Name: בידוד של בלוטות רב-תאיות בנות קיימא מרקמת הצמח הטורף, Nepenthes (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-22T20:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: למדו שיטת מיקרו-דגימה מכנית לבידוד בלוטות פעילות מטבולית מצמח הטורף Nepenthes. שיטה זו מאפשרת ניתוח מולקולרי מדויק של מבנים המייצרים תרכובות ביוכימיות ייחודיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים לצוות החממה ב-MPI-CE בגן הבוטני של אוניברסיטת פרידריך שילר, יינה, על טיפוח הצמחים, ולווילהלם בולנד ולאגודת מקס פלאנק על התמיכה.

1. הכנת חומר צמחי
<ol>
	<li>כל מיני Nepenthes גודלו בחממות של MPI לאקולוגיה כימית או בגן הבוטני ביינה, גרמניה.</li>
	<li>להכנת הפרשת רקמות קצרו קנקן והסירו את השליש העליון כולל מכסה, פריסטום ואזור חלקלק. ניתן להשתמש בכד טרי או קפוא בחנקן נוזלי ולאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>
2. מיקרו-דיסקציה של רקמת הכד
<ol>
	<li>פלטפורמת המיקרו-דגימה מורכבת מסטריאומיקרוסקופ ומיקרומניפולטור, המחובר ישירות לגוף המיקרוסקופ ומופעל על ידי ג'ויסטיק תלת מימדי. כאן, נעשה שימוש באב-טיפוס מוקדם של אאורקה כפי שתועד (איור 2A).</li>
	<li>עבור דיסקציה של בלוטות הפרשה מ-Nepenthes, כדים משתמשים במיקרו-מלקחיים ומחברים אותם למניפולטור (איורים 2A ו-2B).</li>
	<li>למיצוי RNA, טפל בכל המכשירים (סכיני גילוח, פינצטה, מיקרומניפולטור, מיקרו-מלקחיים, שקופית אובייקטים) עם RNaseZAP.</li>
	<li>הכן את צינורות האיסוף על ידי הוספת 9 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז ומעכב RNase של 1 מיקרוליטר בצינור PCR למיצוי RNA. עבור PCR ישיר מדגימות רקמה השתמש רק במים נטולי נוקלאז (10 מיקרוליטר).
	<ol>
		<li>קח את הכד הטרי או הקפוא והסר 1-2 ס"מ 2 חתיכת רקמה המכילה את בלוטות ההפרשה באמצעות סכין גילוח ופינצטה. שוטפים את הטישו במים; הוסף 0.1% דיאתילפירוקרבונט (DEPC) אם יופק RNA.</li>
		<li>תקן את החומר הצמחי עם סרט דבק דו-צדדי על מגלשת אובייקט (המשטח המכוסה בבלוטה צריך לפנות כלפי מעלה, איורים 2C ו-2D) ואבטח את השקופית עם סרט דבק על במה אוניברסלית, אותה יש ליישם עם שולחן מטלטלין.</li>
		<li>למיצוי חומצות גרעין ההכנה צריכה להיעשות על קרח. לכן קחו קופסת קלקר שטוחה, הניחו את הבמה האוניברסלית המכילה את הדגימה בפנים ומלאו את הקופסה בקרח. לאחר מכן הניחו את הקופסה מתחת למיקרוסקופ.</li>
		<li>להכנה מיקום הבלוטות חשוב מאוד. בלוטות ההפרשה מכוסות חלקית על ידי מכסה מגן (איור 3) ונגישות רק על ידי המלקחיים מצד אחד. יתר על כן, יש לכוונן את זווית הדגימה למלקחיים על ידי הטיית השולחן של השלב האוניברסלי בכ-135 מעלות, תלוי במין נפנתס.</li>
		<li>המיקרו-דיסקציה נעשית תחת בקרה חזותית. לבידוד בלוטות השתמש במסנן שאינו UV, כדי להגביל את הפירוק של DNA ו-RNA.</li>
		<li>העבר את המיקרומניפולטור והמלקחיים דרך לוח הבקרה לבלוטה שנבחרה. כשמגיעים לבלוטה, הניחו כל זרוע של המלקחיים משני צידי הבלוטה. הסירו את הבלוטה מהרקמה שנותרה על ידי סגירת המלקחיים (איור 4A).</li>
		<li>כוון את הבלוטה המחוברת למלקחיים הרחק מהחפץ ואל צינור האיסוף. הביאו את קצות המלקחיים במגע עם התמיסה בצינור (איור 4B). יש להקפיד היטב על שחרור הבלוטה על ידי פתיחת המלקחיים, מכיוון שהבלוטות נוטות להיצמד לקצה הכלי. ניתן לאחסן את הרקמה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד למיצוי PCR או RNA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. הגברת PCR ישירה מרקמת נפנתס
<ol>
	<li>כדי להוכיח את יעילות שיטת ההכנה, ניתן לבצע גישת PCR ישירות מרקמת הבלוטה ללא שלב מיצוי DNA.</li>
	<li>להגברת ה-PCR השתמש בפריימרים ספציפיים לגנים; כאן מקודד לרצף של חלבון דמוי תאומטין (TLP) (קדימה: 5'-CAATGAGCCAATTCATAAAATTCATTG-3', גב: 5'-CAGTTATACTTTAAGGGCAAAACACAAC-3').
	<ol>
