ננו-חלקיקי PLGA הנוצרים על ידי תחליב יחיד או כפול עם ויטמין E-TPGS

המטרה הכללית של הליך זה היא ליצור ננו-חלקיקי פולימר בעלי גודל שניתן לכיוונון. זאת מושגים תחילה על ידי המסת הפולימר בממס אורגני והוספת תרופה או חומר פלואורסצנטי לכלילה. השלב השני הוא אמולסיית הפולימר עם פאזה מائية המכילה את חומר האמולסיה, ולאחר מכן אפשור התקשות החלקיקים בנפח מימי גדול יותר בעוד הממס מתהפער.

בשלב הבא, החלקיקים נשטפים, נאספים באמצעות סבוב (centrifugation) ועוברים ליופיליזציה (lyophilized) לצורך אחסון לטווח ארוך. השלב הסופי הוא אפיון גודל הננו-חלקיקים ומורפולוגיית הפני השטח באמצעות מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת או דימוי SEM. לבסוף, נעשה שימוש ב-SEM כדי להראות שניתן לשלוט בגודל הננו-חלקיקים על ידי שינוי ריכוז האמולסור.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול במגוון מחלות אנושיות, מכיוון שניתן להתאים את החלקיקים כך שיכמיסו ויספקו מגוון רחב של סוכנים טיפוליים לפעולה ממושכת ברקמה המטרה. הדגמה ויזואלית של שיטה זו היא קריטית.

שלבי האמולסיה קשים ללמידה מכיוון שהיבטים דקים של אופן היווצרות האמולסיה עשויים להשפיע באופן משמעותי על תכונות החלקיקים. כדי להתחיל בהכנת הננו-חלקיקים, העבירו כ-100 milligrams של polylactic co glycolic acid, הידוע גם כ-PLGA, לתוך מבחנה בנפח 13 על 100 millimeter. לאחר מכן, באמצעות פיפטה סרולוגית מזכוכית, העבירו 1 milliliter של ethyl acetate אל הדגימה, כסו את חלקו העליון של המבחנה בנייר אלומיניום, ואז הדקו את הנייר באמצעות para film.

יש להדק את ה-Parafilm היטב לאורך הקצה העליון של הבקבוק והקצה התחתון של הרדיד כדי למנוע התאיידות של הממס. סמנו את מפלס הממס על מבחנה והמתינו שהפולימר יתמוס במהלך הלילה. למחרת, הוסיפו ממס נוסף אם התרחשה התאיידות כלשהי.

הכינו את הציוד והחומרים הבאים במכסה פuming (fume hood) קרוב למכשיר האולטרסאונד: וורטקס, שתי פיפטות זכוכית קטנות עם בלוני גומי ופלטת ערבוב מגנטית. בנוסף, הניחו ביקר גדול מלא במי קרח על מעמד מתחת למכשיר האולטרסאונד.

בשלב הבא, הוסיפו 45 milliliters של 0.3% weight per volume של vitamin E-T-P-G-S לכלי זכוכית בנפח 200 milliliter, ולאחר מכן הגדירו את מהירות הערבוב ל-360 RPM. לאחר מכן, הוסיפו two milliliters של 0.3% weight per volume של vitamin E-T-P-G-S למבחנה מזכוכית במידות 13 על 100 millimeter. כדי לערבב חומרים הידרופוביים, הוסיפו את חומר המעטפה ישירות לתמיסת הפולימר, תוך הקפדה להימנע ממגע עם דפנות המבחנה, וערבבו באמצעות וורטקס (vortex) עד שחומר המעטפה יתפזר באופן הומוגני.

עבור סוכנים הידרופיליים, בצעו אמולסיה של החומר המעטף עם תמיסת הפולימר. הוסיפו עד 50 µL של התרופה בבופר למשטח תמיסת הפולימר. בצעו סוניקציה לתערובת על קרח למשך כ-10 שניות או עד שהתמיסה הופכת אטומית והומוגנית.

