Name: Xenopus טכניקת ביצית Cut-פתוח וזלין גאפ מתח מהדק עם Fluorometry (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-11T14:55:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: למד טכניקת cut-open Vaseline gap לרישום זרמים יוניים ומעברי שער ב-Xenopus oocytes ברזולוציה גבוהה. שיטה זו מאפשרת ניתוח קינטיקה מהירה של ערוצי יונים תלויי מתח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

כל החברים של אוניברסיטת וושינגטון במעבדה להנדסה מולקולרית לב סנט לואיס. בורוז ברוכים קרן פרס קריירה בממשק המדעי - 1010299 (לJS).

<ol><li>Kalstrup, T., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+internal+pore+opening+in+KV+channels+probed+by+a+fluorescent+unnatural+amino+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dynamics of internal pore opening in KV channels probed by a fluorescent unnatural amino acid.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 8272-8277 (2013).</li>
<li>Stefani, E., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cut-open+oocyte+voltage-clamp+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Cut-open oocyte voltage-clamp technique.</a> Methods Enzymol. 293, 300-318 (1998).</li>
<li>Muroi, Y., Chanda, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+anesthetics+disrupt+energetic+coupling+between+the+voltage-sensing+segments+of+a+sodium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Local anesthetics disrupt energetic coupling between the voltage-sensing segments of a sodium channel.</a> J. Gen. Physiol. 133, 1-15 (2009).</li>
<li>Stefani, E., Toro, L., Perozo, E., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gating+of+Shaker+K%2B+channels%3A+I.+Ionic+and+gating+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Gating of Shaker K+ channels: I. Ionic and gating currents.</a> Biophys. J. 66, 996-1010 (1994).</li>
<li>Wang, S., Liu, S., Morales, M. J., Strauss, H. C., Rasmusson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+analysis+of+the+activation+and+inactivation+kinetics+of+HERG+expressed+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiolt%22%5BJournal%5D)">A quantitative analysis of the activation and inactivation kinetics of HERG expressed in Xenopus oocytes.</a> J. Physiolt. 502 (Pt 1), 45-60 (1997).</li>
<li>Neely, A., Garcia-Olivares, J., Voswinkel, S., Horstkott, H., Hidalgo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+active+calcium+channel+beta%281b%29+-subunit+by+size-exclusion+chromatography+and+its+role+on+channel+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Folding of active calcium channel beta(1b) -subunit by size-exclusion chromatography and its role on channel function.</a> J. Biol. Chem. 279, 21689-21694 (2004).</li>
<li>Silva, J. R., Goldstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensor+movements+describe+slow+inactivation+of+voltage-gated+sodium+channels+I%3A+wild-type+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Na%28V%291.4.+J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensor movements describe slow inactivation of voltage-gated sodium channels I: wild-type skeletal muscle.</a> Na(V)1.4. J. Gen. Physiol. 141, 309-321 (2013).</li>
<li>Silva, J. R., Goldstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensor+movements+describe+slow+inactivation+of+voltage-gated+sodium+channels+II%3A+a+periodic+paralysis+mutation+in+Na%28V%291.4+%28L689I%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensor movements describe slow inactivation of voltage-gated sodium channels II: a periodic paralysis mutation in Na(V)1.4 (L689I).</a> J. Gen. Physiol. 141, 323-334 (2013).</li>
<li>Taglialatela, M., Toro, L., Stefani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+voltage+clamp+to+record+small%2C+fast+currents+from+ion+channels+expressed+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Novel voltage clamp to record small, fast currents from ion channels expressed in Xenopus oocytes.</a> Biophys. J. 61, 78-82 (1992).</li>
<li>Clare, J. J., Trezise, D. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClare%2C+JJ+%22Expression+and+analysis+of+recombinant+ion+channels+%3A+from+structural+studies+to+pharmacological+screening%22">Expression and analysis of recombinant ion channels : from structural studies to pharmacological screening</a>. , Wiley-VCH. (2006).</li>
<li>Susan, G. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCha%2C+A+%22Methods+in+enzymology%22">Methods in enzymology</a>. 296, Academic Press. 566-578 (1998).</li>
<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowicz%2C+JR+%22Principles+of+fluorescence+spectroscopy.+3rd+edn%22">Principles of fluorescence spectroscopy. 3rd edn</a>. , Springer. (2006).</li>
<li>Cha, A., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+voltage-dependent+conformational+changes+in+the+Shaker+K%2B+channel+with+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Characterizing voltage-dependent conformational changes in the Shaker K+ channel with fluorescence.</a> Neuron. 19, 1127-1140 (1997).</li>
<li>Richards, R., Dempski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+the+conformational+dynamics+of+membrane+proteins+in+situ+with+site-directed+fluorescence+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Examining the conformational dynamics of membrane proteins in situ with site-directed fluorescence labeling.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Cohen, S., Au, S., Pante, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Xenopus+laevis+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Xenopus laevis oocytes.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Techniques for Chloriding Silver Wires. , Available from: 
 
