Name: ננו-חלקיקי PLGA הנוצרים על ידי תחליב יחיד או כפול עם ויטמין E-TPGS (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-27T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: למדו לייצר ננו-חלקיקי PLGA בגדלים מתכווננים באמצעות אמולסיה עם ויטמין E-TPGS. שיטה זו מאפשרת שליטה בגודל החלקיקים מ-220 ננומטר עד 1.98 מיקרומטר ליישומי סיוע תרופתי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. הכנת ננו-חלקיקים
כל השלבים הכרוכים בממס או פולימר מומס/מתחלב צריכים להתבצע במכסה אדים כימי.
<ol>
	<li>שקלו 100 מ"ג (+/- 5 מ"ג) של פולי (חומצה לקטית-קו-גליקולית) (PLGA) והניחו במבחנה בגודל 13 מ"מ x 100 מ"מ.</li>
	<li>העבירו ממס של 1 מ"ל (אתיל אצטט (EtAc) או דיכלורומתאן (DCM)) לדגימה בעזרת פיפטה סרולוגית מזכוכית.</li>
	<li>מכסים את החלק העליון של הצינור בחתיכה קטנה של נייר אלומיניום, ועושים פרפילם היטב את נייר הכסף, והקפידו לעטוף את הפרפילם בחוזקה על פני הקצה העליון של הבקבוקון כמו גם על הקצה התחתון של נייר הכסף.</li>
	<li>סמן את מפלס הממס בחלק החיצוני של המבחנה. הניחו לפולימר להתמוסס למשך הלילה, והוסיפו ממס נוסף למחרת אם מתרחש אידוי. 
	הערה: ניתן להמיס פולימר גם ביום הכנת הננו-חלקיקים, במידת הצורך. בצע את שלבים 1.1-1.3, ולאחר מכן מערבולת גבוהה עד שכל הפולימר נמס לחלוטין (~10 דקות).</li>
	<li>הכן פינת עבודה במכסה האדים עם הציוד/החומרים הבאים ליד האולטרה-סוניקטור: מערבולת, שתי פיפטות פסטר זכוכית קטנות עם נורות גומי וצלחת ערבוב מגנטית. הניחו גדולה מלאה במי קרח על מעמד מתחת לאולטרה-סוניקטור.</li>
	<li>הוסף 45 מ"ל של 0.3% w/v ויטמין E-TPGS לכוס זכוכית של 200 מ"ל עם מוט ערבוב מגנטי והגדר את מהירות הערבוב ל-360 סל"ד.</li>
	<li>יש להוסיף 2 מ"ל של 0.3% משקל/נפח ויטמין E-TPGS למבחנה מזכוכית בגודל 13 מ"מ x 100 מ"מ.</li>
	<li>הוספת תרופה: 
	עבור חומרים הידרופוביים: הוסף אנקפסולנט ישירות לתמיסת הפולימר (היזהר להימנע מדפנות המבחנה) ומערבל את הצינור עד שהאנקפסולנט מתפזר בצורה הומוגנית. 
	עבור חומרים הידרופיליים: מתחלב אנקפסולנט עם תמיסת הפולימר לפני שתמשיך. הוסף עד 50 מיקרוליטר תרופה במים או חיץ לפני השטח של תמיסת הפולימר. אולטרסאונד לזמן קצר כדי לחלב את התרופה עם פולימר (בדרך כלל 10 שניות, או לפי הצורך כדי להשיג תמיסה הומוגנית ואטומה). שלב סוניקציה זה צריך להתבצע על קרח.</li>
	<li>הנח את הפולימר/אנקפסולנט הצינור הפתוח ליד המערבולת. תוך כדי החזקת המבחנה המכילה ויטמין E-TPGS אנכית ובמערבולת גבוהה, השתמש בפיפטה מזכוכית של פסטר כדי להוסיף את תמיסת הפולימר/אנקפסולנט בטיפה. היזהר להימנע מדפנות הצינור ולהפיל את תמיסת הפולימר ישירות על פני השטח של מתחלב המערבולת. לאחר הוספת כל 1 מ"ל תמיסת הפולימר לויטמין E-TPGS, המשיכו מערבולת התמיסה (כעת תחליב) למשך 15 שניות נוספות.</li>
	<li>העבר מיד את הפולימר המתחלב לאולטרה-סוניקטור. שמור את המבחנה שקועה במי קרח ועשה סוניקציה של האמולסיה בשלושה התפרצויות של 10 שניות (40% משרעת עבור סוניקטור של 700 וואט, 1/8 בגודל קצה הבדיקה). הזז את האמולסיה למעלה ולמטה בבדיקה כדי להבטיח סוניקציה אחידה, היזהר להימנע מנגיעה בבדיקה בצידי או בתחתית המבחנה. השהה בין כל סוניקציה של עשר שניות כדי לאפשר לתמיסה להתקרר לפני שתמשיך.</li>
	<li>הוסף 1-2 מ"ל של 0.3% ויטמין E-TPGS מתמיסת הערבוב לאמולסיה בעזרת פיפטת פסטר מזכוכית, המדללת את הפולימר המתחלב כך שהוא יישפך ביתר קלות. רוקנו את האמולסיה לתמיסת הערבוב. חזור על שלב זה כדי לשטוף את כל התמיסה שנותרה מהמבחנה לתמיסת הערבוב.</li>
	<li>הניחו לננו-חלקיקים להתקשות תוך כדי ערבוב במשך שלוש שעות. אם האנקפסולנט רגיש לאור, הכוס עשויה להיות עטופה בנייר אלומיניום, ולהשאיר את החלק העליון פתוח כדי להקל על אידוי הממס.</li>
</ol>
2. אוסף ננו-חלקיקים
<ol>
	<li>פצלו את הננו-חלקיקים המוקשים לשני צינורות צנטריפוגה של אוק רידג' (נפח נומינלי של 30 מ"ל) ואזנו לטווח של 0.1 גרם.</li>
	<li>ננו-חלקיקי צנטריפוגה ברוטור בזווית קבועה למשך 15 דקות ב-17,000 x g. זמני צנטריפוגה ארוכים יותר יביאו לאיסוף של חלק גבוה יותר של ננו-חלקיקים קטנים יותר.</li>
	<li>השליכו את הסופרנטנט, היזהרו לא להפריע לכדור הננו-חלקיקים (ניתן לשפוך מים או לשפוך אותם). הוסף 15 מ"ל diH2O והשתמש בסוניקטור אמבט מים ו/או מערבולת כדי להשעות לחלוטין את הננו-חלקיקים.</li>
	<li>שלב את תכולת שני צינורות הצנטריפוגה לאחד וחזור על שלבים 2.1-2.3 פי 2 יותר, בסך הכל שלוש שטיפות ב-30 מ"ל של diH2O בכל פעם. נפח הנוזל של תרחיף הגלולה האחרון צריך להיות 4-5 מ"ל. 
	ניתן להוסיף יחס משקל של 1:2 טרהלוז: פולימר בשלב זה כחומר קריופרוטקטנט (להקפיא כמות קטנה של ננו-חלקיקים ללא טרהלוז להדמיית SEM). גבישי קרח הנוצרים במהלך תהליך ההקפאה עלולים לפגוע במשטח החלקיקים ולגרום לצבירה, והכללת טרהלוז הוכחה כמשפרת את ההשעיה האחידה והמלאה של ננו-חלקיקי PLGA13.</li>
	<li>העבירו את הננו-חלקיקים לצינור צנטריפוגה שקול מראש של 5 מ"ל והקפיאו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות.</li>
	<li>נע במהירות כדי לא לתת לתוכן הקפוא להימס, פתח את המכסה של הצינור וכסה את החלק העליון על ידי אבטחת רקמת מעבדה לרוחב החלק העליון עם גומיה. **אם מתרחשת התכה כלשהי, הקפיאו מחדש לפני הכנסתם לליופילייזר.</li>
	<li>ליופיליזציה למשך 72 שעות לנפח של 5 מ"ל. אחסן חלקיקים ליופיליים בשפופרת עטופה בפרפילם בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>
3. גודל ומורפולוגיה של פני השטח
סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים
<ol>
	<li>יש להכין דוגמאות ל- SEM ביום ההדמיה. הניחו רצועת סרט פחמן דו צדדי על בדל SEM. ניתן להשתמש בטוש קבוע כדי לתייג את החלק המתכתי של הבדל לעיון מאוחר יותר.</li>
	<li>השתמש במרית מתכת כדי לאסוף כמות קטנה של ננו-חלקיקים ליופיליים ולפזר אותם בעדינות על פני הקלטת. צחצחו את פני השטח של הבדל ברקמת מעבדה או השתמשו באוויר דחוס כדי להסיר ננו-חלקיקים רופפים.</li>
	<li>מקרטעים את הדגימה בזהב-פלדיום למשך 30-120 שניות. זמן התזה ארוך יותר יפיק משטח חלק יותר להדמיה, אם כי הדבר עלול לגרום לאובדן פרטי משטח עדינים.</li>
	<li>פרמטרים אופייניים להדמיית חלקיקים הם מרחק עבודה של 5-15 מ"מ, חוזק אלומה של 5-12 קילו וולט וגודל נקודה של 1-3. עוצמות אלומה גבוהות יותר עלולות לגרום לחימום אזורי של הדגימה, מה שישנה את מורפולוגיה פני השטח של החלקיקים. מיקרו-חלקיקים נצפים בהגדלה של פי 100 וננו-חלקיקים יהיו ניתנים להבחנה בהגדלה של פי 3,000.</li>
	<li>המדגם האידיאלי יהיה מורכב מציפוי אחיד של חלקיקים על פני המשטח השטוח של הגבעול. לעיתים, מבנים משניים (כולל נתזים או כדורים) עלולים לנבוע מהליופיליזציה. התמקדות בקצה של פתית, היכן שהפתית פוגש סרט, או בחלק העליון של כדור תעזור לאתר חלקיקים שניתן לדמיין בקלות באמצעות SEM. אסוף לפחות שלוש תמונות לכל אצווה על מנת לקבל מדגם מייצג של גודל החלקיקים והמורפולוגיה.</li>
</ol>

