500</td><td>Stemcell Technologies</td><td>09500</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר (BSA)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP-1600-100</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח (PBS)</td><td>היקלון (תרמו סיינטיפיק)</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>היקלון (תרמו סיינטיפיק)</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>ל-גלוטמין</td><td>היקלון (תרמו סיינטיפיק)</td><td>SH30590.01</td><td></td></tr><tr><td>איזותזיה (איזופלורן)</td><td>באטלר-שיין</td><td>029405</td><td></td></tr><tr><td>היסטופאקה 1.083 מ"ג/מ"ל</td><td>סיגמא</td><td>10831</td><td></td></tr><tr><td>BD פארמליז (מאגר ליזה RBC)</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>אצטון</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>534064</td><td></td></tr><tr><td>פורמלדהיד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP 531-500</td><td></td></tr><tr><td>הידרוקורטיזון</td><td>סיגמא</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>פקטור תאי גזע (SCF)</td><td>פפרוטק</td><td>250-03</td><td></td></tr><tr><td>אינטרלוקין-3 (IL-3)</td><td>פפרוטק</td><td>213-13</td><td></td></tr><tr><td>EPOGEN Epoetin Alfa (אריתרופוייטין, EPO)</td><td>AMGEN</td><td>זמין על ידי בית מרקחת</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן CD44-FITC BD</td><td>Pharmingen</td><td>553133</td><td></td></tr><tr><td>CD71-FITC נוגדן</td><td>BD Pharmingen</td><td>553266</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן Ter119-PECy7</td><td>BD Pharmingen</td><td>557853</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-AF488</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td> <td>A12379</td><td></td></tr> <tr><td>&beta;-tubulin-AF488 נוגדן</td><td>איתות תאים</td> <td># 3623</td><td></td></tr><tr><td>אנטי ארנב AF488 - נוגדן משני</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td> <td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>נגד ארנב AF555 - נוגדן משני</td><td>Invitrogen (חיים טכנולוגיות)</td><td>A21428</td><td></td></tr><tr><td>AF594-תת-יחידה של רעלן כולרה B</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>C34777</td><td></td></tr><tr><td>pMRLC (Ser19) נוגדן</td><td>איתות תאים</td><td>#3671</td><td></td></tr><tr><td>&גמא;-נוגדן טובולין</td><td>Sigma</td><td>T-3559</td><td></td></tr><tr><td>Syto16</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>S7578</td><td></td></tr><tr><td>Draq5</td><td>Biostatus</td><td>DR50200</td><td></td></tr><tr><td>ברזל גופרתי</td><td>Sigma</td><td>F7002</td><td></td></tr><tr><td>ברזל חנקתי</td><td>Sigma</td><td>F3002</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120500</td><td></td></tr><tr><td>צינורות 15 מ"ל</td><td>BD Falcon</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>צינורות 50 מ"ל</td><td>BD Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 6 בארות</td><td>BD Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>24- צלחות</td><td>באר צינורות זרימה BD פלקון</td><td>351147</td><td></td></tr> מזרק <tr><td></td><td>BD פלקון</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>טוברקולין</td><td>מזרק BD</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>מזרק אינסולין</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>מחט מזרק 25-G 5/8</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>צינורות זרימה מכוסים</td><td>BD</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>40-&mu; מסננת תאים m</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>אזמל (חד פעמי)</td> <td>נוצה</td><td>2975 # 21</td><td></td></tr><tr><td>FACS Canto Flow Cytometer</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImagestreamX Mark II Imaging Flow Cytometer</td><td>AMNIS (EMD Millipore)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>תוכנה לחקר וניתוח נתוני תמונה (IDEAS) גרסה 4.0 ומעלה.</td><td>AMNIS (EMD Millipore)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemavet 950 מונה תאים</td><td>דרו מדעי</td><td>CDC-9950-002</td><td></td></tr><tr><td>סדרת NAPCO 8000WJ אינקובטור</td><td>תרמו מדעי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-15R צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>מיני עכבר ספסל צנטריפוגה</td><td>דנוויל</td><td>C0801</td><td></td></tr></tbody></table>

