בידוד של בלוטות רב-תאיות בנות קיימא מרקמת הצמח הטורף, Nepenthes

מטרת השיטה המוצגת היא השגת בלוטות בודדות וטהורות מרקמה צמחית טרייה לצורך אנליזה מולקולרית. הדבר מבוצע תחילה על ידי קציר של כד מהצמח מהסוג nepenthe. לאחר מכן, הרקמה מקובעת ישירות על פלטפורמת דגימה מיקרוסקופית על קרח כדי לשמור על טריות הרקמה.

במהלך הליך הדגימה המיקרוסקופית, בלוטות מבודלות באופן מדויק ומועברות לפ menutupל PCR לפני ביצוע ניתוח qPCR על החומר שנאסף. בסופו של דבר, טכנולוגיית דגימה מיקרוסקופית מכנית משמשת להשגת בלוטות בודדות וטהורות מצמחי napes במטרה לספק רקמה ספציפית לניתוח מולקולרי נוסף באופן מהיר ובמינימום פולשנות. צמחים טורפים הם מומחים בקרב הפלורה מכיוון שהם מסוגלים לעכל חלבון חיות.

הידע שלנו לגבי האופן שבו תהליך זה פועל ברמה המולקולרית עדיין מוגבל. מודל טוב למתן מענה לשאלה זו הוא תמונת השילוב של תוספתן הגאוני, מכיוון שיש לו איברים מובחנים, תמונות המייצרות בלוטות, התורמות לתהליכי עיכול אלו. בתוספתן.

בלוטות אלו ממוקמות בתוך התמונות למטה. לצורך אנליזה מולקולרית, יש לבודד מבנים רחבים ושטוחים אלו, שקוטרם כ-100 עד 200 מיקרומטרים, ישירות מרקמה טרייה. כדי להקשות על התהליך, הבלוטות מכוסות בכיסוי מגן.

מכיוון שהמבנה דומה לחניה מכוסה (carport) ובשל כך נדרשו תצפיות תלת-ממדיות במהלך הדגימה, וכן כלי המסוגל לנוע בשלושה ממדים באופן עדין, למדנו שטכניקות המיקרו-דיסקציה הנוכחיות לא תוכננו לפתור את בעיותינו. לייזר, למשל, לא הצליח בשל תכולת המים הגבוהה של רקמת הצמח.

לפיכך, החלטנו להשתמש וליישם טכניקה חדשה של מיקרו-דיסקציה מכנית הנקראת aika, ובפרט לצורך בידוד של חלקי רקמות או אף תאים בודדים של מבנים תלת-ממדיים. היא מורכבת ממיקרוסקופ סטריאו או סכימה, שבו משולב מיקרו-מניפולטור תלת-ממדי באופן המאפשר לו להגיע בקלות לאובייקטים שטוחים מאוד או גבוהים מאוד. המניפולטור נע יחד עם המיקרוסקופ כעמוד תמיכה; עבור דגימות מצמחים, אנו משתמשים לעיתים קרובות במיקרו-קפילריות.

עם זאת, במקרה של זכוכית נספח, מצאנו שהפינצטה המיקרוסקופית המונעת על ידי PTO יעילה יותר עבור הפרוצדורה שלנו. עבור הנספח, הפלטפורמה שונו. במתקן VXY קטן תומך במכל דגימה מלא בקרח, הגדול מספיק כדי להכיל הן את דגימת הרקמה עם התומך שלה והן את המקום שבו תונח הבלוטה.

הקרח מבטיח שתהליכי הפירוק בתוך הרקמה יואטו במידה שתאפשר זיהוי של המצב המולקולרי המקורי של הרקמה. הפרוצדורה הבאה נקבעה מהחלק התחתון של תמונה. חתיכה של כ-1 עד 2 סמ"ר מוצאת ואז מוחלקת.

לאחר מכן מקבעים את הרקמה על זכוכית אובייקט באמצעות סרט דבק דו-צדדי. דגימת רקמה זו מכוסה במים נקיים מ-RNA ונשמרת לחה במהלך תהליך הדגימה. לאחר מכן מניחים את הדגימה כך שהבלוטות, כיסויי המגן, פונים לכיוון המניפולטור.