<ol><li>Peer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanocarriers+as+an+emerging+platform+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy.</a> Nat. Nanotechnol. 2, 751-760 (2007).</li>
<li>Jiang, W., Gupta, R. K., Deshpande, M. C., Schwendeman, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+poly%28lactic-co-glycolic+acid%29+microparticles+for+injectable+delivery+of+vaccine+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Biodegradable poly(lactic-co-glycolic acid) microparticles for injectable delivery of vaccine antigens.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 57, 391-410 (2005).</li>
<li>Haag, R., Kratz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+therapeutics%3A+Concepts+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem%22%5BJournal%5D)">Polymer therapeutics: Concepts and applications.</a> Angew. Chem. 45, 1198-1215 (2006).</li>
<li>Tong, R., Cheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticancer+polymeric+nanomedicines%5BTitle%5D)+AND+%22Polym.+Rev%22%5BJournal%5D)">Anticancer polymeric nanomedicines.</a> Polym. Rev. 47, 345-381 (2007).</li>
<li>Kumari, A., Yadav, S. K., Yadav, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+polymeric+nanoparticles+based+drug+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surf.+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Biodegradable polymeric nanoparticles based drug delivery systems.</a> Colloids and Surf. B Biointerfaces. 75, 1-18 (2010).</li>
<li>Anderson, J. M., Shive, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradation+and+biocompatibility+of+PLA+and+PLGA+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Biodegradation and biocompatibility of PLA and PLGA microspheres.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 28, 5-24 (1997).</li>
<li>Jain, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+manufacturing+techniques+of+various+drug+loaded+biodegradable+poly%28lactide-co-glycolide%29+%28PLGA%29+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The manufacturing techniques of various drug loaded biodegradable poly(lactide-co-glycolide) (PLGA) devices.</a> Biomaterials. 21, 2475-2490 (2000).</li>
<li>Danhier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLGA-based+nanoparticles%3A+An+overview+of+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Rel%22%5BJournal%5D)">PLGA-based nanoparticles: An overview of biomedical applications.</a> J. Control. Rel. 161, 505-522 (2012).</li>
<li>Mu, L., Feng, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+controlled+release+formulation+for+the+anticancer+drug+paclitaxel+%28Taxol%29%3A+PLGA+nanoparticles+containing+vitamin+E+TPGS.%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Rel%22%5BJournal%5D)">A novel controlled release formulation for the anticancer drug paclitaxel (Taxol): PLGA nanoparticles containing vitamin E TPGS.</a> J. Control. Rel. 86, 33-48 (2003).</li>
<li>Mu, L., Feng, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLGA%2FTPGS+nanoparticles+for+controlled+release+of+paclitaxel%3A+effects+of+the+emulsifier+and+drug+loading+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">PLGA/TPGS nanoparticles for controlled release of paclitaxel: effects of the emulsifier and drug loading ratio.</a> Pharm. Res. 20, 1864-1872 (2003).</li>
<li>Collnot, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+E+TPGS+P-glycoprotein+inhibition+mechanism%3A+influence+on+conformational+flexibility%2C+intracellular+ATP+levels%2C+and+role+of+time+and+site+of+access%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Vitamin E TPGS P-glycoprotein inhibition mechanism: influence on conformational flexibility, intracellular ATP levels, and role of time and site of access.</a> Mol. Pharm. 7, 642-651 (2010).</li>
<li>Dintaman, J. M., Silverman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+P-glycoprotein+by+D-alpha-tocopheryl+polyethylene+glycol+1000+succinate+%28TPGS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of P-glycoprotein by D-alpha-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate (TPGS).</a> Pharm. Res. 16, 1550-1556 (1999).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly-penetrative%2C+drug-loaded+nanocarriers+improve+treatment+of+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A.%22%5BJournal%5D)">Highly-penetrative, drug-loaded nanocarriers improve treatment of glioblastoma.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. , (2013).</li>
<li>Cartiera, M. S., Johnson, K. M., Rajendran, V., Caplan, M. J., Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+uptake+and+intracellular+fate+of+PLGA+nanoparticles+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The uptake and intracellular fate of PLGA nanoparticles in epithelial cells.</a> Biomaterials. 30, 2790-2798 (2009).</li>
<li>Niwa, T., Takeuchi, H., Hino, T., Nohara, M., Kawashima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+submicron+carriers+for+peptide+drugs%3A+Preparation+of+dl-lactide%2Fglycolide+copolymer+%28PLGA%29+nanospheres+with+nafarelin+acetate+by+a+novel+emulsion-phase+separation+method+in+an+oil+system%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Biodegradable submicron carriers for peptide drugs: Preparation of dl-lactide/glycolide copolymer (PLGA) nanospheres with nafarelin acetate by a novel emulsion-phase separation method in an oil system.</a> Int. J. Pharm. 121, 45-54 (1995).</li>
<li>Ameller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyester-poly%28ethylene+glycol%29+nanoparticles+loaded+with+the+pure+antiestrogen+RU+58668%3A+physicochemical+and+opsonization+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Polyester-poly(ethylene glycol) nanoparticles loaded with the pure antiestrogen RU 58668: physicochemical and opsonization properties.</a> Pharm. Res. 20, 1063-1070 (2003).</li>
<li>Wischke, C., Schwendeman, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+encapsulating+hydrophobic+drugs+in+PLA%2FPLGA+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Principles of encapsulating hydrophobic drugs in PLA/PLGA microparticles.</a> Int. J. Pharm. 364, 298-327 (2008).</li>
<li>Batycky, R. P., Hanes, J., Langer, R., Edwards, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+theoretical+model+of+erosion+and+macromolecular+drug+release+from+biodegrading+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">A theoretical model of erosion and macromolecular drug release from biodegrading microspheres.</a> J. Pharm. Sci. 86, 1464-1477 (1997).</li>
<li>Panyam, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+degradation+and+in+vitro+release+of+a+model+protein+from+poly%28D%2CL-lactide-co-glycolide%29+nano-+and+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Rel%22%5BJournal%5D)">Polymer degradation and in vitro release of a model protein from poly(D,L-lactide-co-glycolide) nano- and microparticles.</a> J. Control. Rel. 92, 173-187 (2003).</li>
<li>Siepmann, J., Faisant, N., Akiki, J., Richard, J., Benoit, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+size+of+biodegradable+microparticles+on+drug+release%3A+Experiment+and+theory%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Effect of the size of biodegradable microparticles on drug release: Experiment and theory.</a> Journal of Controlled Release. 96, 123-134 (2004).</li>
<li>Desai, M. P., Labhasetwar, V., Walter, E., Levy, R. J., Amidon, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+uptake+of+biodegradable+microparticles+in+Caco-2+cells+is+size+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">The mechanism of uptake of biodegradable microparticles in Caco-2 cells is size dependent.</a> Pharm. Res. 14, 1568-1573 (1997).</li>
<li>Alexis, F., Pridgen, E., Molnar, L. K., Farokhzad, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+clearance+and+biodistribution+of+polymeric+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the clearance and biodistribution of polymeric nanoparticles.</a> Mol. Pharm. 5, 505-515 (2008).</li>
<li>Barichello, J. M., Morishita, M., Takayama, K., Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+hydrophilic+and+lipophilic+drugs+in+PLGA+nanoparticles+by+the+nanoprecipitation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Dev.+Ind.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of hydrophilic and lipophilic drugs in PLGA nanoparticles by the nanoprecipitation method.</a> Drug Dev. Ind. Pharm. 25, 471-476 (1999).</li>
<li>Mundargi, R. C., Babu, V. R., Rangaswamy, V., Patel, P., Aminabhavi, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano%2Fmicro+technologies+for+delivering+macromolecular+therapeutics+using+poly%28d%2Cl-lactide-co-glycolide%29+and+its+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Rel%22%5BJournal%5D)">Nano/micro technologies for delivering macromolecular therapeutics using poly(d,l-lactide-co-glycolide) and its derivatives.</a> J. Control. Rel. 125, 193-209 (2008).</li>
<li>Niwa, T., Takeuchi, H., Hino, T., Kunou, N., Kawashima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparations+of+biodegradable+nanospheres+of+water-soluble+and+insoluble+drugs+with+D%2CL-lactide%2Fglycolide+copolymer+by+a+novel+spontaneous+emulsification+solvent+diffusion+method%2C+and+the+drug+release+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Rel%22%5BJournal%5D)">Preparations of biodegradable nanospheres of water-soluble and insoluble drugs with D,L-lactide/glycolide copolymer by a novel spontaneous emulsification solvent diffusion method, and the drug release behavior.</a> J. Control. Rel. 25, 89-98 (1993).</li>
<li>Yang, Y. Y., Chia, H. H., Chung, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+preparation+temperature+on+the+characteristics+and+release+profiles+of+PLGA+microspheres+containing+protein+fabricated+by+double-emulsion+solvent+extraction%2Fevaporation+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Rel%22%5BJournal%5D)">Effect of preparation temperature on the characteristics and release profiles of PLGA microspheres containing protein fabricated by double-emulsion solvent extraction/evaporation method.</a> J. Control. Rel. 69, 81-96 (2000).</li>
<li>Yang, Y. Y., Chung, T. S., Ping Ng, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology%2C+drug+distribution%2C+and+in+vitro+release+profiles+of+biodegradable+polymeric+microspheres+containing+protein+fabricated+by+double-emulsion+solvent+extraction%2Fevaporation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Morphology, drug distribution, and in vitro release profiles of biodegradable polymeric microspheres containing protein fabricated by double-emulsion solvent extraction/evaporation method.</a> Biomaterials. 22, 231-241 (2001).</li>
<li>Zhang, Z., Feng, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+drug+encapsulation+efficiency%2C+in+vitro+drug+release%2C+cellular+uptake+and+cytotoxicity+of+paclitaxel-loaded+poly%28lactide%29-tocopheryl+polyethylene+glycol+succinate+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The drug encapsulation efficiency, in vitro drug release, cellular uptake and cytotoxicity of paclitaxel-loaded poly(lactide)-tocopheryl polyethylene glycol succinate nanoparticles.</a> Biomaterials. 27, 4025-4033 (2006).</li>
<li>Astete, C. E., Sabliov, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+PLGA+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomater.+Sci.+Polym.+Ed%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of PLGA nanoparticles.</a> J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 17, 247-289 (2006).</li>
<li>Gaumet, M., Gurny, R., Delie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+biodegradable+PLGA+particles+with+narrow+size+distributions%3A+Preparation+by+means+of+selective+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Fluorescent biodegradable PLGA particles with narrow size distributions: Preparation by means of selective centrifugation.</a> Int. J. Pharm. 342, 222-230 (2007).</li>
</ol>