		<li>אסוף 1-5 בלוטות בצינור PCR המכיל 10 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז. לתגובה של 50 מיקרוליטר הוסף 5 מיקרוליטר של מאגר 10x Taq, 1 מיקרוליטר 10 מ"מ דאוקסינוקלאוזיד טריפוספטים (dNTPs), 3 מיקרוליטר 25 מ"מ MgCl2, 0.4 מיקרוליטר (1.25 U) Taq DNA פולימראז, 1 מיקרוליטר (100 pmol) מכל פריימר ו-28.6 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז.</li>
		<li>בצע תגובות PCR בתרמו-ציקלר עם התוכנית הבאה: דנטורציה ראשונית של 94 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות; 35 מחזורי דנטורציה (94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות), חישול (59 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות) והארכה (72 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת); ושלב הארכה סופי של 10 דקות ב-72 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>הוכיח את ההגברה של מוצר ה-PCR באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז. לכן השתמש ב-1.5% (w/v) אגרוז והמיס אותו במאגר 1x TAE (40 מ"מ בסיס טריס, 20 מ"מ חומצה אצטית קרחונית , 1 מ"מ EDTA, pH 8). מחממים את התמיסה במיקרוגל עד להמסת האגרוז. לתמיסת אגרוז של 100 מ"ל, הוסף 1 מיקרוליטר אתידיום ברומיד (10 מיקרוגרם/מיקרוליטר) להדמיה במורד הזרם. הפעל את הג'ל במאגר 1x TAE ב-300 וולט, 115 mA למשך כ-20 דקות בתא אלקטרופורזה. הגודל הנכון של מגבר TLP חייב להיות ב-690 bp.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. מיצוי RNA מדגימות רקמה קטנות ושעתוק הפוך
<ol>
	<li>בצע את השלבים הבאים על קרח. למיצוי RNA נעשה שימוש בשתי שיטות מיצוי, ערכת מיקרו למיצוי RNA כולל וערכת בידוד mRNA המיושמת עם חרוזים מגנטיים.</li>
	<li>אסוף לפחות 30 בלוטות הפרשה על ידי מיקרו-הכנה בצינור PCR המכיל 1 מיקרוליטר מעכב RNase ו-9 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז. לאחר מכן יש לבזבז את הרקמה בתרמו-סייקלר למשך 10 דקות בטמפרטורה של 75 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>מיצוי RNA כולל.
	<ol>
		<li>לאחר ההכנה מוסיפים 90 מיקרוליטר של תמיסת ליזה לדגימה ודוגרים למשך 10 דקות בטמפרטורה של 75 מעלות צלזיוס. לאחר מכן טען את תערובת התגובה על העמודה (המצורפת לערכה) והמשך בשלבי הכביסה כמתואר במדריך היצרן.</li>
		<li>יש להוציא את ה-RNA פעמיים עם תמיסת Elution של 10 מיקרוליטר בהתאמה ולהמשיך בטיפול ב-DNase I.</li>
		<li>ל-20 מיקרוליטר RNA שחולץ, הוסף 2 מיקרוליטר של 10x DNase I מאגר ו-1 מיקרוליטר DNase I (מסופק עם ערכת מיצוי RNA) ודגר שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס. עצור את התגובה על ידי הוספת 2 מיקרוליטר של מגיב אינאקטיבציה של DNase ודגר למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שלב צנטריפוגה למשך 1.5 דקות במהירות מקסימלית, ניתן להעביר את ה-RNA לצינור טרי נטול RNase. קבע את ריכוז ה-RNA של כל דגימה באמצעות ספקטרופוטומטר. יש לאחסן את הדגימות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>מיצוי mRNA באמצעות חרוזים מגנטיים.
	<ol>
		<li>כוונן את נפח הדגימה ל-100 מיקרוליטר עם מאגר ליזה/כריכה (מסופק בערכה) ודגר למשך 10 דקות ב-75 מעלות צלזיוס. הוסף 20 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים המסופקים עם תלייה של Oligo (dT)25 וערבב את התגובה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. ה-mRNA נקשר על ידי זנב הפולי (A) לתלייה של אוליגו (dT)25 של החרוזים.</li>
		<li>בצע את שלבי הכביסה של ה-mRNA הקשור לחרוזים המגנטיים על ידי ביצוע פרוטוקול היצרן. ניתן להסיר פתרונות באמצעות מגנט. השעו מחדש את החרוזים במאגר Tris-HCl של 20 מיקרוליטר 10 מ"מ (pH 7.5).</li>
		<li>הסר זיהומים של DNA גנומי על ידי טיפול בדגימה עם 2U (1 מיקרוליטר) של DNase (2 מיקרוליטר 10x DNase מאגר ו-17 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז) למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן תמיסת האנזים מוסרת על ידי המגנט והחרוזים מושעים מחדש ב-20 מיקרוליטר של מאגר Tris-HCl של 10 מ"מ. לא ניתן למדוד את ריכוז ה- RNA מכיוון שהוא מחובר לחרוזים. יש לאחסן את הדגימות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>לצורך שעתוק הפוך השתמש בערכת סינתזה של cDNA. התגובות בוצעו על ידי ביצוע פרוטוקול היצרן.
