בידוד ואפיון של חלבונים דוברי Fc אנושיים כימריים באמצעות חלבון ספיחה ממברנה וזרימת עבודה יעילה

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לבודד ולאפיין ביעילות ובנסיון חלבונים כימריים המבטאים FC אנושי, באמצעות חלבון A, סופחי ממברנה וזרימת עבודה יעילה. הדבר מושג תחילה על ידי הבהרה של העל-נוזל (supernatant) של תרבית התאים באמצעות מסנן של 0.22 מיקרון. השלב השני הוא הרכבת מערכת הזרימה ותחילת פרפוזיה של העל-נוזל של תרבית התאים דרך סופח ממברנת חלבון A.

בשלב הבא, החלבון המבטא FC אנושי מופק מהסופג הממברנתי, כאשר ה-EIT המתקבל מרוכז באמצעות אולטרה-פילטרציה, ולאחריה החלפת בופר באמצעות דיאליזה. השלבים הסופיים כוללים שימוש בציטומטריה של זרימה וב-western blotting כדי לקבוע את האיכות והכמות של החלבון המרוכז. בסופו של דבר, סופגים ממברנתיים של protein A, יחד עם תהליך עבודה יעיל, מראים ירידה בזמן העיבוד ועלייה פוטנציאלית בתשואת החלבון בהשוואה לכרומטוגרפיית זיקה מסורתית עם עמודי protein A aro speed packed.

לפיכך, היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון כרומטוגרפיית זיקה בעמוד (column affinity chromatography), הוא שסופג הממברנה מאפשר פוטנציאלית תנובה גבוהה יותר של החלבון עם זמן עיבוד קצר יותר. בחירת שיטות אפיון מתאימות יכולה גם היא להפחית את זמן העיבוד. הכינו את סופג הממברנה לפי הוראות היצרן, תוך וידוא שכל התמיסות המוזרמות הן בטמפרטורת החדר ועברו סינון מקדמי דרך מסנן של 0.22 micron. לתחילת העבודה, מלאו מזרק של 10 milliliter ב-PBS או ב-DPBS מסוננים ב-0.22 micron, והוציאו את בועות האוויר.

כדי להבטיח שאוויר לא יחדור אל סופג הממברנה, בצעו פרפוזיה של DPBS להסרת תמיסת האחסון ולהשוואת מצבו של סופג הממברנה מיד לפני השימוש. סננו את העלייה (supernatant) של תרבית התאים מיד לפני הפרפוזיה דרך סופג הממברנה באמצעות יחידת סינון סטרילית של 0.22 מיקרון המופעלת בוואקום כדי להטעין את סופג הממברנה של Protein A; שאבו את העלייה של תרבית התאים לתוך מזרק Luer lock, והוציאו בועות אוויר לצורך הרכבת החומרים והציוד. ראשית, חברו את המזרק לפתח הכניסה של סופג הממברנה.

חברו צינור גמיש ליציאת סופג הממברנה במידת הצורך. מקמו מסנן מזרק של 0.22 micron בין המזרק לבין סופג הממברנה. השתמשו בבקבוק או בבקבוק ערבוב כדי לאסוף את הנוזל היוצא מהסופג.

כוון את משאבת המזרק לקצב הזרימה הנפחי הרצוי, אך אל תחרוג מקצב הזרימה המומלץ על ידי היצרן. בצע פרפוזיה של על-נוזל תרבית התאים דרך הסופח הממברנתי תוך איסוף של הנוזל שעבר דרכה. טען מחדש את המזרק בעל-נוזל לפי הצורך.

במידת הצורך, ניתן לבדוק את נוזל השטיפה (flow through) לנוכחות של חלבון באמצעות ציטומטריית זרימה, Western blotting או ELISA, בהתאם להעדפת המעבדה; בדרך כלל אין צורך בביצוע reperfusion לנוזל השטיפה כדי להפיק את החלבון מהסופח הממברנתי. ראשית, יש לשטוף את הסופח הממברנתי עם 10 milliliters של DPBS כדי להסיר חלבונים שאינם קשורים. הפק את החלבון מהסופח הממברנתי בקצב הזרימה הרצוי.

השתמשו ב-10 עד 15 milliliters של בופר אלוציה. אספו את ה-EIT לשפופרת המכילה בופר נטרול בריכוז של 10% מנפח האלוציה. לאחר אלוציית החלבון, רגנרו את ממברנת הספיחה בהתאם להוראות היצרן.

מלאו את בולעם הממברנה ב-20% ethanol ב-DPBS לאחסון לטווח ארוך בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. העבירו את כל ה-EIT למסנן צנטריפוגלי עם סף הפרדה של 10 kilodalton.

יש לפעול לפי הוראות היצרן עבור דיאליזה בצנטריפוגה. את החומר שנשאר (retentate) יש להעביר ליחידת דיאליזה בנפח קטן עם סף חיתוך של משקל מולקולרי של 10 kilodalton כנגד הבאפר הנבחר; ייתכן שיהיה צורך להוסיף באפר לחומר שעבר דיאליזה.