לסופרים אין מה לחשוף.

חלקיקי PLGA מוכנים בדרך כלל על ידי תחליב יחיד או כפול, שיטה המספקת את היכולת להתאים אישית מאפייני חלקיקים כגון גודל, מעטפת ותכונות פני השטח7. מאפיינים אלה ואחרים תלויים במשתנים רבים, כולל סוג הממס, יחסי הזנה, שיטת תחליב וסוג מתחלב. עם זאת, מניסיוננו, זה אפשרי עבור נסיין יחיד לייצר חלקיקים בעלי תכונות עקביות. באמצעות אותו פרוטוקול, נסיין מאומן היטב ייצר שבע קבוצות נפרדות של ננו-חלקיקים בקטרים הממוצעים הבאים: 317 ננומטר±99, 342 ננומטר±112, 298 ננומטר±104, 361 ננומטר±110, 339 ננומטר±115, 360 ננומטר±123 ו-364 ננומטר±110. חישוב ממוצע של אצוות הנסיין המאומן היטב מניב קוטר ממוצע של 340 ננומטר±25 וסטיית תקן ממוצעת בתוך אצווה של 110 ננומטר±8. נסיין שני, שהוכשר על ידי הראשון, השתמש באותו פרוטוקול כדי לייצר ננו-חלקיקים בקוטר ממוצע של 328 ננומטר±138. עם זאת, נסיין שלישי, שייצר ננו-חלקיקים באופן עצמאי במשך מספר חודשים, פעל לפי אותו פרוטוקול כדי לייצר ננו-חלקיקים בקוטר ממוצע של 220 ננומטר±70. לפיכך, ניתן ליצור חלקיקים עם טווח קוטר צפוי, אך הדבר תלוי בשכפול מדויק של טכניקת ניסוי עדינה. איגום קבוצות עשוי לאפשר ייצור כמויות גדולות של ננו-חלקיקים בעלי תכונות מצטברות זהות. לדוגמה, כאשר אנו משנים את פני השטח של ננו-חלקיקים למחקר in vitro או in vivo , מכינים מספר (עד 6) קבוצות של 200 מ"ג (עד 6) מ"ג, נשטפות, נאספות, מעורבבות לצינור יחיד ולאחר מכן מחולקות לשינוי פני השטח. זה מבטיח שגודל הננו-חלקיקים, העמסת התרופות, המטען וחלק מאתרי פני השטח הזמינים לשינוי יהיו דומים בין שתי קבוצות טיפול. בדוגמה אחרת, אם המשתנה המעניין הוא יעילות תרופות עם חומרים שונים שנטענים לקבוצות שונות של ננו-חלקיקים, חשוב למדוד ולשלוט על השונות בהעמסת התרופות. זה קריטי למדוד את תכונות החלקיקים עבור כל אצווה של חלקיקים המיוצרים, ולתכנן ולשכפל ניסויים כדי לשלוט בשונות מאצווה לאצווה.
תחליב מלא של הפאזה האורגנית והמימית הוא קריטי ליצירת חלקיקים קטנים. פולי (אלכוהול ויניל) (PVA) הוא אולי המתחלב הנפוץ ביותר. אנו ואחרים השתמשנו במגוון חומרים מתחלבים ומייצבים, כולל ויטמין E-TPGS9, PVA14, טווחי15 ופולוקסמרים16 (לדיון מעמיק במגוון הרחב של חומרים המשמשים לייצור חלקיקי PLGA, ראה סקירה של Wischke et al.17). פולימר מתחלב כהלכה יופיע כתמיסה הומוגנית, לבנה-חלבית/אטומה. תחליב גרוע (או "שבור") יראה הטרוגניות או גרעיניות מקרוסקופית, והוא עשוי אפילו להיפרד לשתי שכבות נפרדות מבחינה ויזואלית בצינור. זה בדרך כלל מצביע על כישלון ביצירת ננו-חלקיקים. האמולסיה עלולה להישבר לאחר שלב 1.9 אם היא לא מועברת מיד לאולטרסאונד. אם זה קורה, מערבולת שוב עד להומוגנית והמשך מיד לסוניקטור. הפרדה לא אמורה להתרחש לאחר שלב הסוניקציה (1.10). לאחר שהחלקיקים התפזרו לנפח מימי גדול יותר (שלב 1.11), התמיסה צריכה להיות אטומה באופן אחיד עד מעט שקופה. איכות השקיפות תגדל ככל שגודל החלקיקים יקטן, וניתן להבחין בגוון כחול עבור ננו-חלקיקים קטנים מאוד. ייתכן שלא ניתן להבחין בגוון זה אם חלקיקים עוטפים תרופה. אם האמולסיה לא מצליחה להתפזר באופן אחיד לנפח המימי הגדול או נראית גרגירית, הניסוי לא אמור להמשיך. זה נורמלי להבחין בשונות מסוימת במראה של כדור החלקיקים, כמו גם בלכידותה. כדורים מסוימים עשויים להשעות מחדש עם מערבולת קלה, בעוד שאחרים עשויים לקחת מספר דקות של סוניקציה באמבט מים. ההשעיה לא אמורה להימשך יותר מ-5 דקות. חלקיקים ליופיליים עשויים לקבל מגוון מרקמים, מדמויי כותנה ועד לזרימה חופשית.
אחד היתרונות הרבים של PLGA כחומר ננו-חלקיקים הוא היכולת לייעל את תהליך הייצור כדי ליצור את גודל החלקיק הרצוי ליישום המיועד. ננו-חלקיקים גדולים יותר יעטפו חלק גבוה יותר של תרופה הידרופובית (יחסית למשקל הפולימר) מאשר ננו-חלקיקים קטנים, עם זאת, קינטיקה של שחרור תרופות עשויה להיות מושפעת גם18-20. לגודל הננו-חלקיקים יש השפעה ישירה על מנגנוני הפנמת החלקיקים על ידי התאים, כמו גם על פיזורם ברקמה, מה שעלול לגרום להבדלים דרמטיים ביעילות המסירה. לדוגמה, מערכת הפגוציטים החד-גרעיניים תתייג ותסיר חומרים במחזור מערכתי הגדולים מ-1 מיקרומטר. ננו-חלקיקים קטנים עשויים להיות מעניינים לעירוי ישיר למוח, שם ננו-חלקיקים גדולים יותר יילכדו במטריצה החוץ-תאית ההדוקה; אספקת ננו-חלקיקים קטנים עשויה גם להקל על מיקוד פסיבי של גידולים באמצעות אפקט החדירה והשמירה המשופר. יעילות עטיפת התרופה משתנה מאוד, בהתאם לתכונות התרופה הספציפית, גודל החלקיק והמתחלב (כלומר מסיסותו במים לעומת ממס). תחליב יחיד לעומת תחליב כפול ישפיע גם על העמסת תרופות וגודל ננו-חלקיקים. אנקפסולציה של חומרים הידרופוביים באמצעות תחליב יחיד עשויה לסייע בייצור ננו-חלקיקים קטנים במיוחד, בהשוואה לשיטת האמולסיה הכפולה. אנו מפנים את הקורא למקורות אחרים לדיון נרחב בנושא זה23-28. לבסוף, קיימות שיטות תחליב חלופיות, כולל הומוגניזציה במהירות גבוהה, וגישות אחרות אלה עשויות לספק יתרונות עבור סוגים ספציפיים של תרופות או יישומי העברת תרופות29.