	<ol>
		<li>לשעתוק הפוך של סך ה-RNA הוסף 1 מיקרוליטר (100 pmol) Oligo (dT)20 פריימר או 1 מיקרוליטר (0.4 מיקרוגרם) Random Hexamers, מעכב RNase של 1 מיקרוליטר ו-1 מיקרוליטר 10 מ"מ dNTP ערבב ל-1 מיקרוגרם של RNA והתאם את הנפח ל-14 מיקרוליטר עם מים נטולי נוקלאז. דגרו בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולאחר מכן הניחו את הדגימות על קרח. הוסף 1 μl 0.1M DTT, 1 μl טרנסקריפטאז הפוך ו-4 μl של מאגר RT 5x. התגובות מודגרות במשך 55 דקות ב-50 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן שלב השבתה ב-70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר שעתוק הפוך ניתן לאחסן דגימות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>עבור mRNA הקשור לחרוזים מגנטיים, החלף את מאגר Tris-HCl בתערובת התגובה הראשונה (מעכב RNase של 1 מיקרוליטר, תערובת dNTP של 1 מיקרוליטר 10 מ"מ ו-12 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז) ודגירה למשך 5 דקות בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס. בגלל תליית Oligo (dT)25 של החרוזים אין צורך להוסיף פריימר Oligo (dT)20 או Random Hexamers לדגימות. לאחר מכן עקוב אחר הפרוטוקול לעיל (שלב 4.5.1).</li>
		<li>מדוד את ריכוז ה-cDNA בעזרת ספקטרופוטומטר. אחסן את הדגימות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. PCR בזמן אמת
<ol>
	<li>לניתוחים עם PCR בזמן אמת השתמש ב-RNA הכולל שחולץ עם ערכת המיקרו ו-SYBR Green QPCR Master Mix. כדי להבטיח כמות שווה של תעתיקים, התאם את ריכוז ה-cDNA של כל דגימה לאותו ערך לאחר השעתוק ההפוך.</li>
	<li>בנוסף לדגימות, הכנס תגובות בקרה. השתמש בבקרה שאינה תבנית כדי לסנן זיהום בריאגנטים ולבדוק את איכות הפריימרים שלך. כדי לאמת את היעדר ה-DNA הגנומי, הפעל בקרה שאינה RT. שתי התגובות צריכות להיות שליליות (ללא אות פלואורסצנטי) ב-PCR בזמן אמת.</li>
	<li>כדי להבטיח רמת תעתיק שווה בין הדגימות השונות, השתמש בגן ייחוס אחד לפחות. כאן, נעשה שימוש בזוגות פריימרים מעוצבים המקודדים לאקטין (קדימה: 5'-CTCTTAACCCAAAGCAAACAGG-3', גב: 5'-GTGAGAGAACAGCCTGGATG-3') ו-18SrRNA (קדימה: 5'-CTTGATTCTATGGGGGGTGGTG-3', גב: GTTAGCAGGCTGAGGTCTC-3'). כגן מטרה נבחר ה-TLP (קדימה: 5'- GTGGGCAACAATTGGACCCAG-3', גב: 5'-CATTCGATCCGGAAAAGCTAC-3'). גודלו של כל שבר מוגבר היה כ-100bp.</li>
	<li>לתגובה של 25 מיקרוליטר הוסף 12.5 מיקרוליטר 2x SYBR Green QPCR Master Mix, cDNA (≥20 ננוגרם), 400 ננומטר מכל פריימר ו-30 ננומטר של צבע הייחוס הפסיבי ROX (מסופק עם ערכה). התאם את נפח הדגימה ל-25 מיקרוליטר עם מים נטולי נוקלאז.</li>
	<li>התגובות בוצעו בתרמו-ציקלר QPCR עם התוכנית הבאה: דנטורציה ראשונית ב-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות להפעלת הפולימראז; 40 מחזורי דנטורציה (95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות), חישול (61 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות) והארכה (72 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת); ואחריה עקומת הדיסוציאציה (95 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות, 55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות). עקומת הדיסוציאציה נחוצה כדי לקבוע את היעדרם של דימרים פריימר, אותם ניתן לזהות על ידי שיא נוסף.</li>
	<li>קבע את היעילות (E) של כל תגובת PCR באמצעות השיטה של ליו וסנט8. ניתן להסיט את היעילות מהחלק הליניארי של עקומת ההגברה. כאן מספר האמפליקון היחסי (Rn, A) של נקודת מחזור אחת (CPA) מקושר לכמות האמפליקונים (Rn, B) של מחזור אחר (CPB).</li>
	<li>נתח את תוצאות ה-PCR בזמן אמת באמצעות כלי התוכנה לביטוי יחסי (REST 2009, <a href="http://www.gene-quantification.de/rest-2009.html" target="_blank">http://www.gene-quantification.de/rest-2009.html</a>) או תוכנה דומה. השתמש בתוכנית כדי לחשב את יחס הביטוי של גן בדגימה מטופלת בהשוואה לביקורת.</li>
</ol>