זיהוי של subpopulation מועשר murine erythroblast באירועי enucleating ידי multi-רפאים הדמיה תזרים cytometry

Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation  Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Erythropoiesis ביונקים מסתיים בתהליך הדרמטי של אנוקלאציה כי תוצאות היווצרות reticulocyte. המנגנון של אנוקלאציה טרם הובהר במלואו. בעיה נפוצה נתקלה כאשר לומדים את הלוקליזציה של חלבונים ומבני מפתח בתוך erythroblasts enucleating ידי מיקרוסקופ היא הקושי לצפות במספר מספק של תאים עוברים אנוקלאציה. פיתחנו פרוטוקול ניתוח חדשני באמצעות הדמיה multiparameter במהירות גבוהה תא בזרימה (Multi-Spectral Imaging cytometry הזרימה), שיטה המשלבת מיקרוסקופיה immunofluorescent עם cytometry זרימה, על מנת לזהות ביעילות מספר משמעותי של אירועי enucleating, המאפשר ל להשיג מדידות וביצוע ניתוחים סטטיסטיים. אנחנו הראשונים מתארים כאן שתי שיטות מבחנה התרבות בerythropoiesis משמשות כדי לסנכרן erythroblasts העכברי ולהגדיל את ההסתברות ללכידת אנוקלאציה בהזמן דואר של הערכה. לאחר מכן, אנו מתארים בפירוט את ההכתמה של erythroblasts לאחר הקיבוע וpermeabilization כדי ללמוד את הלוקליזציה של חלבונים תאיים או רפסודות שומנים בדם במהלך אנוקלאציה ידי זרימת הדמיה רבת רפאים cytometry. יחד עם גודל ומכתים DNA/Ter119 אשר משמשים כדי לזהות את erythroblasts אורתוכרומטי, אנו מנצלים את הפרמטרים &quot;יחס&quot; של תא בערוץ הבהיר השדה שמסייע בזיהוי של תאים מוארכים ו&quot; centroid דלתא XY Ter119/Draq5 &quot;המאפשר זיהוי של אירועים הסלולר שבמרכז מכתים Ter119 (reticulocyte המתהווה) הוא רחוק אחד מהשני מהמרכז מכתים Draq5 (שיחול גרעין עובר), ובכך מצביע על תא עומד enucleate. קבוצת המשנה של אוכלוסיית erythroblast אורתוכרומטי עם centroid דלתא גבוה ויחס נמוך מועשר בenucleating תאים.

ראשית, תאים מנותחים על בסיס יחס הממדים Brightfield (היחס בין אורכם הקטינים לעומת הציר המרכזי שלהם) ופינת Brightfield (מעיד על הגודל שלהם). אירועים עם ערך פינת Brightfield נמוך מ20 וגבוהים יותר מאשר 200 הם בעיקר אגרגטים פסולת ותאים, בהתאמה, והם נכללים בניתוח (איור 2 א). תאים בודדים (שער &quot;R1&quot;) הם לאחר מכן נותח על בסיס ערכם לפרמטר צבע RMS, דבר שמצביע על חדות של תמונה. השער &quot;R2&quot; נוצר תאים המכילים ערך עם Gradient RMS יותר מ אחוזון ה 50 כד...

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה חדשה לזיהוי אוכלוסייה של enucleating erythroblasts אורתוכרומטי ידי זרימת הדמיה רבת רפאים cytometry, מתן להדמיה של תהליך אנוקלאציה erythroblast.

זיהוי של subpopulation מועשר Murine Erythroblast באירועי Enucleating ידי Multi-רפאים הדמיה תזרים cytometry