שיטת האמולסיה הבודדת מהווה הזדמנות לשונות של מגוון רחב של משתני ניסוח, שכל אחד מהם מסוגל לשנות את תכונות הננו-חלקיקים. לדוגמה, שימוש בדיכלורומתאן (DCM) כממס במקום זאת ייצר בדרך כלל ננו-חלקיקים גדולים יותר עם התפלגות גודל רחבה יותר. מכיוון שאתיל אצטט (EtAc) ניתן לערבוב במים, מתח הפנים של טיפת הפולימר באמולסיה הראשונית יורד, ומייצר ננו-חלקיקים קטנים יותר. ניתן להחליף DCM באותו נפח של EtAc. ניתן להשתמש בממיסים חלופיים או בתערובות של ממיסים כדי לייעל את אנקפסולציית התרופות ותכונות החלקיקים. פרמטרי ניסוח אחרים מסוגלים גם לשנות את גודל החלקיקים: לדוגמה, הגדלת נפח הממס, יחס ממס: פולימר, עוצמת סוניקציה או מהירות/משך הצנטריפוגה יביאו כולם לירידה בגודל החלקיקים שנאספו. ניתן לשנות את גודל החלקיקים על ידי ביצוע צנטריפוגה רציפה (למשל צנטריפוגה מהירה במהירות נמוכה כדי להסיר תחילה חלקיקים גדולים יותר, ואחריה ספין ארוך יותר לאיסוף חלקיקים קטנים במיוחד) או סינון.
כאן, אנו מתארים פרמטרי ניסוח המאפשרים הכנת חלקיקי PLGA בקוטר ממוצע הנע בין 220 ננומטר ל-1.98 מיקרומטר. שיטות אלו לייצור חלקיקים המורכבים מ-PLGA עשויות לשמש לאופטימיזציה של עיצוב החלקיקים (גודל, מעטפת ותכונות פני השטח) ליישום עתידי של אספקת תרופות במבחנה או in vivo.

פולימרים הפכו פופולריים יותר ויותר לכלי אספקת תרופות בעשורים האחרונים ליישומים החל מטיפול ממוקד בגידולים1 ועד אפנון של מערכת החיסון2. תרופות עטופות בפולימר או מצומדות הן לרוב יעילות יותר ממקבילותיהן המועברות באופן חופשי, מכיוון שתרופות הקשורות לפולימר מוגנות מפני השפלה. הגנה זו מתורגמת למחצית חיים ביולוגית ארוכה יותר ויעילות משופרת פוטנציאלית עם תופעות לוואי מערכתיות מופחתות3-5.
Poly(חומצה לקטית-קו-גליקולית) (PLGA) מציגה רבות מהתכונות האידיאליות של מערכת אספקה ננומטרית, המספקת שחרור לטווח ארוך של החומר המכוסה ומתפרקת למוצרים התואמים ביולוגית של חומצה לקטית וגליקולית. מולקולות קטנות, חלבונים וחומצות גרעין העטופות ב-PLGA הראו פעילות משופרת במגוון יישומי מחלות8. חשוב לציין, פלטפורמת החומר מאפשרת התאמה אישית קלה של תכונות כגון גודל, מטען ותצוגת פני השטח של ליגנדים למיקוד חלקיקים לרקמות ספציפיות או למטרות הדמיה. מכיוון ש-PLGA כבר נמצא בשימוש בבני אדם בצורה של תפרים מתכלים (למשל Purasorb, Purac Biomaterials ו-Vicryl, Ethicon Inc.), הפוטנציאל לתרגום קליני הוא גבוה.
תחליב שמן-מים (יחיד) או מים-שמן-מים (כפול) היא שיטה אחת שבאמצעותה ניתן להשתמש ב-PLGA כדי לעטוף תרופות הידרופוביות והידרופיליות בצורה מיקרו או ננו. בקצרה, PLGA מומס לשלב אורגני (שמן) שמתחלב עם חומר פעילי שטח או מייצב (מים). תרופות הידרופוביות מתווספות ישירות לשלב השמן, ואילו תרופות הידרופיליות (מים) עשויות להיות מתחלבות תחילה עם תמיסת הפולימר לפני היווצרות החלקיקים. התפרצויות סוניקציה בעוצמה גבוהה מאפשרות היווצרות טיפות פולימר קטנות. את האמולסיה המתקבלת מוסיפים לשלב מימי גדול יותר ומערבבים במשך מספר שעות, מה שמאפשר לממס להתאדות. ננו-חלקיקים מוקשים נאספים ונשטפים על ידי צנטריפוגה (איור 1).
כאן, אנו מתארים טכניקה לייצור ננו-חלקיקי PLGA באמצעות תחליב יחיד וכפול, עם אתיל אצטט (EtAc) כממס וויטמין E-D-α-טוקופרול פוליאתילן גליקול סוקסינט (TPGS) כחומר מתחלב. השימוש בוויטמין E-TPGS מציע מספר יתרונות אפשריים על פני סוגים אחרים של חומרים מייצבים (למשל פולי (אלכוהול ויניל), PVA), כולל שיפור יעילות האמולסיה והאנקפסולציה. קבוצות אחרות דיווחו על יתרונות של ויטמין E-TPGS, כולל עיכוב של P-gp, חלבון פליטה טרנסממברני, שבדרך כלל מתבטא יתר על המידה בתאים סרטניים וידוע כתורם לעמידות לתרופות על ידי הוצאת תרופות מתאי המטרה. בנוסף, אנו מדגימים כיצד לאפיין ולהתאים את החלקיקים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) ומספקים הנחיות נוספות לגבי שינוי גודל באמצעות שינוי הפרוטוקול.