אם קיים חשש משקיעת חלבונים, יש להפריד את החלבון המנוקה ואת תוויות ה-FC על ג'ל נבחר באמצעות SDS page בתנאים מחזרים או לא מחזרים לפי הצורך. השתמשו במיני-ג'ל כדי למזער את זמן ההרצה; טענו כמויות דגימה שונות של חלבון מנוקה, כולל דגימות המדוללות ב-DPBS, כדי להבטיח שסיגנלי פס החלבון המנוקה נמצאים בטווח הסיגנל הליניארי של תוויות ה-FC. בניתוח התמונה לאחר ההפרדה על הג'ל, העבירו את החלבונים מהג'ל לממברנת פולי-ויניל פלואוריד (PVDF) במערכת באפר לא רציפה באמצעות blotter חצי-יבש בהתאם להוראות היצרן; זמן ההעברה הוא בדרך כלל 5 עד 10 דקות.

צבעו את הג'ל ב-Kumasi לאחר ההעברה כדי לוודא את יעילות ההעברה. בצעו אימונו-בלוטינג עם anti FC או anti IgG המצומדים לפוספטאזה עיורית או לפרוקסידאז חזרת (horseradish peroxidase) באמצעות גילוי חלבונים בסיוע ואקום. זמן האימונו-בלוטינג הוא בדרך כלל פחות משעה אחת.

בצע פיתוח של ה-immuno blot באמצעות הסובסטרט והשיטה הנבחרים. כמת את החלבון המנוקה באמצעות ניתוח תמונה. בצע רגרסיה לינארית על אותות הפסים של סטנדרטי ה-FC.

אם ערך ה-R squared גדול מ-0.90, השתמש במשוואת הקו כדי לחשב את כמות החלבון על סמך אות הפס שלו, תוך התחשבות בדילול הדגימה במידת הצורך. מכיוון שכימות החלבון מבוצע על בסיס fc, התאם את הערך להבדלי המשקל המולקולרי בין החלבון ל-fc. אם ערך ה-R squared קטן מ-0.90, חזור על פרוצדורת ה-western blotting המהירה.

לבסוף, יש לתקף את החלבון באמצעות בדיקות תפקודיות או שיטות לזיהוי FC באמצעות ציטומטריה של זרימה. Western blotting או ציטומטריה של זרימה בשיטת EISA שימשו לבדיקת נוכחותו של GAL one HFC תפקודי בעיקר על-הנוזל של תרבית התאים ההתחלתית, כפי שמעידה ההיסטוגרמה הכחולה; מצע תרבית תאים טרי, המוצג כאן באדום, שימש כביקורת שלילית; מעל היסטוגרמה זו, בירוק, מוצג ה-flow through, המעיד על כך שסופח הממברנה לכד ושימר ביעילות את ה-GAL one HFC. ה-gal one HFC נשטף מסופח הממברנה במרווחים של 1 mL, בקצב של 1 mL לדקה, באמצעות בופר חומצי מבוסס אמין; מקטעי אלואציה מנוטרלים נבדקו לאחר מכן לנוכחות של GG one HFC תפקודי באמצעות ציטומטריה של זרימה. אות ה-GL one HFC עלה באופן רצית מהאלואציה הראשונה, שהייתה שווה בקירוב לביקורת השלילית, עד למקסימום באלואציה השלישית, ולאחר מכן ירד לרמה קבועה כמעט באלואציות 9 ו-10.

ה-EEU 10 הסופי לא הגיע לשוויון עם אות ביקורת השלילה בשל שימור של סופח פרסומות מסוים של כימות GL one HFC. אפיון וכימות של ה-GL one HFC המנוקה בוצעו באמצעות פרוצדורת western blotting שהוזראה על ידי העברה חצי-יבשה ו-immuno blotting בסיוע ואקום. על ידי השוואת אות ה-GA one HFC לתקני כימות HFC, נקבעו הן הכמות והן האיכות של החומר המנוקה.

אותוֹ GAL one HFC ואותות GAL one HFC מומסים היו בטווח התקנים. עוצמות האות של פסי התקן של HFC היו קשורות באופן ליניארי לכמות ה-HFC הנוכחת. ריכוזו של GAL one HFC מנוקה על בסיס HFC נקבע כ-450 micrograms per milliliter באמצעות עיבוד תמונה.

ביצוע התאמה למשקל המולקולרי של G one HFC. ריכוזו של החומר המנוקה היה 720 µg/mL. לעומת זאת, נטען כמות מוגברת של GAL one HFC מנוקה במסלולים שש ושבע של ה-western blot המוצג כאן, מה שיצר אותות שרווו או חרגו מטווח הסטנדרטים של ה-HFC, ובכך מנעו את ביצוע הכימות.

כחלופה ל-western blotting, צביעת ג'ל ב-kumasi יכולה לשמש כבדיקת בקרת איכות מהירה ו/או כשיטת כימות. שימו לב כי בדגימת GAL one HFC שהתפרקה, נראתה פס ברמה של כ-10 kilodaltons בנוסף לפסים ברמה של כ-25 kilodaltons וכ-40 kilodaltons. פס זה מייצג GAL one HFC מפורק שלא הגיב עם הנוגדן לגילוי ששימש ב-western blots.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבודד חלבונים המבטאים FC אנושי כימרי באמצעות סופחים ממברנתיים, וכיצד לאפיין חלבונים אלו תוך ארבע שעות בלבד.