יש לכוונן את הזווית בין הדגימה לכלי כך שהבלוטות ימוקמו בצורה שטוחה. באמצעות במה אוניברסלית, ניתן לכוונן את ההטיה בשני צירים ולתקן אותה בקלות תחת המיקרוסקופ. הבמה המתכתית שומרת על קרירות הדגימה תחת המיקרוסקופ.

הבלוטות מובחנות היטב. הפלואורסצנציה מסייעת בזיהוי קל של קווי המתאר של הבלוטה ושל כיס המגן. הדגימה נצפית דרך מסנן FSE לצורך בידוד הבלוטות.

לצורך בידוד RNA, נעשה שימוש במסנן UV. מיקום מדויק מאוד של המיקרו-פינצטה חיוני לבידוד הגדיל. מומלץ להפעיל את המכשיר במצב מהירות נמוכה.

באמצעות הפינצטה המיקרוכירורגית, ניגשים לבלוטה וממקמים את זרועותיה בגבולותיה באמצעות הג'ויסטיק, ואז סוגרים בעדינות את הפינצטה. לאחר מכן מרימים את הבלוטה מהרקמה הסובבת. לאחר בידוד מדויק, ניתן לראות את החלל השל, המציג את הרקמה הוורידלית שמתחתיו.

לאחר מכן מעבירים את בלוטה המבודדת למבחורת PCR ומניחים אותה לתוך התמיסת המאייצבת (buffer) שהוכנה. כדי לתקף שיטה זו, נקבע הביטוי הגני של חלבון atoma leg protein short, שהסימון שלו הוא TAP, המופרס לתוך נוזל המלכודת; נמצא כי ניתן להגביר את הגן ישירות מהבלוטות ללא חילוץ מוקדם של DNA גנומי, וזאת פשוט על ידי הוספת תערובת התגובה של ה-PCR לרקמה המבודדת.

סדרת הניסויים כללה בלוטות מצמחי nepenthes שעברו טיפולים שונים, וכן דגימות מרקמת העור שמסביבן. עבור כל ניסוי, בוצע מיצוי של RNA כולל. ה-mRNA שהתקבל הומר ל-CDNA תואם באמצעות שעתוק הפוך ושימש לתגובת ה-PCR שבאמצעותה בוצעו השלבים הבאים.

כדי להגביר את רצף הגנים הרלוונטי, נעשה שימוש ב-realtime PCR כדי להשוות את רמת הביטוי של TLP בבלוטות ובאפידרמיס של nepenthes. התוצאות מראות כי רמת התמלול של TLP גבוהה יותר בבלוטות ההפרשה בהשוואה לרקמת האפידרמיס הן ב-nepenthes allotta והן ב-nepenthes miis, כפי שנראה ביחס של רקמת אפידרמיס לרקמת בלוטות הנמוך מאחד, במטרה לבחון האם מגע עם טרף עשוי להשרות ביטוי גני. רמות התמלול של TLP ותמונות של דגימות שלא טופלו לעומת תמונות של דגימות שהוזנו ב-drosophila melanogaster הושוו לאחר לכידת הטרף.

הרקמה האפידרמלית הראתה ביטוי גבוה יותר של TLP כאן. נערכה השוואה בין רמת התמלילי של TLP בבלוטות וברקמה אפידרמלית לבין תמונה מטופלת של nepenthes miis. העלייה בביטוי ה-TLP בשני סוגי הרקמות מעידה על כך שייצור חלבוני נוזל הכד אכן יכול להיות מושרה על ידי טרף.

תוצאות ה-PCR מרמזות כי האכלה משנה ביעילות את ביטוי ה-TLP בשני סוגי הרקמות ויכולה להסיט את יחס הביטוי בין הבלוטה לאפידרמיס. פיתחנו שיטה יעילה לאסוף cleanse מרקמת הנספח של ה-FA ובידדנו כמות מספקת של mRNA לצורך ביצוע ניסויי ביטוי גנים. באמצעות השיטה החדשה שפיתחנו, ניתן לבחון לא רק טרנסקריפטומיקה בבלוטות הנספח, אלא בנוסף לכך, ניתן לבחון גם מטבולומיקה וכן פרוטאומיקה.I.