 <a target="_blank" href="http://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/chloriding_wire.pdf">http://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/chloriding_wire.pdf</a> (1999).</li>
<li>Raynauld, J. P., Laviolette, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+silver-silver+chloride+electrode%3A+a+possible+generator+of+offset+voltages+and+currents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">The silver-silver chloride electrode: a possible generator of offset voltages and currents.</a> J. Neurosci. Methods. 19, 249-255 (1987).</li>
<li>Gagnon, D. G., Bissonnette, P., Lapointe, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+disulfide+bridge+linking+the+fourth+and+the+seventh+extracellular+loops+of+the+Na%2B%2Fglucose+cotransporter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification of a disulfide bridge linking the fourth and the seventh extracellular loops of the Na+/glucose cotransporter.</a> J. Gen. Physiol. 127, 145-158 (2006).</li>
<li>Pantazis, A., Olcese, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPantazis%2C+A+%22Cut-Open+Oocyte+Voltage-Clamp+Technique.+In%3A+Roberts+G.+%28Ed.%29+Encyclopedia+of+Biophysics%3A+SpringerReference%22">Cut-Open Oocyte Voltage-Clamp Technique. In: Roberts G. (Ed.) Encyclopedia of Biophysics: SpringerReference</a>. Roberts, G. , Springer-Verlag Berlin Heidelberg. New York. (2013).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

טכניקת מהדק החתך פתוח וזלין ביצית מתח פער מאפשרת פתרון מהיר של נתונים, רעש נמוך, שליטה מוגברת על פתרון פנימי והרכב פתרון חיצוני, והקלטות יציבים לאורך פרוטוקולים ארוכים יחסית 19. יתרונות אלה שנקבעו בטכניקה זו מלבד המהדק הסטנדרטי שתי אלקטרודות מתח וטכניקות תיקון מהדק. למרות שנדרש ציוד מיוחד והפרוטוקול הוא קשה יחסית, מעט מאוד בעיות להתרחש ברגע שהמערכת כבר מותאמת. זה מאפשר להקלטות לשחזור של נתרן (HNA V 1.5) וערוצי הפעלה במהירות אחרים. <p class="jove_content" ...