<table><tbody><tr><td>Poly(lactic co-glycolic acid)&amp;nbsp; (PLGA)</td><td><a href="http://www.absorbables.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Lactel</a></td><td>B6010-2P</td><td>צמיגות אינהרנטית: 0.55-0.75 dl/g</td></tr><tr><td>Ethyl acetate (EtAc)</td><td>Sigma</td><td>270989</td><td></td></tr><tr><td>Methylene chloride (DCM)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vitamin E TPGS</td><td>Sigma</td><td>57668</td><td></td></tr><tr><td>Poly(vinyl alcohol)</td><td></td><td></td><td>87-89% הידרוליזה, 30,000-70,000 Da</td></tr><tr><td>ציוד</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonic Dismembrator</td><td>Fisher Scientific</td><td>Model 705</td><td>700 W (Ultrasonicator)</td></tr><tr><td>ראש סוניקטור</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>1/8 in</td></tr><tr><td>ורטקסר</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>מערבל רב-מיקומי</td><td>Corning</td><td>MP5I</td><td></td></tr><tr><td>אולטרה-צנטריפוגה</td><td>Beckman-Coulter</td><td>L8-80M</td><td></td></tr><tr><td>רוטור בזווית קבועה</td><td>Beckman-Coulter</td><td>50.2TI</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר סוניקציה לאמבט מים</td><td>Fisher Scientific</td><td>FS30</td><td></td></tr><tr><td>ליופיליזטור</td><td>Millrock</td><td>BT85</td><td></td></tr></tbody></table>

ננו-חלקיקי plga הנוצרים על ידי תחליב יחיד או כפול עם ויטמין e-tpgs

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) הוא חבר ביו-תואם במשפחת הפוליאסטר האליפטי של פולימרים מתכלים. PLGA היא כבר מזמן בחירה פופולרית עבור יישומי אספקת תרופות, במיוחד מכיוון שהיא כבר מאושרת על ידי ה-FDA לשימוש בבני אדם בצורה של תפרים נספגים. תרופות הידרופוביות והידרופיליות עטופות בחלקיקי PLGA באמצעות תחליב יחיד או כפול. בקצרה, התרופה מומסת בפולימר או מתחלבת בפולימר בשלב אורגני שמתחלב לאחר מכן עם הפאזה המימית. לאחר התאדות הממס, חלקיקים נשטפים ונאספים באמצעות צנטריפוגה לליופיליזציה ואחסון לטווח ארוך. PLGA מתכלה לאט באמצעות הידרוליזה בסביבות מימיות, וחומרים עטופים משתחררים במשך תקופה של שבועות עד חודשים. למרות ש-PLGA הוא חומר בעל יתרונות רבים להעברת תרופות, היווצרות ניתנת לשחזור של ננו-חלקיקים יכולה להיות מאתגרת; שונות ניכרת מוצגת על ידי שימוש בציוד שונה, אצוות ריאגנטים ושיטת תחליב מדויקת. כאן, אנו מתארים בפירוט רב את היווצרותם ואפיונם של מיקרו-חלקיקים וננו-חלקיקים הנוצרים על ידי תחליב יחיד או כפול באמצעות חומר המתחלב ויטמין E-TPGS. מורפולוגיה וגודל של חלקיקים נקבעים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM). אנו מספקים תמונות SEM מייצגות עבור ננו-חלקיקים המיוצרים עם ריכוז מתחלב משתנה, כמו גם דוגמאות של חפצי הדמיה ואמולסיות כושלות. ניתן להתאים פרוטוקול זה בקלות לשימוש בחומרים מתחלבים חלופיים (למשל פולי (אלכוהול ויניל), PVA) או ממיסים (למשל דיכלורומתאן, DCM).