Erythropoiesis in mammals concludes with the dramatic process of enucleation that results in reticulocyte formation. The mechanism of enucleation has not ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להקל על זיהוי אירועי גרעין (enucleation) עם תת-אוכלוסייה של אריתרובלסטים. השלב הראשון הוא יצירת אוכלוסייה המועשרת באירועי גרעין. דבר זה מושג על ידי תרבית אריתרופואזה in vitro, אם בתרבית ארוכה המתחילה מתאי מח עצם בצפיפות נמוכה שבודדו מעצמות הירך, השוק ועצמות האגן של עכבר שאינו תחת עקה, או בתרבית קצרה.התהליך מתחיל עם תאי בלוזר (ple cytes) מהטחול של עכבר שעבר בעבר פלבוטומיה כדי לעורר המופואזה של מאמץ (stress erythropoiesis). התאים שהוצמחו בשלב הסופי של התרבית מקובעים, עוברים פרמיאביליזציה ונצבעים במסמנים פלואורסצנטיים רלוונטיים. תאים אלו עוברים ניתוח במכשיר imaging flow cytometer ולאחר מכן מנותחים כדי לזהות את התאים העוברים דה-גרעיון (enucleation) בתוך אוכלוסיית התאים הגרעיניים; כך ניתן לזהות את רכיבי האיתות והשלד התאי המסדירים ומתווכים את תהליך הדה-גרעיון.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, הוא שניתן לצפות ולנתח מספר גדול משמעותית של תאים בעלי גרעין בפרק זמן קצר. שיטה זו עשויה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום האריתרופויזה, כגון אילו מנגנונים מולקולריים מעורבים בגרעיניות של אריתרובלאסטים. כדי להבדיל תאי אריתרואיד מתאי מחול השלששת בעלי צפיפות נמוכה, התחילו בהוספת one milliliter של מצע תרבית למבחנה סטרילית עבור ציטומטריית זרימה.לאחר מכן, חברו מחט במידה 25 gauge באורך חמישית האינץ' למזרק טורבקולין, ושטפו בעדינות מספר פעמים מצע גידול טרי דרך פמוריות והטיביות שנאספו אל תוך מבחנה לציטומטריה של זרימה. לאחר התאמת נפח סספנסיית התאים ל-5 mL באמצעות IMDM, שכבדו בזהירות על 5 mL של מצע הפרדת תאים במדרג צפיפות של 1.083 g/mL במבחנה של 15 mL. העבירו את כל התכולה עד לסימון של 2 mL למבחנה חדשה של 15 mL, ושטפו את שכבת ה-buffy coat שנאספה עם מצע גידול טרי.בצעו ליזיס לתאי הדם האדומים ב-3 mL של בופר לליזיס של תאי דם אדומים למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת התאים במצע גידול וסספנסיה מחדש של המשקע באותה פלטה, זרעו את התאים בפלטת תרבית תאים של 6 בארות בריכוז של 5×10⁵ תאים לבערה, לנפח סופי של 2.5 mL במצע גידול, והדגירו את התאים ב-37 °C למשך חמישה ימים לאחר זריעת התרבית.ספרו את מספר האריתרובלסטים בכל באר של פלטת התרבית המקורית, ולאחר מכן העבירו את תוכן כל באר למבחנות קוניות נפרדות בנפח 15 milliliters. לאחר סבב צנטריפוגה להשקעת התאים, שאבו את העלייה (supernatants) ושחזרו את המשקעים (pellets) במצע גידול טרי המכיל erythropoietin בלבד, עד לריכוז של 2 × 10⁵ תאים ל-milliliter. לאחר מכן, שאבו את העלייה מפלטה של תאי MS 5 והוסיפו את התאים האריתרואידיים לבארי הפלטה.יומיים לאחר מכן, החליפו את העל-נוזל (supernatant) במצע גידול טרי ללא ציטוקינים כדי להוציא אריתרובליסטים מתאי PLE בצפיפות נמוכה. השתמשו בבוכנה של מזרק של 5 ml כדי למעוך את הטחול דרך מסננת של 40 micron לתוך מבחנה של 50 ml. שטפו את מסננת התאים במצע גידול והביאו את הנפח הסופי של תרחיף התאים ל-5 ml.לאחר הפרדת שכבות התאים באמצעות מדרג צפיפות כפי שהודגם זה עתה, הסירו את תאי הדם האדומים ושטפו את התאים ב-7 mL של מצע תרבית. לאחר מכן, השעו את המשקע במצע גידול מועשר בציטוקינים והדגירו את התכים בריכוז של 1-5 × 10⁶ תאים בנפח סופי של 1 mL לכל באר בלוח תרבית תאים בעל 24 בארות, למשך לילה ב-37 °C וב-5% carbon dioxide. למחרת.העבירו את התאים לבארים המכילות תאי MS five דבקים כפי שתואר בעבר ובדקו לאחר שש עד שמונה שעות; אספו את האריתרובלסטים מבארי התרבית וקבעו אותם ב-500 µL של 3.7% formaldehyde ב-PBS Resus, תוך השעיה של המשקע באמצעות פיפטינג עדין. לאחר 15 דקות, סובבו את התאים במהירות של 2000 ×g למשך 20 שניות במיקרו-צנטריפוגה, שאבו את העלייה ושעו את המשקע מחדש ב-500 µL של PBS. לאחר סבב נוסף של התאים במיקרו-צנטריפוגה, שאבו שוב את העלייה והניחו את התאים על קרח למשך 15 דקות לפחות.