טכניקות הידוק מתח מיוחדות תאפשר ההקלטה של ​​זרמים יוניים בפוטנציאל קרום מבוקר. שימוש נרחב מהדק שתי אלקטרודות מתח (TEVC) וטכניקות תיקון מהדק לספק מידע אלקטרו אמין על המאפיינים של תעלות יונים רבות. עם זאת, שתי שיטות אלה יש חסרונות שמונעים הרכישה של נתונים מהימנים לערוצים במהירות מתח מגודרת נתרן וערוצים להפעלה מהירה אחרים בממברנות כגון אלה של ביציות Xenopus. מעבדות Bezanilla וסטפאני וכתוצאה מכך פיתחו את טכניקת החיתוך פתוח מהדק מתח פער זלין (COVG) לביציות 2. הטכניקה כבר מיושמת באופן נרחב כדי להקליט, Na +, K +, וCa 2 ערוצים + 3-8. במהלך הקלטת COVG, קרום ביצית-לבטא חלבון Heterologous מחולק לשלושה אזורים. הנתונים הנוכחיים היוניים נרשם מהאזור העליון של הביצית כאמבטיה המקיפה את האזור העליון מהודקת לפוטנציאל פקודה, אשר ניתן לשנות בקלות ובמהירות. האזור האמצעי שומרים נגד זרמי זליגה על ידי שהדק את אותו פוטנציאל כמו של האזור העליון 9. האזור התחתון הוא שבו פתיחת ביצית (לחתוך פתוח) מתרחשת באמצעות השימוש בפתרון saponin או צינורית. כימי או פתיחה ידנית של הקרום באזור התחתון מאפשרת שליטה של ​​הפוטנציאל הפנימי, שהוא הידק לאדמה, והופך את רציף התא הפנימי עם פתרון התא התחתון. טפטוף של פתרונות לתא התחתון ניתן להתאים את המאפיינים של הסביבה הפנימית, ואילו מטבע פתרון בתא העליון משנה את הסביבה החיצונית. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51040/51040fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51040/51040fig1.jpg" width="500px" /> איור 1. ביצית Cut-Open תרשים התקנת מתח-קלאמפ אמבט. () למעלהלמטה תצוגה של שלוש האמבטיות מופרדות אחד מהשני. ממדיהם של התאים לCOVG מוצגים באיור. (ב) להציג צד של התקנת האמבטיות בעמדת בדיקה. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51040/51040fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> היתרונות של טכניקת COVG כוללים רעש נמוך הנוכחי (1 NA ב3 קילוהרץ), שליטה על הרכב היוני של מדיה החיצונית, היכולת לווסת את התקשורת הפנימית, ברזולוציה זמן מהיר (20-100 המתמיד של דעיכה של μsec זמן קיבולת חולפת), והקלטות יציבים במשך כמה שעות 9. החסרונות הם שזה דורש ציוד מיוחד וקשה יותר לביצוע בהשוואה לשני הידוק מתח האלקטרודה (TEVC) 10. בעוד גישת COVG דורשת ציוד מיוחד מאוד ואלמנטים פרוצדורליים מורכבים, זה יכול לאפשר לרכישת valuנתונים אלקטרו מסוגלים. נתונים אלה, כגון gating זרמים עם קינטיקה מהירה וזרמי זנב 4, ניתן להקליט בלי חלק מהנושאים הקשורים לפרוטוקולי הידוק מתח אחרים, כולל ערוץ מוזנח. שינויים קלים להתקנת COVG יכולים לאפשר את השימוש בבקרי הטמפרטורה וfluorometry מהדק מתח (VCF). הכללתם של אלמנטי fluorometry מהדק מתח בתוך ההרכבה COVG יכול להגדיל את תפוקת נתונים על ידי המקנה את היכולת לעקוב אחר שינויי קונפורמציה חלבון בעת הקלטת 11-13 הנוכחי בו זמנית.