תמונות SEM מייצגות של מיקרו-חלקיקים וננו-חלקיקים של PLGA שהוכנו באמצעות פרוטוקול זה מוצגות באיורים 2a ו- 2b. החלקיקים יופיעו ככדורים בודדים שאינם מאוחדים, בעלי מורפולוגיית פני שטח חלקה ומגוון רחב של גדלים המפוזרים ברחבי הדגימה.
כדי לקבוע את הקוטר הממוצע של כל סדרה, נלקחות מדידות ישירות מתמונות ה-SEM באמצעות פונקציית ה-"measure" בתוכנת ImageJ. יש לבצע לפחות 150 מדידות של קוטר חלקיקים שנבחרו באופן אקראי משדה הראייה כדי להשיג התפלגות גדלים מייצגת. הגודל הממוצע של סדרת חלקיקים תלוי בפרמטרי הפורמולציה. לדוגמה, ב-Figure 2a, נוצרו מיקרו-חלקיקים (קוטר ממוצע של 730 nm±370) באמצעות 1 ml של ממס ל-100 mg של PLGA, תוך שימוש ב-0.05% Vitamin E-TPGS בפאזה האמולסיפית, בעוד שב-Figure 2b, נוצרו ננו-חלקיקים (קוטר ממוצע של 340 nm±70) באמצעות 4 ml של ממס ל-200 mg של PLGA, אשר הכילו את התרופה ההידרופובית camptothecin והשתמשו ב-0.3% Vitamin E-TPGS בפאזה האמולסיפית (פרמטרי פורמולציה מלאים מתוארים בכיתוב של האיור). באופן כללי, ריכוז גבוה יותר של חומר אמולסיפי יפיק חלקיקים קטנים יותר, כאשר ניתן להגיע לקטרים ממוצעים הנעים בין 220-2,000 nm על ידי שינוי ריכוז החומר האמולסיפי בין 0.3-0.01% (Figure 3).
הניב שלנו נע בין 74-98% (22 מנות של ננו-חלקיקים עם ממסים, פחיתים ותנאי אמולסיה משתנים, שהוכנו על ידי ניסוין בודד). ניבים גבוהים יותר עשויים להיראות במנות גדולות יותר (&gt;150 nm), מאחר שננו-חלקיקים קטנים אובדים בקלות במהלך שלב הצנטריפוגה והשטיפה, במיוחד כאשר תסנן השטיפה נשפכת מהמשקע. פיפטור זהיר של הנוזל יכול לסייע במניעת בעיה זו. מהירויות גבוהות יותר ו/או צנטריפוגה ממושכת יותר יכולים גם כן לשפר את הניב, הן על ידי שיפור האיסוף של הפракציה העל-קטנה של ננו-חלקיקים והן על ידי דחיסתן למשקע, כך שפחות יאבד בשלב השטיפה. הפרוטוקול המתואר כאן מתמקד בייצור חלקיקים עם TPGS כסוכן הפחית ו-EtAc כממס, עם זאת, ממסים ו/או סוכני פחית חלופיים הם אפשריים. באופן כללי, מצאנו ש-EtAc מייצר ננו-חלקיקים קטנים יותר ובגודל אחיד יותר מאשר DCM (למשל, קטרי של 540 nm±190 לעומת 2,160 nm±1,530 עבור EtAc לעומת DCM, 100 mg/ml PLGA בממס, שהועברו לאמולסיה ב-2 ml 0.1% TPGS), ככל הנראה משום ש-EtAc הוא מיסול במים, בעוד ש-DCM אינו כזה. PVA הוא סוכן פחית פופולרי ששימש באופן נרחב אותנו וקבוצות אחרות. הבחנו בשונות בננו-חלקיקים שהוכנו ממנות שונות של PVA זמין מסחרית. לכן, מומלץ לשקול שימוש באותו מלאי של PVA במידת האפשר כדי לשפר את השחזוריות. בניסיונינו, מצאנו כי PVA הוא פחית יעיל יותר בריכוזים גבוהים בהרבה מאשר TPGS (למשל, קוטר של 140 nm±48, 100 mg/ml PLGA ב-DCM, שהועברו לאמולסיה ב-2 ml 5% PVA).
אפיון ננו-חלקיקים באמצעות SEM עלול להיות מאתגר בשל הבדלים בציוד ובתהליך ההדמיה. לכן, חשוב להבחין בין מאפיינים מורפולוגיים המעידים על בעיות ביצירת החלקיקים לבין ארטיפקטים שנוצרו בטעות במהלך ההדמיה. בהדמיות SEM נצפים לעיתים התמזגות (איורים 4a ו- 4b), יצירת שקעים (איור 4c), או סדקים (איור 4f) בחלקיקים. ארטיפקטים אלו מעידים לעיתים על חלקיקים שנוצרו בצורה לקויה (לדוגמה, באיור 4a, ריכוז האמולסטור היה גבוה מדי מכדי ליצור חלקיקים נפרדים), אך הם עלולים לנבוע גם מארטיפקטים שנוצרו כתוצאה משיטת האפיון (לדוגמה, באיור 4b, הדגימה התחממה במהלך הציפוי בספוטר, ובאיור 4c, חימום מקומי מקרינת ה-SEM שינה את המורפולוגיה של פני השטח של החלקיקים במהלך ההדמיה). כדי למנוע ארטיפקטים של הדמיה, יש למזער את זמן הציפוי בספוטר ולשמור על עוצמת קרן נמוכה. מורפולוגיות חלקות יותר נצפות בזמני ספוטר ארוכים יותר, אולם הדבר עלול להוביל להתמזגות של חלקיקים. זמני ספוטר קצרים מדי עלולים להקשות על ההדמיה, שכן החלקיקים יטענו חשמלית ויזוזו במהלך לכידת התמונה. לכידה מהירה של תמונות תסייע למנוע חשיפה ממושכת לקרן ועיוות של התמונות (איורים 4d ו- 4e). חשיפה גבוהה לקרן עלולה להוביל גם להתפשטות וסדיקה של פני השטח של הננו-חלקיק (איור 4f). אם לא ניתן למזער ארטיפקטים מורפולוגיים על ידי שינוי פרמטרי האפיון, ייתכן שהם מייצגים בעיות ממשיות בננו-חלקיקים עצמם. במהלך תהליך הייצור, התמזגות עשויה לנבוע מחימום יתר עקב עוצמת אולטרסוניקציה גבוהה, התאיידות חלקית של הממס, רסוזפנזיה חלקית במהלך שלב השטיפה, או ליופיליזציה שנכשלה.
<img alt="תהליך הפרדת שמן ומים; סוניקציה, אידוי, איסוף; דיאגרמת ליופיליזציה." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51015/51015fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51015/51015fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="איור 1"> 
איור 1. תרשים של ייצור ננו-חלקיקים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51015/51015fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן להצגת תמונה גדולה יותר</a>.
<img alt="מבנה ננו-חלקיקים (SEM) והתפלגות גדלים (μm, nm), תרשים ניתוח השוואתי." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51015/51015fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51015/51015fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="איור 2"> 
איור 2. תמונות SEM והתפלגויות הגודל התואמות של מיקרו-חלקיקים וננו-חלקיקים של PLGA שהוצרו בשיטת האמולסיה הבודדת. ב- (A), החלקיקים נוצרו על ידי אמולסיה של 100 mg PLGA המומסים ב-1ml ethyl acetate לתוך 2 ml של 0.05% Vitamin E-TPGS, והקשיחו ב-45 ml של 0.01% Vitamin E-TPGS. התפלגות הגודל התואמת מוצגת ב- (C). ב- (B), החלקיקים נוצרו על ידי אמולסיה של 200 mg PLGA ו-40mg של camptothecin המומסים ב-4mL ethyl acetate לתוך 4 ml של 0.3% Vitamin E-TPGS, והקשיחו ב-90 ml של 0.3% Vitamin E-TPGS. התפלגות הגודל התואמת מוצגת ב- (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51015/51015fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן להצגת תמונה גדולה יותר</a>.
<img alt="ניתוח גודל חלקיקים; תרשים עמודות ותמונות SEM מראים את השפעת אחוז ה-TPGS על גודל המיקרוספירות." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51015/51015fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51015/51015fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="איור 3"> 
איור 3. גודל החלקיקים תלוי בריכוז האמולסור. העלאת ריכוז Vitamin E-TPGS הובילה לננו-חלקיקים קטנים יותר. מוצגים קטרי ממוצעים ותמונות SEM תואמות של חלקיקים שהוכנו על ידי אמולסיה של 100 mg של PLGA המומס ב-1 ml של ethyl acetate לתוך (A) 0.01%, (B) 0.05%, (C) 0.1%, או (D) 0.3% Vitamin E-TPGS והקשחה ב-45 ml של 0.3% Vitamin E-TPGS. פסי השגיאה מייצגים סטיית תקן של 200 מדידות קוטר שבוצעו משתי תמונות של סבב ייצור בודד. סרגל קנה המידה מייצג 5 μm (A-C) ו-200 nm (D).<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51015/51015fig3highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן להצגת תמונה גדולה יותר</a>.
<img alt="מיקרוגרף SEM המתאר מורפולוגיה של חלקיקים ואגרגציה. ניתוח מיקרומבנה של אבקה." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51015/51015fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51015/51015fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="איור 4"> 
איור 4. ארטיפקטים של מורפולוגיית פני השטח שנצפו ב-SEM. ב-(A), נצפו התמזגויות כבדות ומבנים דמויי גיליים לאורך כל הדגימה. ריכוז ה-Vitamin E-TPGS היה גבוה מדי (1%) כדי להיווצר חלקיקים נפרדים. ב-(B), חלק מאזורי הדגימה היו ממוזגים, עם זאת, נצפו כיסים גדולים של ננו-חלקיקים נפרדים, במיוחד במקומות שבהם היו פערים בציפוי ה-sputter. אנו סבורים כי ארטיפקטים של התמזגות אלו נובעים מחימום במהלך תהליך ציפוי ה-sputter. ב-(C), החלקיקים נראו בתחילה חלקים, אולם חשיפה ממושכת של הדגימה לקרן ה-SEM הובילה להיווצרות גומחות וקמטות. (D) מציג תמונה ברזולוציה נמוכה שצולמה עם חשיפה מינימלית של הדגימה לקרן ה-SEM; החלקיקים נראים חלקים עם מורפולוגיה עגולה. ב-(E), אותה דגימה נחשפה למשך זמן ממושך יותר, ונצפתה עיוות ברור של המורפולוגיה המקורית שלהם. ב-(F), חשיפה ממושכת לקרן בהגדרת מתח גבוה (12 kV) גרמה לחימום ולסדקים בחלקיקים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51015/51015fig4highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן להצגת תמונה גדולה יותר</a>.

אנו מתארים את הייצור והאפיון של ננו-חלקיקים ומיקרו-חלקיקים המורכבים מפולי (חומצה לקטית-קו-גליקולית) באמצעות ויטמין E-TPGS כמתחלב. על ידי פרמטרי ניסוח משתנים כגון ריכוז המתחלב, ניתן לייצר ננו-חלקיקים בקוטר ממוצע שנע בין 220 ננומטר ל-1.98 מיקרומטר.