הניחו תמיסות אצטון המאוחסנות בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס על קרח. לאחר מכן, השעיקו במהירות וסובבו (spin down) את התאים בסדרה של שטיפות אצטון כפי שצוין לאחר השטיפה ב-fax buffer, והדגירו את משקעי התאים ב-100 microliters של תערובת הנוגדנים המתאימה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפה נוספת של התאים ב-fax buffer, השעיקו מחדש את המשקעים ב-60 microliters של fax buffer המכיל drac five, והריצו את הדגימות ב-imaging flow cytometer תוך איסוף של לפחות 10,000 events לכל דגימה ניסיונית.לאחר מכן, התחילו את הניתוח על ידי בחירת תאים על בסיס יחס הגובה-רוחב (aspect ratio) של השדה המואר (brightfield), שהוא היחס בין אורך הציר המזערי לציר המרכזי, ועל בסיס שטח השדה המואר שלהם, המעיד על גודלם. אירועים עם ערך שטח שדה מואר הנמוך מ-20 או הגבוה מ-200 הם ברובם שיירי תאים (debris) וצבירי תאים (cell aggregates) בהתאמה, ולכן הם מוחרגים מהניתוח. לאחר מכן, נתחו את התאים הבודדים על בסיס ערך פרמטר ה-gradient RMS, המעיד על חדות התמונה; צרו שער (gate) שני המכיל את התאים עם ערך gradient RMS הגבוה מהאחוזון ה-50, וזאת כדי לבחור את התמונות שצולמו במיקוד (focus) טוב.בשלב סינון התאים הבא, התאים נבחרים על בסיס גודלם, כפי שנמדד לפי השטח במיקרוסקופ שדה בהיר (brightfield), וחיוביות לסמן האריתרואידי TER119, כפי שנמדדה באמצעות הפרמטר "ממוצע פיקסלים" (mean pixel) של צביעת פלורסצנציה ב-TER119. תאים עם רמות נמוכות מאוד או גבוהות מאוד של TER119 הם תאים שאינם אריתרואידיים או שאריות של צבירי תאים, בהתאמה, והם מוחרגים מהניתוח בשלב הבא. התאים נבחרים על בסיס עוצמת יחס הגובה-רוחב (aspect ratio) של DR5, היחס בין הציר הקצר לציר הארוך של הגרעין, ועוצמת הביטוי של DR5. תאים שליליים ל-DR5 הם בעיקר תאים ללא גרעין, כגון רטיקולוציטים ותאי דם אדומים, ותאים בעלי יחס גובה-רוחב נמוך של DR5.ברוב המקרים, דובלטים מוצאים מהניתוח של ה-gait. גוררים חמישה תאים חיוביים ל-DNA, שהם ברובם אריתרובלסטים בשלב זה. אריתרובלסטים אלו מנותחים לאחר מכן על בסיס שטח TER 19 שלהם, המעיד על גודל התא, ועל בסיס ממוצע השטח לפי פיקסל של TER 19 או צפיפות הביטוי של TER 19, המעיד על בהירות הצביעה של TER 19.אריתרובלאסטים אורתוכרומטיים מזוהים כתאים קטנים בעלי ביטוי גבוה של TER one 19. לבסוף, תת-אוכלוסייה של האריתרובלאסטים האורתוכרומטיים מאופיינת ביחס היבט (aspect ratio) נמוך בשדה בהיר וערכי delta sentu XY TUR one 19 גבוהים. DR five מוגדר על ידי המרחק בין מרכז הרטיקולוציט המבקיע ל-TUR one 19 לבין מרכז הגרעין המבקיע ל-DR five, יחד עם נוגדן נגד her one 19 וצביעת ה-DNA DRAAK five.בדרך כלל צובעים גם את התאים כדי לזהות את המיקום של f actin במהלך התפתחות האריתרובלסטים והגרעין. ראוי לציין כי ניתן להמחיש את התקדמות הפינוי הגרעיני (enucleation) כתאים בעלי יחס גובה-רוחב (aspect ratio) פחות. כלומר, ניתן להבחין בתאים ההופכים למוארכים יותר ויותר ובעל delta OID xy TUR one 19 drag five עולה.F actin מצטבר בשער הפילוח במהלך הליCuleation ולאחר מכן מתפזר ברגע שהגרעין נדחק החוצה. ניתן לצבוע חלבונים ומבנים אחרים בעלי עניין באמצעות הנוגדנים המתאימים או סמנים פלורסצנטיים כדי לאפשר הדמיה של תפקידם במהלך תהליך הוצאת הגרעין. לדוגמה, ניתן להמחיש יצירה של מיקרוטובוליים מקוטבים באריתרובלסטים אורתוכרומטיים מסוג פראי לפני nucleation, אך לא באריתרובלסטים שטופלו ב-colchicine.עיכוב פולימריזציה של טובולין באמצעות קולכיצין מפחית את קיטוב התא, כפי שהודגם על ידי מדידת הפרמטר delta OID XYB FDR five בין מרכז גוף התא הנראה בערוץ ה-Brightfield לבין מרכז הצביעה הגרעינית שהושגה באמצעות DR five. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, כדי לענות על שאלות הנוגעות לאינטראקציות בין סוגי תאים שונים המעורבים בהמטופואזה, כגון אלו הנצפות ב-Erythroblast islands. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להדמיות אירועי דה-גרעין (enucleation) באוכלוסייה מועשרת של אריתובלסטים.

