באמצעות שבבי מיקרופלואידיקה עבור הדמית חיה וחקר תגובות פגיעה ב דרוזופילה זחלים
7 בפברואר 2014
זחלי דרוזופילה הם מערכת מודל אטרקטיבית עבור הדמיה חיה בשל הציפורן השקופה שלהם וגנטיקה חזקה. פרוטוקול זה מתאר כיצד לנצל את מכשיר PDMS שכבה אחת, שנקרא 'שבב הזחל' עבור הדמיה חיה של תהליכים תאיים בתוך הנוירונים של 3 זחלי דרוזופילה instar rd.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לשתק באופן לא פולשני זחלי דרוזופילה להדמיה חיה באמצעות תא מיקרופלואידית שונה. שלישי בזחלי כוכבים ממוקם בשבב עם מעט שמן כדי לעזור לאטום את הזחלים. לאחר מכן, השבב מונח על גבי הזחלים כך שגופו נכנס לתא.
השבב מחובר למזרק כך שניתן יהיה ליישם ואקום. תנועתיות הזחלים מוגבלת, ומבנים בחלק הגחוני של החיה נדחפים קרוב להחלקת הכיסוי. באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, ניתן לדמות בקלות מבנים, כגון פרטים של מסופי אקסון נוירונים חושיים, והתחדשות של עצבים סגמנטליים לאחר נזק עצבי מושרא.
שיטות אחרות לשיתוק יוספה להדמיה חיה, אתר כלורופורם ענק או חומרי הרדמה ISO. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא נמנעת מענק הרעלים הללו, המפריעים לפיזיולוגיה של החיה. ויתרון נוסף מהיעדר רעלים הוא שהזחל GB בטוח ולעבוד איתו הקיבוע החזק מאפשר הדמיה של אירועים מהירים כגון הובלה אקסונלית מהירה יותר ושינויים בסידן התוך תאי.
ניתן לשתק זחל בודד ולצלם אותו בשבב מספר פעמים. זה מאפשר חיי זמן. הדמיה של תהליכים המתרחשים במהלך של עד 72 שעות התחל בהשגת שבב PDMS לדוגמה כדי לנסות פרוטוקול זה.
ניתן לקרוא הוראות כיצד להכין שבב A-P-D-M-S מתבנית SU 8 בפרוטוקול הטקסט באמצעות מחט חלוקה בגודל 21. תקעו חור ביציאת הוואקום של שבב ה-PDMS למיקרוסקופ הפוך. הסר מחט בגודל 23 מבסיסה, רכזת הנעילה באמצעות כמה פיתולים.
לאחר מכן הכנס את קצה המחט לחתיכה קטנה של צינור פוליאתילן כך שהצינור יכסה לפחות מילימטר מהמחט. השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את עודפי הצינור. זה משאיר טבעת פלסטיק שיכולה ליצור חותם.
הכנס את קצה המחט בגודל 23 לתוך החור של יציאת הוואקום. למיקרוסקופ זקוף, תקעו חור שני בצד שבב ה-PDMS עם מחט חלוקה בגודל 21. חור זה יספק גישה לחור הראשון מהצד.
לאחר מכן הכנס את קצה המחט בגודל 23 ואת טבעת הצינור לחור הצדדי. הנח פיסת סרט דו צדדי מעל החלק העליון של שבב ה-PDMS כדי לאטום את החור העליון. חבר צינור פוליאתילן באורך 20 ס"מ בין קצה המחט המוחדר ביציאת הוואקום של השבב לאחת היציאות של שסתום תלת כיווני.
לאחר מכן חבר מזרק של 20 מיליליטר לאחת משתי היציאות הנותרות של השסתום והשאיר את היציאה האחרונה פתוחה. נקה את שבב ה-PDMS בעזרת סרט דבק שקוף. חבר פיסת סרט לתחתית השבב
.ודא שהסרט נוגע בכל משטח ה-PDMS ולאחר מכן קלף את הסרט. חזור על שיטת ניקוי זו שלוש פעמים. מכיוון ששבב ה-PDMS ניתן לשימוש חוזר, חשוב מאוד להסיר שאריות שמן מכיוון שהוא יכול להשפיע על הידבקות ה-PDM לזכוכית העברת מזון מוקדם.
זחלי כוכב שלישי מהמזון לצלחת פטרי המכילה מים. אורכו חייב להיות בין 3.5 לארבעה מילימטרים כדי להתאים את השבב בצורה נכונה. רחצו את הזחלים כדי להסיר את מדיום התרבית.