ננו-חלקיקי PLGA הנוצרים על ידי תחליב יחיד או כפול עם ויטמין E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

המטרה הכללית של הליך זה היא ליצור ננו-חלקיקי פולימר בעלי גודל שניתן לכיוונון. זאת מושגים תחילה על ידי המסת הפולימר בממס אורגני והוספת תרופה או חומר פלואורסצנטי לכלילה. השלב השני הוא אמולסיית הפולימר עם פאזה מائية המכילה את חומר האמולסיה, ולאחר מכן אפשור התקשות החלקיקים בנפח מימי גדול יותר בעוד הממס מתהפער.בשלב הבא, החלקיקים נשטפים, נאספים באמצעות סבוב (centrifugation) ועוברים ליופיליזציה (lyophilized) לצורך אחסון לטווח ארוך. השלב הסופי הוא אפיון גודל הננו-חלקיקים ומורפולוגיית הפני השטח באמצעות מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת או דימוי SEM. לבסוף, נעשה שימוש ב-SEM כדי להראות שניתן לשלוט בגודל הננו-חלקיקים על ידי שינוי ריכוז האמולסור.ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול במגוון מחלות אנושיות, מכיוון שניתן להתאים את החלקיקים כך שיכמיסו ויספקו מגוון רחב של סוכנים טיפוליים לפעולה ממושכת ברקמה המטרה. הדגמה ויזואלית של שיטה זו היא קריטית.שלבי האמולסיה קשים ללמידה מכיוון שהיבטים דקים של אופן היווצרות האמולסיה עשויים להשפיע באופן משמעותי על תכונות החלקיקים. כדי להתחיל בהכנת הננו-חלקיקים, העבירו כ-100 milligrams של polylactic co glycolic acid, הידוע גם כ-PLGA, לתוך מבחנה בנפח 13 על 100 millimeter. לאחר מכן, באמצעות פיפטה סרולוגית מזכוכית, העבירו 1 milliliter של ethyl acetate אל הדגימה, כסו את חלקו העליון של המבחנה בנייר אלומיניום, ואז הדקו את הנייר באמצעות para film.יש להדק את ה-Parafilm היטב לאורך הקצה העליון של הבקבוק והקצה התחתון של הרדיד כדי למנוע התאיידות של הממס. סמנו את מפלס הממס על מבחנה והמתינו שהפולימר יתמוס במהלך הלילה. למחרת, הוסיפו ממס נוסף אם התרחשה התאיידות כלשהי.הכינו את הציוד והחומרים הבאים במכסה פuming (fume hood) קרוב למכשיר האולטרסאונד: וורטקס, שתי פיפטות זכוכית קטנות עם בלוני גומי ופלטת ערבוב מגנטית. בנוסף, הניחו ביקר גדול מלא במי קרח על מעמד מתחת למכשיר האולטרסאונד.בשלב הבא, הוסיפו 45 milliliters של 0.3% weight per volume של vitamin E-T-P-G-S לכלי זכוכית בנפח 200 milliliter, ולאחר מכן הגדירו את מהירות הערבוב ל-360 RPM. לאחר מכן, הוסיפו two milliliters של 0.3% weight per volume של vitamin E-T-P-G-S למבחנה מזכוכית במידות 13 על 100 millimeter. כדי לערבב חומרים הידרופוביים, הוסיפו את חומר המעטפה ישירות לתמיסת הפולימר, תוך הקפדה להימנע ממגע עם דפנות המבחנה, וערבבו באמצעות וורטקס (vortex) עד שחומר המעטפה יתפזר באופן הומוגני.עבור סוכנים הידרופיליים, בצעו אמולסיה של החומר המעטף עם תמיסת הפולימר. הוסיפו עד 50 µL של התרופה בבופר למשטח תמיסת הפולימר. בצעו סוניקציה לתערובת על קרח למשך כ-10 שניות או עד שהתמיסה הופכת אטומית והומוגנית.לאחר מכן, ערבבו במערבל (vortex) במהירות גבוהה את מבחנה הבדיקה המכילה vitamin E-T-P-G-S כאשר המבחנה מוחזקת בצורה אנכית. החזיקו את פפטת פסטור הזכוכית במרחק של סנטימטר אחד עד שניים מעל פה המבחנה הנערבבת, והוסיפו באיטיות את תמיסת הפולימר בטפטוף אל פני הנוזל במבחנה. הקפידו שהפפטה לא תיגע בדפנות המבחנה לאחר הוספת כל תמיסת הפולימר.המשיכו בערבוב התמיסה במכשיר הוורטקס. כעת צרו אמולסיה למשך 15 שניות. העבירו מיד את הפולימר שעבר אמולסיה למכשיר האולטרסוניקטור.השאירו את מבחנה הבדיקה טבולה במי קרח ובצעו סוניקציה לאמולסיה בשלושה פרקים של 10 שניות כל אחד. הניעו את האמולסיה מעלה ומטה סביב הפרובה כדי להבטיח סוניקציה אחידה, והימנעו ממגע של הפרובה עם דפנות המבחנה או תחתיתה. המתינו חמישה עד 10 שניות בין כל פרק סוניקציה של 10 שניות כדי לאפשר לתמיסה להתקרר לפני ההמשך.לאחר מכן, הוסיפו לאמולסיה מיליליטר אחד עד שניים של 0.3% vitamin E-T-P-G-S מתוך תמיסת הבחישה. פעולה זו תדלל את הפולימר שעבר אמולסיה ותקל על מזיגתו; שפכו את האמולסיה אל תוך תמיסת הבחישה. שטפו כל שארית של תמינה מהמבחנה אל תוך תמיסת הבחישה.אפשרו לננו-חלקיקים להתקשות על ידי ערבוב למשך שלוש שעות. אם החומר העוטף רגיש לאור, עטפו את הכלי בנייר אלומיניום והשאירו את החלק העליון פתוח כדי להקל על אידוי הממס. כדי לאסוף את הננו-חלקיקים, התחילו בחלוקת תמיסת הננו-חלקיקים לשתי מבחנות צנטריפוגה מסוג Oak Ridge בנפח נומינלי של 30 מיליליטר, והמתיקו את משקלן כך שההפרש ביניהן לא יעלה על 0.1 גרם. לאחר מכן, סובבו את הננו-חלקיקים בצנטריפוגה עם רוטור בזווית קבועה למשך 15 דקות במהירות של 17,000.RC f. זמני צנטריפוגציה ממושכים יותר יביאו לאיסוף של פראקציה גבוהה יותר של ננו-חלקיקים קטנים יותר. השליכו את supernatant תוך הקפדה לא להפריע למשקע (pellet) של הננו-חלקיקים.הוסיפו חמישה מיליליטרים של מים מזוקקים והשתמשו במקבץ מים, שייקר (rotor) וערבוב במערבל (vortex) כדי להשהות את הננו-חלקיקים באופן מלא. העבירו את התוכן של שתי מבחנות הצנטריפוגה לאחת והוסיפו 20 מיליליטרים של מים מזוקקים לנפח סופי של 30 מיליליטרים. לאחר מכן, חזרו על שלבי הצנטריפוגה והשטיפה פעמיים נוספות, לסך הכל שלושה שטיפות.נפח הנוזל של תרחיף הריסוס (Resus) של המשקע האחרון צריך להיות ארבעה עד חמישה מיליליטרים. הקפיאו מנה קטנה של ננו-חלקיקים ללא טלוס (telos) לצורך דימות SEM בנפרד מהשאר. הוסיפו יחס משקלי של TLO לפולימר של 1:2 כחומר מגן מפני הקפאה (cryoprotectant) לצורך ריסוס אחיד ומלא של ננו-חלקיקי PLGA.פעולה זו תמנע היווצרות גבישי קרח העלולים לפגוע במשטח החלקיקים ולגרום לאגרגציה. העבירו את הננו-חלקיקים למבחנת צנטריפוגה של 5 מיליליטר שנשקלה מראש, ולאחר מכן הקפיאו בטמפרטורה של 80°C- למשך 30 דקות לפחות. לאחר מכן, הסירו את מכסה המבחנה וכסו את פיה באמצעות נייר סופג למעבדה המקובע בגומייה.פעלו במהירות כדי למנוע המסה של התוכן אם מתרחשת המסה כלשהי. הקפיאו שוב לפני ההכנסה לליופיליזטור, ובצעו ליופיליזציה לדגימה בנפח של 5 mL למשך 72 שעות. לאחר מכן, החזירו את המכסה ועטפו את המבחנה ושמרו את החלקיקים הליופיליים בטמפרטורה של 80- °C.ביום הצילום, הניחו פס של סרט פחמן דו-צדדי על תושבת SEM. סמנו את החלק המתכתי של התושבת באמצעות טוש קבוע לצורך זיהוי מאוחר יותר. השתמשו במרית מתכת כדי לאסוף כמות קטנה של ננו-חלקיקים בליאופילציה (lyophilized) ופזרו אותם בעדינות על פני הסרט.נקו את פני השטח של הבסיס (stub) באמצעות נייר סופג למעבדה או השתמשו באוויר דחוס כדי להסיר ננו-חלקיקים רופפים. הדמיות של החלקיקים תתבצע באמצעות מרחק עבודה של 5 עד 15 מילימטרים של הקרן, מתח של 5 עד 12 kilovolts, וגודל נקודה (spot size) של 1 עד 3; מתחים גבוהים יותר עלולים לגרום לחימום אזורי של הדגימה, דבר שישנה את המורפולוגיה של פני השטח של החלקיקים. מיקרו-חלקיקים נצפים בהגדלה של 100 פעמים, וננו-חלקיקים יהיו ניתנים להבחנה בהגדלה של 3000 פעמים.התמקדות בהגדלה בחלקו העליון של כדור כדי לאתר חלקיקים שניתן להדמות בקלות באמצעות SEM; יש לאסוף לפחות שלוש תמונות לכל סדרה כדי להשיג מדגם מייצג של גודל ומורפולוגיית החלקיקים. באמצעות שיטה זו, ניתן ליצור חלקיקים באמצעות פליטה בודדת המופיעים ככדורים נפרדים שאינם מאוחדים, בעלי מורפולוגיית שטח חלקה ומגוון רחב של גדלים המפוזרים לאורך המדגם. למיקרוחלקיקים המוצגים כאן יש קוטר ממוצע של 730 nanometers.מוצגות כאן ננו-חלקיקים שנוצרו באמצעות אמולסיה אחת המכמיסים את התרופה ההידרופובית campin. חלקיקים אלו התקבלו בגודל קטן אף יותר, עם קוטר ממוצע של 340 nanometers. ריכוזים גבוהים יותר של חומר אמולסיה הניבו חלקיקים קטנים יותר, כאשר הקטרים הממוצעים פחתו מ-2000 ל-200 nanometers.ככל שריכוז האמולסיפייר עלה מ-0.01 ל-0.3%, כפי שמוצג בתמונות ה-SEM כאן. עם זאת, כאשר ריכוז ה-vitamin E-T-P-G-S היה גבוה מדי, חלקיקים נפרדים לא נוצרו; כאשר נעשה שימוש ב-1% vitamin E-T-P-G-S, נמצאו מיזוגים כבדים ומבנים דמויי דפים לאורך כל המבנה. נכון. ברגע שלמדתם כיצד לייצר ננו-חלקיקי PLG באמצעות אמולסיה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון שינוי שטח פנים, כדי להנדס ננו-חלקיקים המיועדים לאינטראקציה עם סוגי תאים ספציפיים או אזורים מסוימים בגוף.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להניב חלקיקים בגודל הדי and ניתן לכיוון באמצעות אמולסיה.

