פרוטוקול אופטימלי עבור רשתית Wholemount הכנה להדמיה ואימונוהיסטוכימיה

הליך זה משתמש ברקמת רשתית של עכבר כדי להדגים כיצד לייצב רקמה עצבית עדינה כדי לשמור על שלמות מבנית. במהלך מספר שלבים של צביעה אימונוהיסטוכימית, תחילה גרעין את העין, הסר את הקרנית והפריד את הרשתית מהסקלרה. בצעו חתכים בכוס העין ברשתית כדי לשטח את הרקמה.

לאחר מכן חבר את הרשתית לקרום נאכף טבעת באמצעות העברת יניקה ללא מניפולציה ישירה כדי לשמור על שלמות הרקמה. כעת העבירו את הטבעת לצלחת מרובת בארות לצביעה. התוצאות שלנו מראות כי ניתן להשתמש בטכניקה זו ביעילות ברקמות חיות ומספקת מצע מעולה להדמיה של חלבונים סינפטיים בהשוואה למתכות קיימות לטיפול ברשתית מנותחת.

טכניקות אלו מאפשרות העברת רקמות עדינות במינימום מניפולציה פיזית. זה יפחית את הסיכוי לעיוות ונזק. הרעיון הזה עלה לנו לראשונה כשהיינו צריכים להקליט מרקמה שטוחה ב-RD עכבר אחד, מודל של ניוון רשתית, ורשתית העכבר הזו דקה ושברירית במיוחד עקב אובדן תאים נרחב שנגרם על ידי המוטציה צ'יף.

פוסט-דוקטורנט במעבדה שלנו יצטרף אלי בהדגמת ההליך. ראשית, גרעין את עיניו של עכבר מורדם והעביר את העיניים לתמיסת צלצול חמצנית של ערימות. כדי להסיר את הקרנית, החזיקו את העין בלימבוס בעזרת מלקחיים, ולאחר מכן חתכו שביל מעגלי לאורך האורה-סרטה.

משוך החוצה את העדשה בעזרת מלקחיים להזרקות בולוס והקלטות אלקטרופיזיולוגיות. השתמשו במלקחיים מעורבבים כדי להסיר כמה שיותר זגוגית. כעת ייצב את העין על ידי החזקת הסקלרה בחוזקה בעזרת מלקחיים.

מקם סט שני של מלקחיים בין הרשתית לכוס העין. הזיזו את המלקחיים לאט סביב ההיקף. חתכו את עצב הראייה בין הרשתית לכוס העין, והסירו את העין בעזרת מספריים.

בצע חתכים מהיקף הרשתית עד לעצב הראייה. לחלופין, כדי להשתמש בכל הרשתית, בצע חתכים מהפריפריה באמצע הדרך לעצב הראייה כדי לקצר את המחזיק. הסר את החלק המוגזם בעזרת מחרטה.

ואז ללטש משטחים מחוספסים עם נייר זכוכית עדין. הסר את כפות הרגליים מתחת לטבעת. חותכים את הקצה הצר של פיפטה מפלסטיק.

לאחר מכן העבירו את הרקמה עם תמיסה כלשהי לקרום. הסר את התמיסה בהדרגה תוך פיזור הרשתית ופרש את הרקמה. כעת חבר את הרשתית לקרום כאשר תאי הגנגליון פונים כלפי מעלה.

חתכו את קצה האחיזה של מזרק מיליליטר אחד ומקמו אותו ישירות מתחת לרקמה. משוך לאחור את הבוכנה לנפח של כ-0.3 מיליליטר כדי לרשת פיזית את הרקמה בתוך הממברנה. משוך כמה פיפטות נימיות בורו סיליקט באמצעות התנגדות של כמגה אחת.

לאחר מכן שוברים בעדינות את הקצה של כל פיפטת תיקון. לאחר מכן, הוסף 0.3 מיקרוליטר של תמיסת כתמי מלאי סלקטין ל-10 מיקרוליטר מתמיסת הצלצול המאגר של הערימות. כעת הנח את הממברנה בתא ההקלטה המלא בתמיסת צלצול חמה של ערימות מחומצנות.

