פרוטוקול אופטימלי עבור רשתית Wholemount הכנה להדמיה ואימונוהיסטוכימיה
13 בדצמבר 2013
הפרוטוקול המתואר כאן מיועד להערכה מבנית של תכשיר רשתית שלם. זה כולל תיאורים של דיסקציה של רקמות, הרכבה על תוספת ממברנה פוליטטרפלואורואתילן הידרופילית (PTFE), העמסת בולוס עם סמנים פלואורסצנטיים, והשוואה של קיבוע עם קרבודימיד ופרפורמלדהיד לניתוח אימונוהיסטוכימי של רכיבים תאיים וסינפטיים.
נוהל זה משתמש ברקמת רשתית של עכבר כדי להדגים כיצד לייצב רקמה עצבית עדינה לשמירה על השלמות המבנית. במהלך מספר שלבים של צביעה אימונוהיסטוכימית, ראשית בצעו גרעין לעין (nucleate), הסירו את הקרנית והפרידו את הרשתית מהסקלרה. בצעו חתכים בגביע הרשתית של העין כדי לשטח את הרקמה.
לאחר מכן, הצמידו את הרשתית לממברנה מחוזקת בטבעת באמצעות העברה בשאיבה ללא מניפולציה ישירה, כדי לשמור על שלמות הרקמה. כעת העבירו את הטבעת ללוחית רב-בארים לצורך צביעה. התוצאות שלנו מראות כי ניתן להשתמש בטכניקה זו ביעילות ברקמה חיה, וכי היא מספקת תשתית עדיפה לדימוי של חלבוני סינפסה בהשוואה לשיטות קיימות לטיפול ברשתית מנותחת.
טכניקות אלו מאפשרות העברה של רקמה עדינה במינימום מניפולציה פיזית. הדבר יפחית את הסיכוי לעיוות ולנזק. רעיון זה עלה לראשונה כאשר היינו צריכים לבצע הקלטה מרקמה המורכבת בהרכבה שטוחה (flat mount) של עכבר RD1, מודל לניוון רשתית, שכן רשתית העכבר בקו זה דקה ושבירה ביותר עקב אובדן תאים נרחב שנגרם מהמוטציה.
פוסט-דוקטור מהמעבדה שלנו יסייע לי בהדגמת הפרוצדורה. ראשית, בצעו גרעינה (nucleation) לעיניו של עכבר שהורדם והעבירו את העיניים לתוך תמיסת HEPES-buffered Ringer מחומצנת. כדי להסיר את הקרנית, החזיקו את העין בlimbus באמצעות פינצטה, ולאחר מכן גזרו נתיב מעגלי לאורך ה-ora serrata.
שלף את העדשה באמצעות פינצטה לצורך הזרקות בולוס והקלטות אלקטרופיזיולוגיות. השתמש בפינצטה בעלת קצוות מעוגלים כדי להסיר כמה שיותר מהזגוגית. כעת ייצב את גביע העין על ידי החזקה איתנה של הלובנה באמצעות פינצטה.
מקמו סט שני של פינצטות בין הרשתית לבין גביע העין. הניעו את הפינצטות לאט מסביב להיקף. גזרו את העצב האופטי בין הרשתית לבין גביע העין, והסירו את גביע העין באמצעות מספריים.
בצעו חתכים מההיקף של הרשתית עד לעצב האופטי. לחלופין, כדי להשתמש ברשתית כולה, בצעו חתכים מההיקף עד למחצית הדרך לעצב האופטי כדי לקצר את התושבת. הסירו את החלק העודף באמצעות מחרטה.
לאחר מכן, שייפו משטחים מחוספסים בעזרת נייר זכוכית עדין. הסירו את הרגליים מתחת לטבעת. גזרו את הקצה הצר של פיפטה מפלסטיק.
לאחר מכן, העבירו את הרקמה עם מעט מהתמיסה לממברנה. הסירו את התמיסה בהדרגה תוך פריסת הרשתית ופתיחת קיפולי הרקמה. כעת, הצמידו את הרשתית לממברנה כך שתאי הגנגליון יפנו כלפי מעלה.
גזרו את קצה התפיסה של מזרק בנפח של 1 מיליליטר ומקמו אותו ישירות מתחת לרקמה. משכו את הבוכנה לנפח של כ-0.3 מיליליטר כדי לסגור פיזית את הרקמה בתוך הממברנה. משכו מספר קפילריות מזכוכית בורוסיליקט תוך שימוש בהתנגדות של כ-1 מגה-אומי.
לאחר מכן, שברו בעדינות את הקצה של כל פחית פאץ' (patch pipette). כעת, הוסיפו 0.3 microliters של תמיסת צבע מלאי של selectin ל-10 microliters של תמיסת heaps buffered ringer. כעת הניחו את הממברנה לתוך תא ההקלטה המוזן בתמיסת heaps buffered ringer חמה ומחומצנת.