לאחר מכן, ערבבו במערבל (vortex) במהירות גבוהה את מבחנה הבדיקה המכילה vitamin E-T-P-G-S כאשר המבחנה מוחזקת בצורה אנכית. החזיקו את פפטת פסטור הזכוכית במרחק של סנטימטר אחד עד שניים מעל פה המבחנה הנערבבת, והוסיפו באיטיות את תמיסת הפולימר בטפטוף אל פני הנוזל במבחנה. הקפידו שהפפטה לא תיגע בדפנות המבחנה לאחר הוספת כל תמיסת הפולימר.

המשיכו בערבוב התמיסה במכשיר הוורטקס. כעת צרו אמולסיה למשך 15 שניות. העבירו מיד את הפולימר שעבר אמולסיה למכשיר האולטרסוניקטור.

השאירו את מבחנה הבדיקה טבולה במי קרח ובצעו סוניקציה לאמולסיה בשלושה פרקים של 10 שניות כל אחד. הניעו את האמולסיה מעלה ומטה סביב הפרובה כדי להבטיח סוניקציה אחידה, והימנעו ממגע של הפרובה עם דפנות המבחנה או תחתיתה. המתינו חמישה עד 10 שניות בין כל פרק סוניקציה של 10 שניות כדי לאפשר לתמיסה להתקרר לפני ההמשך.

לאחר מכן, הוסיפו לאמולסיה מיליליטר אחד עד שניים של 0.3% vitamin E-T-P-G-S מתוך תמיסת הבחישה. פעולה זו תדלל את הפולימר שעבר אמולסיה ותקל על מזיגתו; שפכו את האמולסיה אל תוך תמיסת הבחישה. שטפו כל שארית של תמינה מהמבחנה אל תוך תמיסת הבחישה.

אפשרו לננו-חלקיקים להתקשות על ידי ערבוב למשך שלוש שעות. אם החומר העוטף רגיש לאור, עטפו את הכלי בנייר אלומיניום והשאירו את החלק העליון פתוח כדי להקל על אידוי הממס. כדי לאסוף את הננו-חלקיקים, התחילו בחלוקת תמיסת הננו-חלקיקים לשתי מבחנות צנטריפוגה מסוג Oak Ridge בנפח נומינלי של 30 מיליליטר, והמתיקו את משקלן כך שההפרש ביניהן לא יעלה על 0.1 גרם. לאחר מכן, סובבו את הננו-חלקיקים בצנטריפוגה עם רוטור בזווית קבועה למשך 15 דקות במהירות של 17,000.

RC f. זמני צנטריפוגציה ממושכים יותר יביאו לאיסוף של פראקציה גבוהה יותר של ננו-חלקיקים קטנים יותר. השליכו את supernatant תוך הקפדה לא להפריע למשקע (pellet) של הננו-חלקיקים.

הוסיפו חמישה מיליליטרים של מים מזוקקים והשתמשו במקבץ מים, שייקר (rotor) וערבוב במערבל (vortex) כדי להשהות את הננו-חלקיקים באופן מלא. העבירו את התוכן של שתי מבחנות הצנטריפוגה לאחת והוסיפו 20 מיליליטרים של מים מזוקקים לנפח סופי של 30 מיליליטרים. לאחר מכן, חזרו על שלבי הצנטריפוגה והשטיפה פעמיים נוספות, לסך הכל שלושה שטיפות.

נפח הנוזל של תרחיף הריסוס (Resus) של המשקע האחרון צריך להיות ארבעה עד חמישה מיליליטרים. הקפיאו מנה קטנה של ננו-חלקיקים ללא טלוס (telos) לצורך דימות SEM בנפרד מהשאר. הוסיפו יחס משקלי של TLO לפולימר של 1:2 כחומר מגן מפני הקפאה (cryoprotectant) לצורך ריסוס אחיד ומלא של ננו-חלקיקי PLGA.