לאחר מכן מנגן טיפה קטנה של שמן הילה פחמן 700 במרכז החלקה של כיסוי זכוכית באמצעות מלקחיים מרימים בעדינות זחלים שטופים. הניחו אותו בקצרה על מגבון קל משקל כדי להסיר אותו במגבת, ולאחר מכן העבירו אותו לשמן למשך 10 שניות. הטיפה צריכה להיות קטנה מספיק כך שקנה הנשימה של הזחלים לא יהיה מצופה.
לאחר מכן הניחו את הזחלים על פתק כיסוי זכוכית נקי לזמן קצר והעבירו אותו להחלקת כיסוי אחרת. ובכך מסירים עוד קצת שמן. שימו לב לכיוון הזחלים כדי לדמות את החוט העצבי והעצבים הסגמנטליים.
הצד הגחוני צריך להיות כלפי מטה. צינורות קנה הנשימה המזוהים בקלות צריכים להיות כלפי מעלה. כעת הניחו בעדינות את שבב ה-PDMS על גבי הזחלים.
יישר את הזחלים למרכז תא המיקרו. כשהחלק האחורי שלו מכוון לכיוון יציאת הוואקום, הזחל לא אמור לגעת בשולי החדר. לאחר היישור, דחוף את שבב ה-PDMS כנגד החלקת מכסה הזכוכית כדי להשיג אטימה טובה.
לאחר מכן בדוק שוב שהזחלים סגורים לחלוטין בתא המיקרו. כעת העבר את השסתום התלת-כיווני למזרק. החזק את מכלול ה-PDMS בחוזקה ומשוך את בוכנת המזרק כדי למשוך שניים עד 2.5 מילימטרים של אוויר עד שתורגש התנגדות.
ובכך נוצר ואקום. ואז כבה את השסתום. כדי לשמור על הוואקום בזהירות, בדוק שוב את הזחלים.
גופו צריך להיות משותק בתוך תא המיקרו, וקנה הנשימה צריך להיות גלוי. שאר שבב ה-PDMS צריך להיות במגע עם החלקת הכיסוי כיוונים כאלה אינם נכונים. עכשיו דמיינו את הזחלים.
אם משתמשים במיקרוסקופ זקוף, קבעו את הצד העליון של השבב לבמה בעזרת סרט דו צדדי. בסיום ההדמיה, שחרר את הוואקום. לאחר מכן נתק את שבב ה-PDMS מתלוש הכיסוי.
הזחל צריך להיות תנועה מיידית באמצעות מלקחיים. מחזירים את הזחלים לצלחת אגר מיץ ענבים להתאוששות. מניחים זחל מורדם בודד על צלחת אגר מיץ ענבים.
מתחת למיקרוסקופ הסטריאו, סובב את הצד הגחוני של החיה כלפי מעלה. כדי לדמיין את חוט העצב הגחוני ואת העצבים הסגמנטליים, ודא שהזחל אינו נייד לחלוטין. אתר את חוט העצב ובלוטות הרוק.
חשוב לא לפגוע במבנים אלה. אתר את קצה קטע הבטן השלישי. פציעה כאן פוגעת ברוב העצבים והיא הקלה ביותר להתרבות מבלי להרוג את החיה.
הפציעה יכולה להתבצע גם במקטעים אחוריים יותר באמצעות צמד כוכב מספר חמש, מלקחיים. צבט את העצבים הסגמנטליים בחוזקה דרך הציפורן למשך חמש עד 10 שניות. כאשר עושים זאת נכון, הקוטיקולה נשארת שלמה ודופן הגוף אינה מנוקבת.
מאסטריות תיקח תרגול לאחר שהפציעה הניחה את צד הגחון של החיה כלפי מטה על הצלחת הגדולה. הוא אמור להיות מסוגל להזיז את ראשו ולאכול. אם הפציעה הצליחה, אז המחצית האחורית של הזחלים תהיה משותקת.
שבב הזחל שימש להדמיית ההובלה בתיווך קינזין של שלפוחיות סינפטיות בתוך אקסונים היקפיים בודדים. תנועת דרגת האנטרו של שלפוחיות אלה נמדדה בכ-1.0 מיקרון לשנייה. התנועה לאחור הייתה ב-0.8 מיקרון לשנייה.
טכניקת הקיבוע שימשה למיקרו-כירורגיה בלייזר באמצעות לייזר צבע UV פועם. רמות הסידן נצפו בתאי עצב ספציפיים הודות לאינדיקטור מקודד גנטית. G camp 3.0 עליית סידן מזוהה לאחר נוירון תחושתי.
דנדריט עובר טרנסקטציה. מתן אפשרות לבעל החיים לנוח בין מפגשי הדמיה מאפשר לצפות באירועים תאיים לאורך זמן. לאחר ריסוק האקסונים של נוירונים מוטוריים אמריים, גדם האקסון הפרוקסימלי עבר נביטה חדשה.