identification-murine-erythroblast-subpopulation-enriched-enucleating

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטה זרימה cytometric לזיהוי וניתוח מולקולרית של התמיינות בשלב ספציפי אבות Murine erythroid ומבשרי, ישירות במח שאך שנקטפו עכבר העצם, בטחול או בכבד העובר. Assay מסתמך על פני קרום התא הסמנים CD71, Ter119, וגודל התא.

זיהוי וניתוח של אבות עכבר Erythroid באמצעות CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

ניתן להשיג מניפולציה של ביטוי גנים טמפורלי בהתמיינות תאי גזע עובריים (ESCs) באמצעות מערכות גנים הניתנות להשראה. עם זאת, יצירת קווי תאים אלה היא יקרה וגוזלת זמן. פרוטוקול זה משיג ביטוי מהיר של טרנסגן בהתמיינות תאים שמקורם ב-ES וניתוח לאחר מכן של התמיינות המטופויאטית במורד הזרם.

זיהום retroviral של Murine גזע עוברי תאי Embryoid גוף תא נגזר לניתוח של בידול המטופואטיות

גזע אבות היווצרות הדם תאים (HSPC) נובעים מתאי אנדותל מיוחדים (hemogenic) במהלך הפיתוח, עדיין מעט מאוד ידוע על התהליך שבו כמה תאי אנדותל לציין להפוך להרכיב דם. אנו מדגימים שיטה המבוססת זרימת cytometry המאפשרת בידוד סימולטני של תאי hemogenic האנדותל HSPC מרקמות עובריות בעכברים.

בידוד של Murine העוברי Hemogenic לתאי אנדותל

בעוד מחלחלים מקרופאגים הם גויסו ללא הרף רקמות מבוגר מ מבשר במחזור, מקרופאגים תושב זרע הרקמה שלהם במהלך הפיתוח, שם הם מתוחזקים ללא קלט נוסף של אבות. אבות של מקרופאגים תושב זוהו לאחרונה. כאן, אנו מציגים שיטות למיפוי גורל גנטי של אבות מקרופאגים תושב.

