זיהוי של subpopulation מועשר Murine Erythroblast באירועי Enucleating ידי Multi-רפאים הדמיה תזרים cytometry

המטרה הכוללת של הליך זה היא להקל על זיהוי אירועי הגרעין עם תת-אוכלוסייה של אריתרובלסטים. הצעד הראשון הוא יצירת אוכלוסייה מועשרת באירועי גרעין. זה מושג על ידי תרבית אריתרופואיזיס במבחנה, או לטווח ארוך החל מתאי מח עצם בצפיפות נמוכה המבודדים מעצם הירך, השוקה ועצמות האגן של עכבר שאינו לחוץ או תרבית לטווח קצר.

החל מ-ple cytes מהטחול של עכבר שעבר בעבר פלבוטומיה על מנת להעלות אריתרופואיזיס מתח. התאים המתורבתים בשלב הסופי של התרבית מקובעים, חדורים ומוכתמים בסמנים הפלואורסצנטיים המעניינים. תאים אלה מופעלים על ציטומטר זרימת הדמיה ולאחר מכן מנותחים כדי לזהות את התאים העוברים פירוק באוכלוסיית התאים הגרעיניים, ניתן לזהות איתות ורכיבי שלד תאים המווסתים ומתווכים את תהליך הגרעין

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, הוא שניתן לצפות ולנתח את המספר הגדול משמעותית של תאים גרעיניים בפרק זמן קצר. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האריתרופואיזה, כגון אילו מנגנונים מולקולריים מעורבים בגרעין אריתרובלסטים. כדי להבדיל בין תאי אריתרואידים לתאי מח עצם בצפיפות נמוכה, התחל בהוספת מיליליטר אחד של מצע תרבית לצינור ציטומטרי זרימה סטרילי.

לאחר מכן חבר מחט בגודל 25 על חמש שמיניות אינץ' למזרק טוברקולין ושטוף בעדינות אמצעי תרבית טריים דרך עצם הירך והשוק שנקטפו כמה פעמים לתוך צינור ציטומטריית הזרימה. לאחר התאמת נפח תרחיף התאים לחמישה מיליליטר עם IMDM, שכבה בזהירות על חמישה מיליליטר של 1.083 גרם למדיום הפרדת תאים בצפיפות מיליליטר בצינור של 15 מיליליטר. העבירו הכל עד לסימן שני מיליליטר לתוך צינור חדש של 15 מיליליטר ושטפו את מעיל הבאפי שנאסף במצע תרבית טרי כינים את כדוריות הדם האדומות בשלושה מיליליטר של מאגר ליזה של כדוריות דם אדומות למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר לאחר שטיפת תאים באמצעי תרבית והחייאת הכדור באותה צלחת, התאים בצלחת תרבית תאים של שש בארות בריכוז של חמש פעמים 10 מהתאים החמישיים לבאר לנפח סופי של 2.5 מיליליטר במצע הגידול ודוגרים על התאים ב-37 מעלות צלזיוס חמישה ימים לאחר הציפוי.

ספרו את מספר האריתרובלסטים בכל באר של צלחת התרבות המקורית ולאחר מכן העבירו כל באר לצינורות חרוטיים בודדים של 15 מיליליטר. לאחר סיבוב התאים, שאפו את הסופרנטנטים והשעו מחדש את הכדורים במצעי גידול טריים המכילים אריתרופוייטין בלבד לריכוז של פי שניים פי 10 מהתאים החמישיים למיליליטר. לאחר מכן שאפו את הסופרנטנט מצלחת של חמישה תאי טרשת נפוצה והוסיפו את תאי האריתרואידים לבארות.

יומיים לאחר מכן, החלף את הסופרנטנט במצע גידול טרי ללא ציטוקינים כדי לטפל באריתרובלסטים מציטי PLE בצפיפות נמוכה. השתמש בבוכנה ממזרק של חמישה מיליליטר כדי להשרות את הטחול דרך מסננת של 40 מיקרון לתוך צינור של 50 מיליליטר. שטפו את מסננת התאים באמצעי גידול והתאימו את הנפח הסופי של מתלה התאים לחמישה מיליליטר.

לאחר מכן, לאחר הפרדת שכבות התאים על ידי שיפוע צפיפות כפי שהודגם זה עתה, כינים את כדוריות הדם האדומות ושטפו את הציטים בשבעה מיליליטר של מצע תרבית. לאחר מכן, Resus משהה את הגלולה במצע גידול בתוספת ציטוקינים ודוגר על התאים ב-1 עד 5 פעמים 10 לששת התאים בנפח סופי של מיליליטר אחד לבאר של צלחת תרבית תאים של 24 בארות למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. למחרת.

העבירו תאים לבארות המכילות חמישה תאים דבוקים של טרשת נפוצה כפי שתואר קודם לכן ונתחו לאחר שש עד שמונה שעות, אספו את האריתרובלסטים מבארות התרבית וקבעו אותם ב-500 מיקרוליטר של פורמלדהיד 3.7% ב-PBS Resus, תוך תליית הגלולה עם פיפטינג עדין. לאחר 15 דקות, סובבו את התאים ב-2000 GS למשך 20 שניות במיקרו-צנטריפוגה, שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של PBS. לאחר סיבוב התאים במיקרו-צנטריפוגה, שוב, שאפו שוב את הסופרנטנט והניחו את התאים על קרח למשך 15 דקות לפחות.