plga-nanoparticles-formed-single-or-double-emulsion-with-vitamin-e

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

ננו-חלקיקים של PLGA שנוצרו על ידי תחליב יחיד או כפול עם ויטמין E-TPGS

Insonation של microbubbles היא אסטרטגיה מבטיח אבלציה הגידול במועד, בממוצע סמכויות מופחת אקוסטי, כמו גם עבור משלוח ממוקד של הרפוי. מטרת המחקר הנוכחי היא לפתח נמוך מחזור אולטרסאונד אסטרטגיות פועם nanocarriers על מנת למקסם את אי - אבלציה תרמית כלי הדם ואספקת מטען אל תת עורית C6 gliomas.

אולטראסאונד ניגודיות ממוקד טיפול gliomas של עכברים באמצעות אספקת סמים נושאות Nanoparticle ו אבלציה כלי הדם

מאמר זה מתאר שיטה nanoprecipitation לסנתז פולימר מבוסס חלקיקים באמצעות diblock שיתוף פולימרים. אנו נדון את הסינתזה של diblock שיתוף פולימרים, הטכניקה nanoprecipitation, יישומים פוטנציאליים.

גיבוש חלקיקים פולימריים Diblock באמצעות טכניקה Nanoprecipitation

מקור: Zhu, J., et. al., הכנה ואפיון של ננו-חלקיקים חדשים המחקים HDL עבור אנקפסולציה של גורם גדילה עצבי. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מדגים את ההרכבה המדורגת של ננו-חלקיקים מחקי HDL טעוני NGF באמצעות אנקפסולציה בסיוע פרוטמין והרכבה עצמית מבוססת שומנים ליישומי אספקה נוירוטרופיים פוטנציאליים.

עטיפת גורם גדילה עצבי בננו-חלקיקים המחקים ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה

מטרת פרוטוקול זה היא לתאר את ההכנה והאפיון של תרופות כלואות פיזית ומסיסות במים במערכות אספקת תרופות מיסלריות המורכבות מקופולימרים בלוק אמפיפילי.

הכנה ואפיון של פרט ורב-סמים נטענים בפח פיזי Micelles פולימרית

Homogenization פשוט שימש להכנת רומן, צפיפות גבוהה, lipoprotein- חיקוי חלקיקים כדי לתמצת את גורם הגדילה העצבים. אתגרים, פרוטוקולים מפורטים להכנת nanoparticle, אפיון במבחנה , וכן ב vivo מחקרים מתוארים במאמר זה.

הכנה ואפיון של נוזל HDL מחקה ננו-חלקיקים עבור אנקפסולציה גורם העצב הגדילה

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול לסינתזה של היפרדות כונדרויטין סולפט א איגוד פפטיד (plCSA-BP)-מצומדת השומנים-פולימר חלקיקים באמצעות צעד אחר צעד sonication bioconjugate וטכניקות. חלקיקים אלה מהווים כלי הרומן למסירה יישוב של הרפוי גידולים האנושי ביותר, היפרדות trophoblasts לטיפול סרטן והפרעות היפרדות.

סינתזה ואפיון של היפרדות כונדרויטין גופרתי (plCSA) - מיקוד השומנים - חלקיקי הפולימר

פלאש NanoPrecipitation (FNP) היא גישה מדרגי לייצר חלקיקים ליבה-קליפה פולימריים. המעבדה-סולם פורמולציות עבור העטיפה של הרפוי הידרופובי או הידרופילית מתוארים.

פלאש NanoPrecipitation בשביל העטיפה של תרכובות הידרופוביות, הידרופילית חלקיקים פולימרים

מחקר זה מתאר לחות קלאסית באמצעות שיטת הסרט דק השומנים לקראת nanoliposome סוימים ואחריו ננו-חלקיק אפיון. 47 kDa-hydrophilic וחלבון כדורי, טארין, הוא כיום בהצלחה כאסטרטגיה כדי לשפר את היציבות, להימנע הרשאה מהירה, ולקדם שחרור מבוקר. ניתן להתאים את השיטה לעטיפת מולקולות הידרופובי.

הכנה ואפיון ננו-פוטזומים לצורך מלכודת הידרופיזיאליות של חלבונים ביולוגיים

חלקיקי שומנים מפותחים באמצעות גישה פלטפורמת ערבוב microfluidic עבור mRNA ו- DNA אנקפסולציה.

גיבוש ואפיון חלקיקי שומנים בדם לאספקת גנים באמצעות פלטפורמת ערבוב מיקרופלואידית

פרוטוקול זה מתאר את הסינתזה והניסוח של ביו-חומרים הידרוג'ל הידרוג'ל להזרקה, סופראמולקולריים (PNP). יישומים של חומרים אלה לאספקת תרופות, ייצוב ביופארמה, אנקפסולציה של תאים ואספקה מודגמים.

הידרוג'ל פולימר-ננו-חלקיקי להזרקה עבור יישומי אספקת תאים ותרופות

כדי לתכנן באופן רציונלי אדג'ובנטים יעילים, פיתחנו תחליב פיקרינג (PNPE) של חומצה פולי-לקטית-קו-גליקולית עם ננו-חלקיקים מיוצבים. ה-PNPE היה בעל רכות ייחודית וממשק הידרופובי למגע תאי רב עוצמה והציע העמסת אנטיגן בעלת תכולה גבוהה, שיפור הזיקה התאית של מערכת ההעברה לתאים המציגים אנטיגן וגרימת הפנמה יעילה של אנטיגנים.

זיקה תאית של תחליב מיוצב חלקיקים להגברת הפנמת האנטיגן

למדו לייצר ננו-חלקיקי PLGA בגדלים מתכווננים באמצעות אמולסיה עם ויטמין E-TPGS. שיטה זו מאפשרת שליטה בגודל החלקיקים מ-220 ננומטר עד 1.98 מיקרומטר ליישומי סיוע תרופתי.

ננו-חלקיקי PLGA הנוצרים על ידי תחליב יחיד או כפול עם ויטמין E-TPGS

גלה סרטונים נוספים