<ol><li>Adlassnig, W., Peroutka, M., Land, I., Lichtscheidl, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glands+of+carnivorous+plants+as+a+model+system+in+cell+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Bot.+Gall%22%5BJournal%5D)">Glands of carnivorous plants as a model system in cell biological research.</a> Acta Bot. Gall. 152, 111-124 (2005).</li>
<li>Darwin, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDarwin%2C+C+%22Insectivorous+plants%22">Insectivorous plants</a>. , John Murray. London. (1875).</li>
<li>Mithöfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carnivorous+pitcher+plants%3A+Insights+in+an+old+topic%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Carnivorous pitcher plants: Insights in an old topic.</a> Phytochemistry. 72, 1678-1682 (2011).</li>
<li>Owen Jr., T. P., Lennon, K. A., Santo, M. J., Anderson, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+for+nutrient+transport+in+the+pitchers+of+the+carnivorous+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Nepenthes+alata+Ann.+Bot%22%5BJournal%5D)">Pathways for nutrient transport in the pitchers of the carnivorous plant.</a> Nepenthes alata Ann. Bot. 84, 459-466 (1999).</li>
<li>Brandt, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microgenomics%3A+gene+expression+analysis+at+the+tissue-specific+and+single-cell+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Microgenomics: gene expression analysis at the tissue-specific and single-cell levels.</a> J. Exp. Bot. 56, 495-505 (2005).</li>
<li>Hölscher, D., Schneider, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+laser-assisted+microdissection+for+tissue+and+cell-specific+analysis+of+RNA%2C+proteins%2C+and+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Bot%22%5BJournal%5D)">Application of laser-assisted microdissection for tissue and cell-specific analysis of RNA, proteins, and metabolites.</a> Prog. Bot. 69, 141-167 (2008).</li>
<li>Rottloff, S., Müller, U., Kilper, R., Mithöfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropreparation+of+single+secretory+glands+from+the+carnivorous+plant+Nepenthes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Micropreparation of single secretory glands from the carnivorous plant Nepenthes.</a> Anal. Biochem. 394, 135-137 (2009).</li>
<li>Liu, W. H., Saint, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+quantitative+method+of+real+time+reverse+transcription+polymerase+chain+reaction+assay+based+on+simulation+of+polymerase+chain+reaction+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A new quantitative method of real time reverse transcription polymerase chain reaction assay based on simulation of polymerase chain reaction kinetics.</a> Anal. Biochem. 302, 52-59 (2002).</li>
<li>Werker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trichome+diversity+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Bot.+Res.+Inc.+Adv.+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Trichome diversity and development.</a> Adv. Bot. Res. Inc. Adv. Plant Pathol. 31, 1-35 (2000).</li>
<li>Fahn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+secretory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Bot.+Res.+Inc.+Adv.+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Structure and function of secretory cells.</a> Adv. Bot. Res. Inc. Adv. Plant Pathol. 31, 37-75 (2000).</li>
<li>Juniper, B. E., Robins, R. J., Joel, D. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJuniper%2C+BE+%22The+carnivorous+plants%22">The carnivorous plants</a>. , Academic Press. London. (1989).</li>
<li>Gershenzon, J., McCaskill, D., Rajaonarivony, J., Mihaliak, C., Karp, F., Croteau, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+secretory-cells+from+plant+glandular+trichomes+and+their+use+in+biosynthetic-studies+of+monoterpenes+and+other+gland+products%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Isolation of secretory-cells from plant glandular trichomes and their use in biosynthetic-studies of monoterpenes and other gland products.</a> Anal. Biochem. 200, 130-138 (1992).</li>
<li>Rontein, D., Onillon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CYP725A4+from+yew+catalyzes+complex+structural+rearrangement+of+taxa-4%285%29%2C11%2812%29-diene+into+the+cyclic+ether+5%2812%29-oxa-3%2811%29-cyclotaxane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+of+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">CYP725A4 from yew catalyzes complex structural rearrangement of taxa-4(5),11(12)-diene into the cyclic ether 5(12)-oxa-3(11)-cyclotaxane.</a> J. of Biol. Chem. 283 (5), 6067-6075 (2008).</li>
<li>Aharoni, A., Jongsma, M. A., Bouwmeester, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volatile+science%3F+Engineering+of+terpenoid+biosynthesis+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Volatile science? Engineering of terpenoid biosynthesis in plants.</a> Trends Plant Sci. 10, 594-602 (2005).</li>
<li>Mithöfer, A., Boland, W., Maffei, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+ecology+of+plant-insect+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Plant+Rev%22%5BJournal%5D)">Chemical ecology of plant-insect interactions.</a> Ann. Plant Rev. 34, 261-291 (2009).</li>
<li>Kennedy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomato+pests%2C+parasitoids%2C+and+predators%3A+Tritrophic+interactions+involving+the+genus+Lycopersicon%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Tomato pests, parasitoids, and predators: Tritrophic interactions involving the genus Lycopersicon.</a> Ann. Rev. Entomol. 48, 51-72 (2003).</li>
<li>Mithöfer, A., Boland, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+defense+against+herbivores%3A+Chemical+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Plant defense against herbivores: Chemical aspects.</a> Ann. Rev. Plant Biol. 63, 431-450 (2012).</li>
<li>Rottloff, S., Stieber, R., Maischak, H., Turini, F. G., Heubl, G., Mithöfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+a+class+III+acid+endochitinase+from+the+traps+of+the+carnivorous+pitcher+plant+genus%2C+Nepenthes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of a class III acid endochitinase from the traps of the carnivorous pitcher plant genus, Nepenthes.</a> J. Exp. Bot. 62, 4649-4647 (2011).</li>
</ol>