<table><tbody><tr>פתרון <td>חיצוני</td><td>מספר קטלוגי</td> <td>מותג</td> <td>[סופי], משקל או נפח</td></tr><tr><td>N-methyl-D-glucamine (NMDG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004</td><td>25mM</td></tr><tr><td>MES נתרן מלח</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M5057</td><td>90mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>מוצרי מחקר בינלאומיים</td><td>H75030</td><td>20mM</td></tr><tr><td>סידן הידרוקסיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>239232</td><td>2mM</td></tr><tr><td>MES הידראט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td>משתנה (pH עד 7.4)</td></tr> <tr><td>תמיסה פנימית</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-methyl-D-glucamine (NMDG)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004</td><td>105mM</td></tr><tr><td>MES נתרן מלח</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M5057</td><td>10mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>מוצרי מחקר בינלאומיים</td><td>H75030</td><td>20mM</td></tr><tr><td>אתילן גליקול-ביס(2-אמינואתילאתר)-N,N,N',N'-חומצה טטראצטית (EGTA)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E4378</td><td>2mM</td></tr><tr><td>MES הידראט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M8250</td><td>משתנה (pH עד 7.4)</td></tr> <tr><td>תמיסת</td><td></td><td></td><td></td>דה-פולריזציה</tr><tr><td>KCl</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>221473</td><td>110 מ"מ</td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M8266</td><td>1.5 מ"מ</td></tr><tr><td>סידן כלוריד</td><td>Caisson</td><td>C021</td><td>0.8mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Research Products International</td><td>H75030</td><td>10mM</td></tr><tr><td>Pipet Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473</td><td>3M</td></tr><tr><td>Saponin Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td>0.125g</td></tr><tr><td>פנימי פתרון</td><td>ראה לעיל</td><td></td><td>50 מ"ל</td></tr><tr><td>תמיסת</td><td></td><td></td><td></td>גשר אגר</tr><tr><td>N-מתיל-D-גלוקמין (NMDG)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M2004</td><td>100 מ"ל של 1M</td></tr><tr><td>מוצרי מחקר</td><td>HEPES</td> בינלאומיים <td>H75030</td><td>1.2 גרם</td></tr><tr><td>MES הידראט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M8250</td><td>משתנה (pH עד 7.4)</td></tr> <tr>מוצרי מחקר <td>אגר מגורענים</td><td> פתרון</td> אחסון <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>בינלאומי A20250 3% <td>NMDG</td></tr><tr><td>NMDG, HEPES, MES תמיסת הידראט</td><td>ראה לעיל</td><td></td><td>40 מ"ל</td></tr><tr><td>מים</td><td></td><td></td><td>60 מ"ל</td></tr><tr><td>שם החומר/ציוד</td><td>מספר קטלוגי החברה</td><td></td><td>הערות/תיאור</td></tr><tr><td>מהדק ביציות בעל ביצועים גבוהים</td><td>דגן</td><td>CA-1B</td><td></td></tr><tr><td>מערכת איסוף נתונים</td><td>Axon CNS</td><td>&nbsp; Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>אוסילוסקופ</td><td>Tektronix&nbsp;</td><td>TDS 210</td><td></td></tr><tr><td>מסנן כוח מתלה</td><td>APC&nbsp;</td><td></td> בקר טמפרטורת אמבטיה חימום/קירור G5 <td></td></tr><tr><td></td><td>דגן</td><td>HCC-100A</td><td></td></tr><tr><td>PC</td><td>Dell</td><td>Optiplex 990</td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP 10.3 מהדק מתח תוכנה</td><td>התקנים מולקולריים, LLC</td><td>pCLAMP10.3</td><td></td></tr><tr><td>TMC בקרת רטט שולחן פלטפורמה TMC</td><td></td><td>64 סדרת</td><td></td></tr><tr><td>TMC בקרת רעידות שולחן אוויר</td><td>TMC</td><td><a name="RANGE! סדרת