מקם את הפיפטה המכילה צבע כנגד הממברנה המגבילה הפנימית באמצעות מניפולטור מיקרום. קדם עוד יותר את הפיפטה כדי לחדור לקרום המגביל הפנימי. לאחר מכן הזרקו את תמיסת הצביעה למיקומים הממוקדים הבודדים או המרובים.

כעת הקדישו 10 דקות לרקמה להתאושש מההזרקה תוך כדי צפייה בה תחת תאורת אפי פלואורסצנטית. אם תרצה, העבירו את התוספת לתבנית תרבית תחתית זכוכית, והניחו אותה עם הרשתית כלפי מטה. הוסף טיפה אחת של תמיסת ערימה כדי לשמור על לחות הדגימה.

כמו כן, הניחו שלוש כתמים של שומן ואקום סביב היקף טבעת הפלסטיק כדי להדק היטב את התוספת לצלחת התרבות. העבירו את המנה לשלב המיקרוסקופ לאחר הקיבוע, טבלו את הממברנה בתמיסות שיפוע הסוכרוז. הסר את הממברנה מטבעת הכנסת הפלסטיק.

הסר כמה שיותר תמיסה עם מגבוני קים והנח אותה על פרם כשהרשתית פונה כלפי מעלה. העבירו את הפרפורם עם הרקמה לתא הקריוסטט והוסיפו טיפה של מדיום OCT. השתמש במכשיר המקפיא המהיר כדי להאיץ את ההקפאה.

נתקו את הדגימה הקפואה והפכו אותה. כעת חתכו את עודפי ה-OCT הקפואים. השאירו כשני מילימטרים סביב הדגימה משלושה צדדים ומילימטרים מהצד, שיוצמדו למחזיק.

יש לכסות את צד הרשתית החשוף בטיפה של OCT ולהשאיר את האזור המחובר פנוי. הקפיאו את הממברנה המכילה את רקמת הרשתית. יש להניח טיפה של OCT על טבעת מחזיק קר.

הכנס מיד את הדגימה הקפואה לטיפה. חותכים חלקים של 10 עד 20 מיקרון בטמפרטורה שלילית של 19 מעלות צלזיוס ומניחים אותם על שקופיות הידבקות פוליליזין חמות. הניחו את המגלשות עם החלקים המצורפים על פלטפורמת חימום של 41 מעלות צלזיוס למשך שתיים-שלוש דקות בחושך.

לאחר מכן אחסן את הדגימות בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס. ניסוי זה ממחיש אפיון מהיר ופשוט של כלי דם ברשתית כרשת משוכללת של כלי דם המשתרעים על פני שכבות רשתית מרובות. על ידי שילוב העמסת בולוס של איזו סלקטין עם תיוג טבילה של סולפה רומין, ניתן לדמיין ולסרוק רקמה חיה כמעט מיד ברשתית, ניתן לסמן כלי דם מהשכבה השטחית לשכבה העמוקה.

בניגוד לדיפוזיה טובה יחסית, SRH הוא סלקטין אינו מחלחל היטב על פני הממברנה המגבילה הפנימית. ישנם מספר יתרונות של קיבוע עם קרבימיד על פני קיבוע קונבנציונאלי עם פרה-פורמלדהיד בעת תיוג חלבונים סינפטיים, למשל, לאחר תקופה קצרה של קיבוע עם צביעה אימונופלואורסצנטית קרבימיד לסמן הסינפטי. ל- PSD 95 ב- IPL היה מראה מנוקב בהיר התואם להבחנה בין הסינפסות הבודדות.

לעומת זאת, כאשר משתמשים בקיבוע אלדהיד פרפורמי קונבנציונלי, זיהוי הרכיבים הסינפטיים פחות ברור. תוצאות דומות התקבלו בחתכי הקריוסטט ברשתית. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להרכיב רקמה עדינה על קרום זה וכיצד למרוח צביעה כימית של ציטו על התכשיר מאסטר אחד.

ייקח לך 15 דקות לחבר את הרשתית למסנן.