אין לנו מה לחשוף.

במשך זמן רב, מחקרים על מבני הפרשת צמחים, במיוחד טריכומות, בוצעו בעיקר על אנטומיה והיו תיאוריים בלבד. יש גוף גדול של פרסומים מסוג זה כפי שסוכם בביקורות של9-11. הידע הביוכימי והמולקולרי שלנו על מבני הפרשת צמחים עדיין מוגבל למרות כמה עבודות יוצאות דופן מוקדמות , למשל על טריכומות בלוטות מנטה המראה כי טריכומות בלוטות הן אתר של ביוסינתזה של מונוטרפנואידים המופרשים לחלל התת-עורי12. לפיכך, יש צורך ליצור כלים ולפתח טכניקות לבידוד של איברים מיוחדים כאלה על מנת לחקור אותם באופן עצמאי. גישה ישירה לבלוט...

צמחים מייצרים מגוון רחב מאוד של תרכובות בעלות יישומים תעשייתיים ופרמצבטיים שונים, החל ממולקולות בעלות משקל מולקולרי נמוך ועד לפולימרים. תרכובות אלו מיוצרות ומופרשות לעיתים קרובות על ידי מבנים ייעודיים מאוד, שרבים מהם ממוקמים על פני השטח של הצמחים, כגון טריכומות בלוטות או נקטריות, או באופן פנימי, כגון אידיובלסטים או צינורות לטקס ושרף, בהתאמה. עם זאת, מעט מאוד ידוע על הביולוגיה של מבני הפרשה ייעודיים אלו, למרות שכל סוגי בלוטות אלו מראים מאפיינים רבים המעידים על מטבוליזם פעיל. בפרט, בלוטות של צמחים טורפים כגון Nepenthes יכולות להשמש כמערכות מודל בביולוגיה של תאי צמחים1.
צמחים טורפים מהווים את מוקדן של מחקרים רבים מאז שנת 1875, עם פרסומו של ספרו של צ'ארלס דרווין 'Insectivorous Plants'2. עם זאת, רק בשנים האחרונות נערך מחקר ברמה המולקולרית, וידענו עדיין מוגבל. לדוגמה, הרכב החלבונים של נוזל העיכול בצמחי הקנקן מסוג Nepenthes עדיין אינו ידוע במלואו. רק לאחרונה זוהו מספר חלבונים הידרוליטיים, וכן מספר גנים תואמים3. במלכודות הנפילה של Nepenthes (איור 1), ממוקמות בלוטות רב-תאיות בחלקו הפנימי התחתון של הקנקנים. בלוטות אלו מבצעות הן את הייצור וההפרשה של אנזימי העיכול אל תוך נוזל הקנקן, והן את הספיגה של חומרי הזנה מומסים מתוך נוזל הקנקן4. לפיכนั้น, בלוטות דו-פונקציונליות אלו מייצגות רקמה זעירה ייחודית בעלת מיקום ותפקיד מרכזיים בתהליך הטורפות של Nepenthes , אשר ראוי למחקר מעמיק.
<img alt="אנטומיה של צמחים טורפים, פירוט כד של Nepenthes, מחקר בוטני, מנגנון מלכודת, התאמה." src="/files/ftp_upload/50993/50993fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="איור 1"> 
איור 1. כד של Nepenthes alata. החלק התחתון של הכד מכיל את נוזל העיכול ואת הבלוטות בחלקו הפנימי.
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50993/50993fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן להצגת תמונה גדולה יותר</a>.
במדעי הצמחים, גישות ניסיוניות רבות מסתמכות על 'חומר גולמי' (bulk material) מכיוון שאינו נחקר רק רקמה מוגדרת אלא איברים שלמים. כתוצאה מכך, הומוגניזציה ואנליזה שלהם יכולות לספק תוצאות מדוללות ופרופורציונליות ביחס לרקמות ולתאים בודדים5. כדי לפתור בעיה זו, פותחו טכניקות של מיקרו-הכנה, למשל מה שנקרא מיקרו-דיסקציה בלייזר (LCM), והן שימשו בהצלחה לאסוף רקמות צמחים ספציפיות ולנתח את תכולתן האינדיבידואלית6. עם זאת, LCM מוגבלת לעיתים קרובות כאשר המטרה היא רכיבי תא שאינם יציבים ו/או מתכלים במהירות, כגון RNA. במקרה כזה, הצורך בקיבוע מוקדם של הרקמה, הדורש זמן רב ולעיתים קרובות מלווה בפירוק של הביומולקולות, מהווה חיסרון. יתרה מכך, בשל תכולת המים הגבוהה של רקמות צמחים רבות וחוזק דפנות התאים, LCM נכשלה לעיתים קרובות בהכנה ישירה מרקמה טרייה7. כל גישה לחקר רכיבים תאיים הנוכחים בבלוטות הפרשה, החל מגןים, mRNA וחלבונים ועד לתרכובות משניות והביוסינתזה שלהן, זקוקה לטכניקות חלופיות להכנה ספציפית זו. לפיכך, נדרשות טכניקות ספציפיות לבידוד תאים בודדים או אפילו בלוטות רב-תאיות שנותרות שלמות לאחר ההכנה.
כאן מוצגת שיטה המשתמשת בפלטפורמת מיקרו-דגימה (microsampling) מכנית הכוללת ויזואליזציה מיקרוסקופית ישירה. טכניקה זו היא מהירה ויעילה להכנת בלוטות בודדות מתוך הכדים של נפנטס (Nepenthes) מינים. בלוטות רב-תאיות אלו הן דו-פונקציונליות, כלומר הן מעורבות בתהליכי הפרשה כמו גם בתהליכי ספיגה, הן נייחות, ושכבות תאים שאינן חשופות מוטמעות ליצירת אנדודרמיס. ניתן לבודד בלוטות שלמות ללא רקמה סמוכה ולהניחן באופן מוגדר לתוך מבחנה ל-PCR. טכניקה זו מיושמת כדי לחקור גנים ספציפיים וכן ביטוי גנים ברקמות של הבלוטות.