בינתיים, האקסונים הדיסטליים יצרו דליות והפכו מקוטעים בתהליך של ניוון ולריאני. שימוש בשבב הזחל ניתן גם להמיר חלבונים פלואורסצנטיים in vivo. חלבון היתוך DRA שני אלפא טובולין המתבטא בתאי עצב חושיים מדרגה 4 הומר בפוטו בגופי התאים.
תוך יומיים, כמות משמעותית של חלבון שהומר לאור הועברה למסופי האקסונים של הנוירונים החושיים במרחק של כמילימטר מהמיקום המקורי בגוף התא. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בשבב הזחלים להדמיה חיה של זחלי דרוזופילה וכיצד לבצע פציעת ריסוק עצבים. לאחר שליטה בטכניקות אלה, ניתן למקם את הזחלים על המיקרוסקופ תוך דקות ספורות.
ריסוק העצבים מהיר באותה מידה. לכן, ניתן להשתמש בהליכים אלה לניסויים בקנה מידה גדול, כגון תארים גנטיים. ניתן להשתמש בשבב כדי לדמות מבנים בצד הגחון של זחלי הדרוזופילה.
אלה כוללים אך אינם מוגבלים לשרירים, סינפסות צומת עצב-שריר, נוירונים חושיים, עצבים היקפיים וחוט העצב הגחוני. הליך זה עשוי לשמש גם לביצוע הדמיה חיה של לב הזחל, בלוטות הרוק וקנה הנשימה. שבב הזחל המשמש בסרטון זה הוא בגודל של בעל חיים באורך שבין 3.5 לארבעה מילימטרים.
עבור הדמיה קטנה או גדולה יותר, ניתן ליצור בקלות שבב בעלי חיים עם תא קטן או גדול יותר. עיין בקובץ העיצוב המשלים ובהוראות להכנת שבבי PDMS. הוראות להכנת שבבי ה-PDMS כלולות בפרוטוקול הכתוב.
אנו יכולים לשלוח לך שבב לדוגמה אם תיצור איתנו קשר.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט שיטה לקיבוע לא פולשני של זחלי Drosophila לצורך דימוי חי באמצעות תא מיקרופלואידי משופר. הטכניקה מאפשרת תצפית על תהליכים תאיים בתוך נוירונים, במיוחד בהקשר של הובלה אקסונית וה 재생רציה של עצבים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- טכניקות של דימיון חי
רקע
- זחלי דרוזופילה (Drosophila) מהווים מודל בעל ערך לחקר תהליכים נוירונליים בשל השקיפות שלהם והקלות שבה ניתן לבצע בהם מניפולציות גנטיות.
- דימות חי (Live imaging) יכול לספק תובנות לגבי אירועים תאיים דינמיים בזמן אמת.
- שיטות מסורתיות של קיבוע כוללות לרוב חומרי הרדמה מזיקים שעלולים להשפיע על הפיזיולוגיה.
- פרוטוקול זה נועד לספק חלופה בטוחה יותר לדימות ללא שימוש בחומרים רעילים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לא פולשנית לקיבוע פשעים של Drosophila לצורך דימות.
- הסהלה של תצפית על מבנים ותהליכים נוירונליים.
- מתן אפשרות לדימות חוזר של אותה זחלה לאורך תקופות זמן ממושכות.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- שימוש בהתקן מיקרופלואידי מ-PDMS לקיבוע זחלים.
- הפעלת ואקום להגבלת תנועת הזחלים.
- דימוי באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי להדמיית מבנים עצביים.
- הכנה מפורטת של שבב ה-PDMS ומיקום הזחלים להשגת דימוי אופטימלי.
תוצאות עיקריות
- קיבוע מוצלח של זחלים ללא שימוש בחומרי הרדמה רעילים.
- דימוי ברור של קצוות אקסונים של נוירונים תחושתיים ושל התחדשות עצבים סגמנטלית.
- יכולת לביצוע דימוי במרווחי זמן (time-lapse) לאורך 72 שעות.
- הדגמה של הובלה של שלפוחיות סינפטיות המתווכת על ידי קינזין.
מסקנות
- התא המיקרופלואידי המשופר מספק שיטה בטוחה ויעילה לדימוי חי של פששני Drosophila.
- גישה זו מאפשרת לחקור אירועים נוירונליים מהירים ותהליכי התאוששות.