זיהוי של אבות אריתרומיאלואידים צאצאיהם בעובר עכבר על ידי זרימת cytometry

מאמר זה מתאר ספקטרלי cytometry, גישה חדשה ב cytometry הזרימה המשתמשת צורות של ספקטרום פליטה להבחין fluorochromes. אלגוריתם מחליף פיצויים יכול לטפל קרינה אוטומטית כפרמטר עצמאי. גישה חדשה זו מאפשרת הניתוח הראוי של תאים מבודדים איברים מוצקים.

ניתוח של המתלים תא מבודד מרקמות Solid ידי זרימת cytometry ספקטרלי

המטרה של פרוטוקול זה היא לזהות הלימפה תאי אנדותל אוכלוסיות בתוך הכבד באמצעות סמנים המתואר. אנו מנצלים collagenase הרביעי ואת DNase לקמץ עדין של רקמות, בשילוב עם cytometry זרימה, לזהות אוכלוסייה ברורים של תאי אנדותל הלימפה.

העיכול של הכבד מאתר של ניתוח Cytometric זרימת הלימפה תאי אנדותל

הבחנה בשיטת החוץ הגופית היא שיטה מבוססת היטב להערכת הרעילות והרעלת הציטוזה, אך הבקיע את השימוש במיקרוסקופיה ידנית, הוא מפרך וסובל מהבדלים בין השונות לבין השערים. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול שפותח כדי לבצע גרסה אוטומטית לחלוטין של השיטה באמצעות זרימת הדמיה רב ספקטנטרי.

שיטה אוטומטית לביצוע השימוש בשיטת ההדמיה באמצעות הדמיה רב ספקטקטרלית באמצעות זרימה

אנו מתארים כאן ניתוח פשוט של ההטרוגניות של תא תאי B החיסוניים המוריניים ברקמות הצפק, הטחול ומח העצם על ידי ציטומטריית זרימה. הפרוטוקול יכול להיות מותאם ומורחב לרקמות עכבר אחרות.

אפיון ציטומטרי זרימה של פיתוח תאי מורין B

כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט לבידוד והכתמה של תאי מח עצם מורין לפנוטיפ תאי גזע המופויטיים ותאי אב יחד עם תאי גזע אנדותל ומזנכימליים תומכים. כמו כן נכללת שיטה להעשרת תאים הממוקמים באזורי אנדוסטל ומח עצם מרכזי.

ניתוח ציטומטריית זרימה של תאי גזע ותאי אב המטופויטיים של מח עצם מורין ותאי נישה סטרומליים

כאן אנו מתארים שיטה ציטומטרית חדשנית לזרימה לבידוד פרוספקטיבי של אריתרואיד יחידה יוצרת התפרצות מוקדמת (BFU-e) ואריתרואיד יחידה יוצרת מושבה (CFU-e) ישירות ממח עצם וטחול טריים של עכבר. פרוטוקול זה, שפותח על סמך נתוני תעתיק חד-תאיים, הוא הראשון לבודד את כל אבות האריתרואידים של הרקמה בטוהר גבוה.

זיהוי ובידוד של יחידה יוצרת פרץ ויחידה יוצרת מושבה אבות אריתרואידים מרקמת עכבר על ידי ציטומטריה של זרימה

מאמר זה מתאר שיטה לבידוד מבוסס חרוזים מגנטיים של תאי אנדותל מורין מנימי לימפה עוריים. תאי האנדותל הלימפטיים המבודדים יכולים לשמש לניסויים במבחנה במורד הזרם ולניתוח ביטוי חלבונים.

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation

למדו לזהות אירועי enucleation באריתרובלסטים אורתוכרומטיים מעכברים באמצעות ציטומטריית זרימה עם הדמיה מולטי-ספקטרלית. שיטה זו מאפשרת ניתוח מפורט של תהליך ההבשלה האריתרואידית והבנת מנגנונים מולקולריים בדם.

זיהוי של subpopulation מועשר Murine Erythroblast באירועי Enucleating ידי Multi-רפאים הדמיה תזרים cytometry

גלה סרטונים נוספים