<table><tbody><tr><td>RNAqueous-Micro Kit</td><td>Life Technologies GmbH, גרמניה</td><td>AM1931</td><td>בידוד של סך ה-RNA, 50 דגימות</td></tr><tr><td>Dynabeads mRNA DIRECT Micro Kit</td><td>Life Technologies GmbH, גרמניה</td><td>61011</td><td>5 מ"ל Dynabeads Oligo (dT)25</td></tr><tr><td>DynaMag-2 magnet</td><td>Life Technologies GmbH, גרמניה</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript Cellsמערכת</td> <td>סינתזה ישירה של cDNALife Technologies GmbH, גרמניה</td><td>18080-200</td><td>25 תגובות</td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Life Technologies GmbH, גרמניה</td><td>10777-019</td><td>מעכב Rnase, 5,000 יחידות</td></tr><tr><td>בוחן אקראי (0.4 &mu; g/&mu; l)</td><td>QIAGEN GmbH, גרמניה</td><td>79236</td><td>100 &mu; l</td></tr><tr><td>10 מ"מ dNTP Mix, ביולוגיה מולקולרית בדרגה</td><td>Fermentas GmbH, גרמניה</td><td>R0192</td><td>1 מ"ל</td></tr><tr><td>Taq DNA פולימראז, (רקומביננטי)</td> <td>Fermentas GmbH, גרמניה</td><td>EP0402</td><td>מסופק עם מאגר 10x Taq (עם KCl או (NH4)2SO4) ו-25 מ"מ MgCl2</td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Life Technologies GmbH, גרמניה</td><td>AM2238</td><td>1,000 יחידות</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Carl Roth GmbH Co. גרמניה</td><td>T846.3</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler סולם DNA בטווח נמוך, מוכן לשימוש</td><td>Fermentas GmbH, גרמניה</td><td>SM1193</td><td>50 &mu; g</td></tr><tr><td>Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix</td><td>Agilent Technologies, Inc., ארה"ב</td><td>600828</td><td>ערכה יחידה</td></tr><tr><td>RNaseZAP</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, גרמניה</td><td>R2020</td><td></td></tr><tr><td>סכין גילוח</td><td>Carl Roth GmbH Co., גרמניה</td><td>CK08.1</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה</td><td>Carl Roth GmbH Co., גרמניה</td><td>2801.1 / 2855.1</td><td></td></tr><tr><td>GE NanoVue ספקטרופוטומטר</td><td>GE Healthcare Europe GmbH, גרמניה</td><td>28-9569-62</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler gradient</td><td>Eppendorf AG, המבורג, גרמניה</td><td>5331 000.010</td><td></td></tr><tr><td>Mx3000P מערכת PCR בזמן אמת</td><td>Stratagene, ארה"ב</td><td>401403</td><td></td></tr><tr><td>Agagel סטנדרטי אופקי ג'ל אלקטרופורזה תא</td><td>ביומטריה</td><td>הופסק</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור</td><td>aura optik gmbh</td><td>aureka</td><td>מצויד במיקרו-מלקחיים</td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>קרל זייס מיקרוסקופיה, יינה, גרמניה</td><td>SteREO Lumar.V12</td><td>מצויד בסט מסנני AxioCam</td></tr><tr><td>Lumar 01</td><td>Carl Zeiss, מיקרוסקופיה, יינה, גרמניה</td><td>485001-0000-000</td><td>מסנן UV</td></tr><tr><td>סט מסנני Lumar 09</td><td>Carl Zeiss, מיקרוסקופיה, יינה, גרמניה</td><td>485009-0000-000</td><td>מסנן ללא UV</td></tr></tbody></table>