- ניתן להתאים את הפרוטוקול ליישומים שונים של דימוי במחקרים בתחום מדעי המוח.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית ניהולית
קיבוע לא פולשני של אורגניזמי מודל מאפשר דימוי לאורכי של תהליכים תאיים דינמיים ללא משתעלים פרמקולוגיים, ובכך תומך בהסרת סיכונים מכניסטיים במהלך תיקוף יעדים. שבב הזחלים מאפשר הפעלת סבבי דימוי חוזרים לאורך 72 שעות, דבר המאפשר הערכה של שינוע אקסונלי, תגובות לפגיעה והתחדשות במערכת רלוונטית פיזיולוגית. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי במודלים פרה-קליניים על ידי שימור הביולוגיה הטבעית במהלך תצפית על דינמיקה עצבית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה ישירה של הובלה אקסונית ואותות סיגנלינג של סידן בנוירונים.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי מתן אפשרות לדימות חוזר של אותה זחלה, כדי להעריך את המעורבות של המטרה ואת המודולציה של המסלול לאורך זמן.
- ערך ניבוי: מספק מדדים כמותיים של תנועת אורגנלה ותגובות המושרות על ידי פגיעה, ובכך משפר את מידת הוודאות לגבי המטרה בגילויים בתחום מדעי העצבים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מוכנות הבדיקה: מכינה מערכות ביולוגיות מתוקתקות לסריקה בהמשך התהליך על ידי קיבוע זחליים לצורך הדמיה עקבית וברזולוציה גבוהה של מבנים בבטן.
- שחזוריות: מאפשרת הכנה ואיטום סטנדרטיים של זחליים במיקרו-תאים של PDMS, ובכך מפחיתה שונות בבדיקות הדמיה של תאים חיים.
- סקביליות: מקלה על מחזורי קיבוע והדמיה מהירים, ובכך תומכת בהערכה בתושבה בינונית של הפרעות גנטיות או פרמקולוגיות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה תהליכי פגיעה ואבנייה של אקסונים הרלוונטיים למנגנונים של מחלות נוירודגנרטיביות.
- המשכיות תרגומית: מקשר בין דימוי של גילוי לבין תיקוף פרה-קליני באמצעות אפשרות למחקרי time-lapse של דגנרציה ואלריאנית (Wallerian degeneration) ונביטת אקסונים.
- קידום מותאם סיכון: תומך בהחלטות go/no-go על ידי כימות תגובות רגנרטיביות לעומת דגנרטיביות בעקבות פגיעת מעיכה של העצב.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow Integration)
שבב הזחלים משתלב בתהליכי עבודה של גילוי מוקדם על ידי אפשור דימות חי של תהליכים עצביים לפני זיהוי מובילים (lead identification), ובכך תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים במודלים המבוססים על Drosophila.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת היפותזות באמצעות דימוג ישיר של הובלת שלפוחיות המתווכת על ידי קינזין וזרימות סידן בנוירונים תחושתיים.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה באמצעות קיבוע הדיר וקרבה של הצד הגבאי לכיסית הזכוכית (coverslip) לצורך דימוג עקבי.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידה כמותית של קצבי הובלה אקסונלית (1.0 µm/s קדימה, 0.8 µm/s לאחור) וזיהוי שיאי סידן באמצעות אינדיקטורים מקודדים גנטית.
- מחקר תרגומי: מקשרת לעבודה פרה-קלינית על ידי מידול תגובות לפגיעה אקסונלית, כולל התנבטות (sprouting) ופרגמנטציה, לאורך טווחי זמן ממושכים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציבה את שבב המיקרופלואידיקה מ-PDMS כפלטפורמה רב-פעמית למחקרים לונגיטודיים לאורך מספר סבבי ניסויים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בתוצאות החיזוי על ידי כך שמאפשר תצפית על אירועים נוירונליים מהירים ללא הפרעה פיזיולוגית הנגרמת מהרדמה.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות באמצעות הכנה סטנדרטית של השבב, קיבוע מבוסס ואקום ופרוטוקולי ניקוי למניעת הפרעות משאריות שמן.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי אפשור שימוש חוזר בזחלים בודדים, ובכך מפחית את מספר בעלי החיים הדרושים למחקרים אורך.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים באמצעות דימות כמותי של מדדי דגנרציה ורגנרציה לאחר פגיעה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בהתקנים מיקרופלואידיים, תפעול מערכות ואקום ומיקרוסקופיה קונפוקאלית להשגת דימיון אופטימלי.
- תלוי בגישה לכלי יציקה של PDMS, פתחי ואקום מבוססי מזרק וצינורות פוליאתילן לאטימה ולחיבורים פלואידיים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים בהכנת הזחלים, במריחת השמן וביישור התא כדי להבטיח קיבוע עקבי.
- כולל שיקולי התאמה לגדלי זחלים שונים, הדורשים התאמת ממדי השבב בהתאם לאורך הגוף (3.5–4 mm עבור שבב סטנדרטי).
- כולל מגבלות מעשיות כגון הצורך להימנע מכיסוי של קשקשי הנשמה בשמן ולהבטיח אוריינטציה נכונה של הצד הבטני לצורך ויזואליזציה של חבל העצבים.