C10">20&nbsp; אספן</td> נתוני אלקטרודות </a><td></td></tr><tr><td>V1/I</td><td>דגן</td><td>חלק ממיקרומניפולטור CA-1B</td><td></td></tr><tr><td>MX10L</td><td>Siskiyou</td><td>MX10L</td><td></td></tr><tr><td>אמבטיה / מגן (I/V) Headstage (עם מחברים מתאימים)</td> <td>דגן</td><td>חלק ממיקרוסקופ CA-1B</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Omano</td><td>OM2300S-JW11</td><td></td></tr><tr><td>אמבט בקרת טמפרטורה</td><td>מותאם אישית או דגן</td><td>מותאם אישית או תא HE-204C</td><td>מותאם אישית עשוי מחומרים מפולימרים מגניבים (סדרת D). דגן מספק גם שלב טרום פבריקטיבי (HE-204C).</td></tr><tr><td>מותאם אישית AgCl גלולה מיכל</td><td>מותאם אישית</td><td></td><td>מותאם אישית במכונה</td></tr><tr><td>אישית Ag / AgCl אלקטרודה, גלולה, 2.0 מ"מ</td><td>וורנר</td><td>E-206</td><td></td></tr><tr><td>אמבט ביציות חיצוני</td><td>מותאם אישית או דגן</td><td>מותאם אישית או CC-1-T-LB</td><td>מותאם אישית במכונה או נרכש מ דגן</td></tr><tr><td>אמבט ביציות</td><td>פנימי מותאם אישית או דגן</td><td>מותאם אישית או CC-TG-ND</td><td>מותאם אישית במכונה או נרכש מדגן</td></tr><tr><td>נימים לגשרי אגר ואלקטרודות משוכות</td><td>Warner</td><td>G150T-4</td><td></td></tr><tr><td>תושבות מסתובבות למיקרוסקופ, מיקרומניפולטור ואמבטיה</td><td>Siskiyou</td><td>SD-1280P</td><td></td></tr><tr><td>Fiber-Lite</td><td>Dolan-Jenner</td><td>LMI-600</td><td></td></tr><tr><td>Regular</td><td>Bleach Clorox</td><td>470174-764</td><td></td></tr><tr><td>Xenopus laevis ביציות</td><td>Nasco</td><td>LM535M (נקבות בוגרות מינית)</td><td></td></tr><tr><td>90 Na+ פתרון חיצוני</td><td>ראה גיליון</td><td></td><td></td>פתרונות</tr><tr><td>10 Na+ פתרון פנימי</td><td>ראה גיליון</td><td></td><td></td>פתרונות</tr><tr><td>3 M KCL</td><td>ראה גיליון</td><td></td><td></td>פתרונות</tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>NMDG Storage Solution</td><td>ראה גיליון פתרונות</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צנרת העברה של 5 מ"ל</td><td>SciMart</td><td>GS-52</td><td></td></tr><tr><td>מזרק אלקטרודות KCl שונה</td><td>BD</td><td>309659</td><td>קצה מזרק פלסטיק מומס כדי לאפשר הזרקת תמיסה לאלקטרודות. לחלופין, ניתן לרכוש Microfil של WPI.</td></tr><tr>מלקחיים <td>מותאמים</td><td>אישית</td><td></td> <td>של Microvaccum</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>63040-458</td><td></td></tr><tr><td>כלים לטיפול בביציות (משאבת פיפטה)</td> <td>VWR</td><td>53502-222</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק שפריץ מים נטול יונים</td><td>VWR</td><td>16649-911</td><td></td></tr><tr><td>וזלין ג'לי נפט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>19-086-291&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>חומרים נוספים הנדרשים להקלטות VCF:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>מיקרוסקופ VCF</td><td>Nikon</td><td>Eclipse FN1</td><td></td></tr><tr><td>Nikon CFI APO 40XW NIR אובייקטיבי</td><td>Nikon</td><td>N40X-NIR</td><td></td></tr><tr><td>X-Y מערכת מתרגם למיקרוסקופים זקופים בשלב קבוע</td><td>מכשירי סאטר</td><td>MT500-586</td><td></td></tr><tr><td>חיצוני VCF אמבט ביציות</td><td>מותאם אישית</td><td></td><td>במכונה מותאמת אישית. מידות החדר הן 2.7 x 1.9 x 0.4 ס"מ.</td></tr><tr><td>פנימי VCF ביצית אמבט</td><td>מותאם אישית</td><td></td><td>במכונה מותאמת אישית. מידות החדר הן 1.6 x 1.6 x 0.4 ס"מ.</td></tr><tr><td>אמבט בקרת טמפרטורה שונה</td> תא <td>מותאם אישית</td><td></td><td>העשוי מחומרים מפולימרים מגניבים (סדרת D). מידות החדר של אמבט בקר הטמפרטורה שהשתנה הן 2.7 x 1.9 x 0.3 ס"מ לתא האופקי, ו- 1 x 2.5 x 0.5 ס"מ לתא האנכי.</td></tr></tbody></table>