שים מינוס 20 מעלות צלזיוס, תמיסות אצטון מאוחסנות על קרח. לאחר מכן השעו במהירות וסובבו את התאים בסדרה של שטיפות אצטון כפי שצוין לאחר שטיפת מאגר הפקס, דגרו את כדורי התאים ב-100 מיקרוליטר של קוקטייל הנוגדנים המתאים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לאחר שטיפת התאים שוב במאגר הפקס, השעו מחדש את הכדורים המתמשכים ב-60 מיקרוליטר של מאגר פקס המכיל דראק חמש והריצו את הדגימות על ציטומטר זרימת הדמיה שאוסף לפחות 10,000 אירועים לכל דגימת ניסוי.

לאחר מכן התחל את הניתוח על ידי בחירת תאים על סמך יחס הגובה-רוחב של השדה הבהיר שלהם, היחס בין אורך הציר הקטן שלהם לעומת הציר הראשי שלהם ושטח השדה הבהיר שלהם, מה שמעיד על גודלם. אירועים עם ערך שטח שדה בהיר נמוך מ-20 וגבוה מ-200 הם בעיקר פסולת ואגרגטים של תאים בהתאמה ואינם נכללים בניתוח. לאחר מכן מנתחים את התאים הבודדים על סמך הערך שלהם עבור פרמטר RMS השיפוע, המציין את חדות התמונה יוצרים שער שני המכיל את התאים עם ערך RMS שיפוע גדול מהאחוזון ה-50 על מנת לבחור את התמונות שצולמו היטב במיקוד.

השער הבא, התאים המבוססים על גודלם כפי שנמדד על ידי שטח השדה הבהיר שלהם והחיוביות שלהם עבור סמן האריתרואיד TER אחד 19 כפי שנמדד על ידי TER אחד 19 תאי פרמטר פיקסלים ממוצעים של כתם פלואורסצנטי נמוכים מאוד או גבוהים מאוד עבור TER אחד 19 הם לא אריתרואידים או אגרגטים תאים נותרים בהתאמה ואינם נכללים בניתוח בשלב הבא. התאים נבחרים על סמך עוצמת יחס הגובה-רוחב של חמשת ה-DR שלהם, היחס בין הציר הקטן לעומת הציר הראשי של הגרעין שלהם ועוצמת הביטוי שלהם d dr five. DR חמישה תאים שליליים לרוב תאים גרעיניים כגון רטיקולוציטים ותאי דם אדומים ותאים עם יחס גובה-רוחב נמוך של גרר חמש.

לרוב כפולים אינם נכללים בהליכת הניתוח. ה-DNA גורר חמישה תאים חיוביים חיוביים, שהם בעיקר אריתרובלסטים בשלב זה. אריתרובלסטים אלה מנותחים לאחר מכן על סמך שטח TER אחד 19 שלהם, המציין את גודל התא ואת שטח הפיקסלים הממוצע של TER 19 או צפיפות של ביטוי TER אחד 19, המציין את הבהירות של צביעת TER 19 שלהם.

אריתרובלסטים אורתו-כרומטיים מוכרים כ-TER קטן אחד 19 תאים גבוהים. לבסוף, תת-אוכלוסייה של אריתרובלסטים אורתו-כרומטיים מאופיינת ביחס הגובה-רוחב הנמוך שלהם ובדלתא סנטו XY TUR הגבוה שלהם 19. DR 5 כפי שהוגדר על ידי המרחק בין מרכז ה-TUR ההתחלתי 19 רטיקולוציט חיובי אחד ומרכז ה-DR 5 גרעין חיובי יחד עם נוגדנים כנגד 19 וכתם ה-DNA DRAAK חמש.

התאים נצבעים בדרך כלל גם כדי לזהות את הלוקליזציה של f אקטין במהלך אריתרובלסט ונוקלאציה. יש לציין כי ניתן לדמיין את התקדמות הגרעין כתאים עם יחס גובה-רוחב יורד. כלומר תאים שהופכים מוארכים יותר ויותר ועם דלתא הולך וגדל OID xy TUR נצפה אחד 19 גרר חמש.

F אקטין מתרכז בתלם המחשוף במהלך הגרעין ואז מתפזר ברגע שהגרעין יוצא. חלבונים ומבנים מעניינים אחרים יכולים גם להיות מוכתמים בנוגדנים או בסמנים פלואורסצנטיים מתאימים כדי לאפשר הדמיה של תפקידיהם במהלך הוצאת גרעין. לדוגמה, ניתן לדמיין היווצרות מיקרו-צינורות מקוטבים באריתרובלסטים אורתוכרומטיים מסוג בר לפני גרעין, אך לא באריתרובלסטים שטופלו בקולכיצין.

עיכוב פילמור טובולין על ידי קולכיצין מפחית את קיטוב התאים כפי שמודגם על ידי מדידת הפרמטר דלתא OID XYB FDR חמש בין מרכז גוף התא הנראה בערוץ ברייטפילד לבין מרכז הצביעה הגרעינית שהושגה עם DR 5. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לענות על שאלות הנוגעות לאינטראקציות בין סוגי תאים שונים המעורבים באריתרופואיזיס כמו אלה שנצפו באיי אריתרובלסט. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לדמיין אירועי גרעין באוכלוסייה מועשרת באריתרובלסט.