בידוד של בלוטות רב-תאיות בנות קיימא מרקמת הצמח הטורף, nepenthes

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

לצמחים רבים יש מבנים מיוחדים המעורבים בייצור והפרשה של תרכובות וחלבונים ספציפיים בעלי משקל מולקולרי נמוך. מבנים אלה ממוקמים כמעט תמיד על משטחי הצמח. ביניהם נקטריות או טריכומות בלוטות. התרכובות המופרשות משמשות לעתים קרובות באינטראקציות עם הסביבה הביוטית, למשל כמושכים למאביקים או מרתיעים מפני אוכלי עשב.
בלוטות ייחודיות בכמה היבטים ניתן למצוא בצמחים טורפים. במה שמכונה צמחי כד מהסוג Nepenthes, בלוטות דו-תפקודיות בתוך מלכודת המלכודת מפרישות מצד אחד את נוזל העיכול, כולל כל האנזימים הדרושים לעיכול הטרף, ומצד שני קולטות את חומרי המזון המשוחררים. לפיכך, בלוטות אלו מייצגות רקמה אידיאלית ומיוחדת שנועדה מראש לחקור את המנגנונים המולקולריים, הביוכימיים והפיזיולוגיים הבסיסיים של הפרשת חלבון וספיגת חומרים מזינים בצמחים. יתר על כן, בדרך כלל ניתן לחקור את הביוסינתזה של תרכובות משניות המיוצרות על ידי צמחים רבים המצוידים במבנים בלוטיים ישירות בבלוטות.
על מנת לעבוד על מבנים מיוחדים כאלה, הם צריכים להיות מבודדים ביעילות, במהירות, פעילים מטבולית וללא זיהום ברקמות אחרות. לכן, פותחה טכניקת מיקרו-הכנה מכנית ויושמה למחקרים על נוזל העיכול של נפנתס. כאן מוצג פרוטוקול ששימש להכנה מוצלחת של בלוטות דו-פונקציונליות בודדות ממלכודות Nepenthes, המבוססות על פלטפורמת מיקרו-דגימה ממוכנת. ניתן לבודד את הבלוטות ולהשתמש בהן ישירות לניתוח ביטוי גנים על ידי טכניקות PCR לאחר הכנת RNA.

להכנת בלוטות בודדות מרקמת כד של Nepenthes, פותחה ויושמה טכניקה של מיקרודיסקציה מכנית. פלטפורמת המיקרו-הכנה צריכה להיות מצוידת בפינצטה מיקרוסקופית, המחוברת למיקרו-מניפולטור, אשר מופעל בתורו באמצעות פאנל בקרה. ניתן היה לכוון לבלוטות בודדות, הנראות תחת המיקרוסקופ, באמצעות הפינצטה שתפסה את רקמת הבלוטה והסירה אותה באופן מכני (איור 4A).
את הרקמה הגלנדולרית הועברה ישירות לנבובת PCR לצורך ניתוח המשכי (איור 4B). ניתן היה להבחין בהצלחת הסרת הבלוטות מכיוון שהיא ...

בלוטות צמחים הן מבנים מיוחדים האחראים על ביוסינתזה והפרשה של תרכובות רבות המעורבות באינטראקציות עם הסביבה הביוטית. כדי לאפשר מחקרים על תכונותיהם המולקולריות והביוכימיות, הוקמה טכניקת מיקרו-הכנה מכנית על מנת לבודד בלוטות בודדות פעילות מטבולית, כאן מהצמח הטורף Nepenthes.

בידוד של בלוטות רב-תאיות בנות קיימא מרקמת הצמח הטורף, Nepenthes

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. ...

מטרת השיטה המוצגת היא השגת בלוטות בודדות וטהורות מרקמה צמחית טרייה לצורך אנליזה מולקולרית. הדבר מבוצע תחילה על ידי קציר של כד מהצמח מהסוג nepenthe. לאחר מכן, הרקמה מקובעת ישירות על פלטפורמת דגימה מיקרוסקופית על קרח כדי לשמור על טריות הרקמה.במהלך הליך הדגימה המיקרוסקופית, בלוטות מבודלות באופן מדויק ומועברות לפ menutupל PCR לפני ביצוע ניתוח qPCR על החומר שנאסף. בסופו של דבר, טכנולוגיית דגימה מיקרוסקופית מכנית משמשת להשגת בלוטות בודדות וטהורות מצמחי napes במטרה לספק רקמה ספציפית לניתוח מולקולרי נוסף באופן מהיר ובמינימום פולשנות. צמחים טורפים הם מומחים בקרב הפלורה מכיוון שהם מסוגלים לעכל חלבון חיות.הידע שלנו לגבי האופן שבו תהליך זה פועל ברמה המולקולרית עדיין מוגבל. מודל טוב למתן מענה לשאלה זו הוא תמונת השילוב של תוספתן הגאוני, מכיוון שיש לו איברים מובחנים, תמונות המייצרות בלוטות, התורמות לתהליכי עיכול אלו. בתוספתן.בלוטות אלו ממוקמות בתוך התמונות למטה. לצורך אנליזה מולקולרית, יש לבודד מבנים רחבים ושטוחים אלו, שקוטרם כ-100 עד 200 מיקרומטרים, ישירות מרקמה טרייה. כדי להקשות על התהליך, הבלוטות מכוסות בכיסוי מגן.מכיוון שהמבנה דומה לחניה מכוסה (carport) ובשל כך נדרשו תצפיות תלת-ממדיות במהלך הדגימה, וכן כלי המסוגל לנוע בשלושה ממדים באופן עדין, למדנו שטכניקות המיקרו-דיסקציה הנוכחיות לא תוכננו ל

isolation-viable-multicellular-glands-from-tissue-carnivorous-plant

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בידוד של בלוטות רב-תאיות ברות-קיימא מרקמה של הצמח הטורף, Nepenthes

כאן אנו מתארים אסטרטגיה יעילה להסיר את משי לייצור בלוטות מהבטן של הנקבה עכבישים אלמנה שחורה. הליך זה מאפשר בידוד מהיר של משי לייצור שבע ברורים בלוטות באופן מטוהרים, תהליך חשוב עבור החוקרים ללמוד ייצור והרכבה עכביש המשי סיבים.