<em&gt; xenopus</em&gt; טכניקת ביצית cut-פתוח וזלין גאפ מתח מהדק עם fluorometry

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

פער זלין ביצית החתך פתוח (COVG) טכניקת מהדק מתח מאפשרת ניתוח של מאפייני אלקטרו והקינטית של תעלות יונים Heterologous בביציות. הקלטות מהגדרת החתך פתוח הן שימושיות במיוחד לפתרון זרמים נמוכים gating הגודל, הפעלה נוכחית יונית מהירה, ושחרור משרות. היתרונות העיקריים על פני מהדק מתח שתי אלקטרודות טכניקה (TEVC) כוללים מהירות מוגברת מהדק, יחס אות לרעש משופר, והיכולת לווסת את תאית וסביבה תאית. כאן, אנחנו מעסיקים ערוץ נתרן לב האנושי (HNA V 1.5), הביע ב ביציות Xenopus, כדי להדגים את הגדרת החתך פתוח ופרוטוקול, כמו גם שינויים דרושים כדי להוסיף את יכולת fluorometry מהדק מתח. המאפיינים של ערוצים מהירים להפעלת יון, כגון HNA V 1.5, לא ניתן לפתור באופן מלא ליד טמפרטורת חדר באמצעות TEVC, באשרשעות השלמות של קרום הביצית הוא הידק, מה שהופך את בקרת מתח קשה. עם זאת, בטכניקת החיתוך פתוח, בידוד של רק חלק קטן מקרום התא מאפשר להידוק המהיר יידרש לרשום במדויק קינטיקה מהירה תוך מניעת ערוץ מוזנח הקשורים לטכניקות תיקון מהדק. בשילוב עם טכניקת COVG, קינטיקה ערוץ יון ומאפייני אלקטרו ניתן assayed נוסף באמצעות fluorometry מהדק מתח, שבו תנועת חלבון היא מעקב באמצעות נטיית ציסטאין של fluorophores מיושם extracellularly, החדרה של חלבוני ניאון מקודדים גנטי, או שילוב של חומצות אמינו לא טבעיות לאזור של עניין 1. נתונים נוספים זה מניב מידע קינטית על שחלופי קונפורמציה מתח תלוי של החלבון באמצעות שינויים בmicroenvironment המקיף את מולקולת הניאון.

איור 4 מציג את השינוי בחדירות של הביצית כפתרון saponin מוחל על החלק התחתון של הביצית. איור 5 מדגים את שער חליפין פתרון תאיים על ידי דיפוזיה הבאה permeabilization saponin. 20-40 דקות נדרשות להגיע למצב יציב 2,18. עקבות מופע איור 6 א שהופקו מפרוטוקול ההקלטה. איור מציג זרמים יוניים (לאחר חיסור דליפת P/-8) בתגובה לפרוטוקול המתח (הבלעה). כל זכר בדמות מייצג מ...

גישת פער זלין החתך פתוח משמשת להשגת הקלטות רעש נמוכות של זרמים יוניים וgating מתעלות יונים מתח תלוי מבוטאים בביציות Xenopus עם רזולוציה גבוהה של קינטיקה ערוץ מהר. עם שינוי קל, fluorometry מהדק מתח יכול להיות מצמידים את פרוטוקול ביצית החתך פתוח.

<em&gt; Xenopus</em&gt; טכניקת ביצית Cut-פתוח וזלין גאפ מתח מהדק עם Fluorometry

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להשיג הקלטות ברמת רעש נמוכה של זרמים יוניים וזרמי שער (gating currents) מערוצי יונים תלויי-מתח המבטאים ב-zap cytes, ברזולוציה זמנית גבוהה של קינטיקה מהירה של הערוצים. דבר זה מושג תחילה על ידי הזרקת mRNA של הערוץ היוני המוקלט לתוך ביצי לטאה (frog oocytes). השלב השני הוא יצירת גשרי אגר על ידי עיצוב צינוריות קפילריות ומילואן בתמיסת אגר המכילה מלח.בשלב הבא, המערכת הפתוחה מוכנה לניסוי על ידי הצבת כל הרכיבים, כולל אתר ה-UO וגשרי האגאר, במיקומים הייעודיים להם. השלב האחרון הוא החדרת המיקרו-אלקטרודה אל אתר ה-UO כדי לאפשר הקלטות של voltage clamp. בסופו של דבר, פרוטוקול ההקלטה משמש להדגמת זרמים יוניים מערוצים יוניים הממוקמים בממברנת הביצית.היתרון המרכזי של טכניקת ה-cut open voltage clamp הוא שהיא מאפשרת הקלטות יציבות עם רעש נמוך של אוכלוסייה גדולה מאוד של תעלות יונים. היא מאפשרת בנוסף רזולוציה מהירה של קינטיקת התעלות. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן ישנם שלבים מסוימים, כגון מיקום אתר ה-O, התא העליון וגשרי האגאר, שקשים ללמידה.בפרוצדורה זו, הכינו לפחות שישה גשרי אגר על ידי חימום של קצה אחד של צינור קפילרי מבורוסיליקט בלהבה בינונית. עבור כל אחד מהם, ודאו שקצה הצינור הקפילרי נמצא בחלק העליון של הלהבה הכחולה.לאחר שצינור הנימי התחמם, השתמשו בפינצטה כדי ליצור