פעולה זו תמנע היווצרות גבישי קרח העלולים לפגוע במשטח החלקיקים ולגרום לאגרגציה. העבירו את הננו-חלקיקים למבחנת צנטריפוגה של 5 מיליליטר שנשקלה מראש, ולאחר מכן הקפיאו בטמפרטורה של 80°C- למשך 30 דקות לפחות. לאחר מכן, הסירו את מכסה המבחנה וכסו את פיה באמצעות נייר סופג למעבדה המקובע בגומייה.

פעלו במהירות כדי למנוע המסה של התוכן אם מתרחשת המסה כלשהי. הקפיאו שוב לפני ההכנסה לליופיליזטור, ובצעו ליופיליזציה לדגימה בנפח של 5 mL למשך 72 שעות. לאחר מכן, החזירו את המכסה ועטפו את המבחנה ושמרו את החלקיקים הליופיליים בטמפרטורה של 80- °C.

ביום הצילום, הניחו פס של סרט פחמן דו-צדדי על תושבת SEM. סמנו את החלק המתכתי של התושבת באמצעות טוש קבוע לצורך זיהוי מאוחר יותר. השתמשו במרית מתכת כדי לאסוף כמות קטנה של ננו-חלקיקים בליאופילציה (lyophilized) ופזרו אותם בעדינות על פני הסרט.

נקו את פני השטח של הבסיס (stub) באמצעות נייר סופג למעבדה או השתמשו באוויר דחוס כדי להסיר ננו-חלקיקים רופפים. הדמיות של החלקיקים תתבצע באמצעות מרחק עבודה של 5 עד 15 מילימטרים של הקרן, מתח של 5 עד 12 kilovolts, וגודל נקודה (spot size) של 1 עד 3; מתחים גבוהים יותר עלולים לגרום לחימום אזורי של הדגימה, דבר שישנה את המורפולוגיה של פני השטח של החלקיקים. מיקרו-חלקיקים נצפים בהגדלה של 100 פעמים, וננו-חלקיקים יהיו ניתנים להבחנה בהגדלה של 3000 פעמים.

התמקדות בהגדלה בחלקו העליון של כדור כדי לאתר חלקיקים שניתן להדמות בקלות באמצעות SEM; יש לאסוף לפחות שלוש תמונות לכל סדרה כדי להשיג מדגם מייצג של גודל ומורפולוגיית החלקיקים. באמצעות שיטה זו, ניתן ליצור חלקיקים באמצעות פליטה בודדת המופיעים ככדורים נפרדים שאינם מאוחדים, בעלי מורפולוגיית שטח חלקה ומגוון רחב של גדלים המפוזרים לאורך המדגם. למיקרוחלקיקים המוצגים כאן יש קוטר ממוצע של 730 nanometers.

מוצגות כאן ננו-חלקיקים שנוצרו באמצעות אמולסיה אחת המכמיסים את התרופה ההידרופובית campin. חלקיקים אלו התקבלו בגודל קטן אף יותר, עם קוטר ממוצע של 340 nanometers. ריכוזים גבוהים יותר של חומר אמולסיה הניבו חלקיקים קטנים יותר, כאשר הקטרים הממוצעים פחתו מ-2000 ל-200 nanometers.

ככל שריכוז האמולסיפייר עלה מ-0.01 ל-0.3%, כפי שמוצג בתמונות ה-SEM כאן. עם זאת, כאשר ריכוז ה-vitamin E-T-P-G-S היה גבוה מדי, חלקיקים נפרדים לא נוצרו; כאשר נעשה שימוש ב-1% vitamin E-T-P-G-S, נמצאו מיזוגים כבדים ומבנים דמויי דפים לאורך כל המבנה. נכון. ברגע שלמדתם כיצד לייצר ננו-חלקיקי PLG באמצעות אמולסיה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון שינוי שטח פנים, כדי להנדס ננו-חלקיקים המיועדים לאינטראקציה עם סוגי תאים ספציפיים או אזורים מסוימים בגוף.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להניב חלקיקים בגודל הדי and ניתן לכיוון באמצעות אמולסיה.