Microdissection של האלמנה השחורה עכביש המשי לייצור בלוטות

כאן אנו מראים הפרוטוקול שלנו לבידוד של תאי צינור בלוטה הבזליים וקנה נשימת submucosal מעכבר. גם אנחנו מדגימים את השיטה של ​​הזרקת תאי גזע לכרית השומן הגבה עכבר כדי...

בידוד של תאי בסיס ותאי בלוטת Duct Submucosal מעכבר קנה נשימה

סרטון זה מתאר שיטה לבידוד תאי אפיתל קיבה מרקמת הקרן האנושית. תאי האפיתל המבודדים יכולים לשמש כמודל במבחנה כדי לחקור את תפקידי הבקרה שלהם בפיזיולוגיה ובפתופיזיולוגיה של הקיבה.

בידוד בלוטות פונדיות קיבה: שיטה לבידוד בלוטות פונדיות מרקמת קיבה אנושית

אנו מתארים את הנתיחה של מערכת העצבים של ים הארנבת...

בידוד של נוירונים חושיים של<em&gt; Aplysia californica</em&gt; להקלטות מהדק תיקון של זרמי glutamatergic

מאמר זה מתאר שלוש הכנות מערכת עצבים באמצעות עלוקות: הקלטה תאית מהנוירונים בגרעיני הגחון, culturing נוירונים מגרעיני הגחון, והקלטה מתיקון של עור מעוצבבים למפה שדות חושיים.

תאית הקלטה, חושי שדה מיפוי, ונוירונים שזוהו Culturing בעלוקה, Medicinalis Hirudo</i

תרביות שמקורן בתאי גזע טומנות בחובן פוטנציאל אדיר למידול מחלות זיהומיות. כאן מתוארת תרבית של אורגנואידים בקיבה של עכברים ובני אדם שמקורם בתאי גזע בוגרים. האורגנואידים מוזרקים במיקרו עם פתוגן הקיבה הליקובקטר פילורי.

Organoids כמודל למחלות זיהומיות: התרבות של האדם וOrganoids הקיבה Murine וMicroinjection של הליקובקטר פילורי

כאן, אנו מציגים עבור בידודו של שלמה, שלמה עכבר פרוטוקול עטין לחקור מורפולוגיה ductal וביטוי מטריצה חוץ-תאית (ECM). בלוטות בטן העכבר #4 היו מופק עכברים nulliparous נקבה שבוע 8-10, קבוע בפורמלין במאגר נייטרלי, למחלקה והמוכתמות בעזרת אימונוהיסטוכימיה ECM חלבונים.

בידוד של בלוטות מוגדלות ללא פגע, כל עכבר לניתוח של בלוטת מורפולוגיה וביטוי מטריצה חוץ-תאית

כאן נתאר פרוטוקול על יצירה וערבה culturing האדם ואת העכבר-נגזר תלת-ממדי (3D) קיבה organoids, ואת שיטת להעברת organoids תלת-ממד טפט 2-ממדי. השימוש טפט אפיתל הקיבה כמו assay הרומן פצע שריטה ללימודי התחדשות גם מתואר.

העכבר ואת האדם-נגזר תרבות ראשי קיבה אפיתל חד שכבתי לצורך המחקר של התחדשות

אנו מציגים שיטה לבידוד וטיפוח תאים האפיתל בלוטת הרוק העיקרי של האדם. תאים אלה התערוכה ביטוי גנים דפוסי עקבי עם אותם להיות של מוצא האפיתל הרוק ניתן לגדל כמו כדורי הריר על מטריצות קרום מרתף נגזר אנגלברב-הולם-בתאי הגידול נחיל או כמו monolayers על מנות תרבות מטופלים.

בידוד של תאים אפיתל הרוק מן הרוק בלוטות האדם עבור צמיחה מחוץ לתחום כמו סאליספירות או Monolayers

מוצג פרוטוקול לבידוד והעשרה נוחים ובעלי תפוקה גבוהה של גבעול קפיטט בלוטי וטריכומות ססיל מקנאביס סאטיבה. הפרוטוקול מבוסס על מיצוי יבש ללא חיץ של טריכומות באמצעות חנקן נוזלי בלבד, קרח יבש ומסננות ניילון ומתאים למיצוי RNA וניתוח שעתוק (transcriptomic analysis).

בידוד לא מימי והעשרה של גבעול קפיטט בלוטי וטריכומות ססילה מקנאביס סאטיבה

פותחה גישה איתנה וניתנת לשחזור להקמת תרביות ראשוניות דו-ממדיות של תאי גלומרולוזה וזונה פאסיקולטה מועשרים לקורטקס האדרנל של העכבר. מערכת זו שומרת על תכונות מולקולריות ותפקודיות מרכזיות של כל אזור, ומאפשרת חקירה ממוקדת של מסלולי איתות, ייצור הורמונים והתנהגות תאי אדרנל קורטיקס מחוץ לחיים.

הקמת תרבויות ראשוניות מועשרות אזורים מקורטקס אדרנל העכברים

למדו שיטת מיקרו-דגימה מכנית לבידוד בלוטות פעילות מטבולית מצמח הטורף Nepenthes. שיטה זו מאפשרת ניתוח מולקולרי מדויק של מבנים המייצרים תרכובות ביוכימיות ייחודיות.

בידוד של בלוטות רב-תאיות בנות קיימא מרקמת הצמח הטורף, Nepenthes

גלה סרטונים נוספים