מקמו את הפ pipette המכילה את הצבע אל מול הקרום המגביל הפנימי (inner limiting membrane) באמצעות מיקרו-מניפולטור. התקדמו עוד עם ה-pipette כדי לחדור את הקרום המגביל הפנימי. לאחר מכן, הזריקו את תמיסת הצביעה למיקום יעד בודד או למספר מיקומי יעד.
כעת המתינו 10 דקות להתאוששות הרקמה מההזרקה תוךما צפייה בו תחת תאורה פלואורסצנטית אפיגנסטית (epi fluorescence). במידת הצורך, העבירו את התבנית לכלי תרבית עם תחתית זכוכית, כאשר צד הרשתית פונה כלפי מטה. הוסיפו טיפה אחת של תמיסת HEP כדי לשמור על הדגימה לחה.
בנוסף, הניחו שלוש נקודות של גריז ואקום מסביב להיקף הטבעת הפלסטית כדי לקבע את המבנה המוכנס (insert) בחוזקה לצלחת התרבית. העבירו את הצלחת לשולחן המיקרוסקופ לאחר הקיבוע, וטבלו את הממברנה בתוך תמיסות מדרג הסוכרוז. חלצו את הממברנה מטבעת הפלסטיק של המבנה המוכנס.
הסרו כמה שיותר תמיסה בעזרת ניגוני Kim wipes והניחו אותה על תבנית פאראפין כאשר הרשתיה פונה כלפי מעלה. העבירו את תבנית הפאראפין עם הרקמה לתא הקריוסטט והוסיפו טיפה של מדיום OCT. השתמשו במכשיר הקפאה מהירה כדי להאיץ את תהליך ההקפאה.
נתקו את הדגימה הקפואה והפכו אותה. כעת הסִירו את עודפי ה-OCT הקפוא. השאירו כ-2 mm מסביב לדגימה משלושה צדדים, ומלימטרים מהצד שיוצמד למחזיק.
כסו את הצד הרטינלי החשוף עם טיפה של OCT, תוך השארת האזור המחובר פנוי. הקפיאו את הממברנה המכילה את רקמת הרשתית. הניחו טיפה של OCT על טבעת תמיכה קרה.
הכנס מיד את הדגימה הקפואה לתוך הבלוק. בצע חיתוכים בעובי 10 עד 20 מיקרון בטמפרטורה של 19- מעלות צלזיוס והנח אותם על שקופיות הידבקות מחומרי פוליליזין חמות. הנח את השקופיות עם החיתוכים המוצמדים על פלטפורמת חימום בטמפרטורה של 41 מעלות צלזיוס למשך שתי עד שלוש דקות בחושך.
לאחר מכן, יש להקפיא את הדגימות בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. ניסוי זה מדגים אפיון מהיר ופשוט של כלי הדם ברשתית כרשת מורכבת של כלי דם המשתרעת על פני מספר שכבות של הרשתית. על ידי שילוב של טעינת בולוס של iso selectin עם סימון שיקוע של sulfa rumine, ניתן להדגים ולסרוק רקמה חיה כמעט באופן מיידי ברשתית, כאשר ניתן לסמן את כלי הדם מהשכבה השטחית ועד לשכבה העמוקה.
בניגוד ל-SRH, הניתן לדיפוזיה באופן יחסי, סלקטין אינו חודר היטב דרך הממברנה המגבילה הפנימית (inner limiting membrane). ישנם מספר יתרונות לקיבוע באמצעות קרביימיד (carbimide) על פני קיבוע קונבנציונלי עם פראפורמאלדהיד בעת סימון חלבונים סינפטיים; לדוגמה, לאחר תקופת קיבוע קצרה עם קרביימיד, לצביעה אימונופלואורסצנטית עבור הסמן הסינפטי PSD 95 ב-IPL היה מראה נקודתי בהיר העולה בקנה אחד עם הבחנה בין סינפסות בודדות.
לעומת זאת, בעת שימוש במקבע פאראפורמאלדהיד קונבנציונלי, זיהוי הרכיבים הסינפטיים הוא פחות ברור. תוצאות דומות התקבלו בחתכי קריוסטט של הרשתית. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן קיבוע של רקמה עדינה על ממברנה זו, וכיצד לבצע צביעה ציטוכימית על הדגימה המוכנה.
חיבור הרשתית למסנן יארך כ-15 דקות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתווה שיטה להערכה מבנית של תכשירים רשתיתיים שלמים (wholemount) באמצעות רקמת רשתית של עכבר. הוא מפרט את תהליכי הניתוח, הקיבוע והצביעה כדי לשמר את שלמות הרקמה לצורך דימוג של חלבוני סינפסה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- אימונוהיסטוכימיה
- ביולוגיה של הרשתית
רקע
- שלמות מבנית של רקמה עצבית היא קריטית להדמיה מדויקת.
- שיטות קיימות עלולות לפגוע באיכות הרקמה במהלך הניתוח.
- סמנים פלואורסצנטיים משפרים את הוויזואליזציה של רכיבים תאיים.
- השוואה בין שיטות קיבוע היא חיונית להשגת תוצאות אופטימליות.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול מהימן להכנת רקמת רשתית.
- הערכת היעילות של שיטות קיבוע שונות.
- שיפור טכניקות דימוי עבור חלבונים סינפטיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- גרעין העין והסרת הקרנית.
- הפרדת הרשתית מהסקלרה (לחמית) והשטחת הרקמה.
- הצמדת הרשתית לממברנה באמצעות העברה בשאיבה.
- צביעה והדמיה של חלבונים סינפטיים.
תוצאים עיקריים
- הפרוטוקול משמר ביעילות את שלמות הרקמה.
- סמנים פלואורסצנטיים מספקים ויזואליזציה מעולה.
- השוואה בין שיטות קיבוע מספקת תובנות משמעותיות.
- טכניקה זו ישימה לדימות רקמות חיות.
מסקנות
- השיטה המתוארת משפרת את ההערכה המבנית של רקמת הרשתית.
- היא מספקת תשתית אמינה לדימוג של חלבונים סינפטיים.
- יישומים עתידיים עשויים להתרחב לרקמות עצביות אחרות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה נותן מענה לאתגר קריטי בגילוי תרופות למדעי העצבים: שימור השלמות המבנית של רקמה עצבית שבירה במהלך עיבוד אימונוהיסטוכימי. על ידי מתן אפשרות לוויזואליזציה מהימנה של חלבוני סינפס ורשתות כלי דם בדגימות של רשתית שלמה (retinal wholemounts), הוא תומך בתיקוף מטרות ובהסרת סיכונים מכניסטיים במודלים של מחלות נוירודגנרטיביות. השיטה מגבירה את הביטחון החזוי בבדיקות פרה-קליניות על ידי מזעור ארטיפקטים של עיוות רקמה שעלולים להטעות את קריאות מעורבות המטרה (target engagement).
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של מיקום חלבונים סינפטיים ומבנה כלי הדם ברשתית במודלים של מחלות.
- ערך תפעולי: מספק פלטפורמה מיוצבת לצביעה עקבית של נוגדנים ולהחדרה של סמני פלואורסצנציה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר קריאות כמותיות בעלות רזולוציה מרחבית של נקודות (puncta) של סממנים סינפטיים ורשתות כלי דם.
- ערך תפעולי: תואם לפורמטים של פלטות עם מספר בארות לצורך תהליכי עבודה סטנדרטיים של צביעה אימונוהיסטוכימית ודימיון.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך ברציפות בין דימות של רקמות חיות לבין ניתוח רקמות מקובעות עבור מחקרי מעקב אחר מעורבות מטרה (target engagement) ומודולציה של מסלולים ביולוגיים.
- ערך תפעולי: מפחית שונות בהכנות היסטולוגיות, ובכך משפר את השחזוריות בהערכות בטיחות ויעילות פרה-קליניות.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזת המטרה ברקמות עצביות ועד לאישוש פרה-קליני של השפעות המודולטור על השלמות הסינפטית והתפקוד הווסקולרי.
- ביולוגיה של גילוי: מסייעת בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי מתן אפשרות לוויזואליזציה ברורה של התפלגות חלבוני סינפסה ושל שלמות היחידה הנוירו-וסקולרית.
- סריקה: מספקת תוצרי אימונופלורסצנציה כמותיים וניתנים לשחזור, המתאימים לניתוח בעל תוכן גבוה (High-content analysis) של השפעות תרכובות על מבנה הרשתית.
- אנליטיקה: מייצרת מדדי צפיפות נקודות (puncta) ומדדי רשת כלי דם התומכים בניתוח השוואתי בין תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מאפשרת התאמה של סמנים ביולוגיים סינפטיים ווסקולריים ברשתית עם התקדמות מחלה ותגובה לטיפול בשלב הפרה-קליני.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה הדירה לייצוב רקמות, הישומה על סוגים מרובים של רקמות עצביות ופרוטוקולי צביעה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בתיקוף המטרה באמצעות ויזואליזציה חד-משמעית של סינפסות וכלי דם ברקמה עצבית שבירה.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות של הבדיקה ומפחית את שיעורי הכשל בעיבוד אימונוהיסטוכימי של דגימות עדינות.
- ערך אסטרטגי: תומך בקבלת החלטות מושכלת יותר לגבי המשך התהליך (go/no-go) על ידי הפחתת מספר התוצאות השליליות השגויות הנובעות מנזקי רקמה במהלך ההכנה.
- השפעה על פורט폴יו: מאפשר תיעודוף של תרכובות נוירופרוטקטיביות בהתאם לסיכון, בהתבסס על מדדים מבניים ותפקודיים מהימנים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות של דיסקציה מיקרו-כירורגית וטיפול ברקמות.
- תלוי בגישה לממברנות PTFE הידרופיליות נתמכות טבעת ומכשיר להעברה באמצעות שאיבה.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולי קיבוע, צביעה והדמיה בין צוותי מחקר.
- כולל שיקולי התאמה לעובי ופריכות משתנים של רקמות במודלים עצביים שונים.
- מגבלות מעשיות כוללות את הצורך בציוד ייעודי להכנה ותחזוקה של מערכת הממברנה התומכת.