the-xenopus-oocyte-cut-open-vaseline-gap-voltage-clamp-technique-with

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

זה נועד כהקדמה תיקון הקלטה מהדק מ ביציות Xenopus laevis. היא משתרעת על הסרת vitelline קרום, היווצרות חותם gigaohm (gigaseal), ואת ההמרה אופציונלי של תיקון כדי טופולוגיה מחוץ הקצוב.

הצמד תיקון הקלטה של ​​תעלות יונים מתבטא ביציות Xenopus

יונית הנוכחי של BK ערוצי נרשם באמצעות מהדק טכניקות תיקון. ערוצי BK באים לידי...

הצמד תיקון וטכניקות זלוף עבור לימוד תעלות יונים מתבטא Xenopus ביציות

נתאר שיטה אשר מודד את קינטיקה של תחבורה יון של חלבונים בממברנה לצד ניתוח אתר ספציפי של שינויים קונפורמציה באמצעות הקרינה על תאים בודדים. טכניקה זו ניתנת להתאמה תעלות יונים, מובילי משאבות יונים יכול להיות מנוצל כדי לקבוע מגבלות המרחק בין יחידות משנה חלבון.

בחינת Dynamics קונפורמציה של חלבונים בממברנה באתרו עם תיוג, האתר מכוון פלואורסצנטי

אנו מתארים שיטה לכימות הפעילות של ATPases מסוג P-countertransport K+ על ידי ביטוי הטרולוגי של האנזימים בביציות Xenopus ומדידת קליטת Rb+ או Li+ לתאים בודדים על ידי ספקטרופוטומטריית ספיגה אטומית. השיטה מהווה אלטרנטיבה רגישה ובטוחה לניסויי שטף רדיואיזוטופים המאפשרים מחקרים קינטיים מורכבים.

מדידת תחבורת קטיון ידי Na, K-ו-H, K-ATPase ב<em&gt; Xenopus</em&gt; ביציות על ידי spectrophotometry קליטה האטומית: חלופית למבחני radioisotope

כדי להשלים את השיטות נפוצות ללמוד TRPV4 של שתי שיטות מתוארות: mechanosensitivity ניתן ללמוד על ידי 2 luminometry +-aequorin Ca בשמרים מהונדסים על אתגר היפו אוסמוטי. כמו כן, ניתן לבדוק בTRPV4-RNA מוזרק ביציות Xenopus ידי מהדק כל תא שתי אלקטרודות מתח או צמד תיקון בתאים או במצב נכרת.

Luminometric ושמרים Xenopus ביצית בחינות אלקטרו של Mechanosensitivity המולקולרי של TRPV4

מתוארת שיטה להדמיית שינויים בפוטנציאל הממברנה באמצעות מחווני מתח מקודדים גנטית.

ממברנה הדמיה פוטנציאלית עם שני סוגי חיישני מתח פלורסנט מקודדים גנטיים

מתוארים נהלים אופטימליים לבידוד זקיקים בודדים, מיקרו-הזרקות RNA ציטופלזמיות, הסרת שכבות התאים הסובבות וביטוי חלבון בביציות Xenopus. בנוסף, מוצגת שיטה פשוטה לשינויי תמיסה מהירים בניסויים אלקטרופיזיולוגיים עם תעלות יונים מגודרות ליגנד.

Xenopus ביציות: שיטות אופטימיזציה עבור Microinjection, הסרת שכבות ניידות זקיקים, ושינויי פתרון מהירים בניסויי אלקטרו

מאמר זה מתאר שיפור של קונבנציונאלי מתח פלמורומטריה (VCF) שבו פלואורסצנט טבעי חומצות אמינו (fUAA) משמשים במקום צבעים maleimide, כדי לבדוק סידורים מבניים בערוצי יון. ההליך כולל הזרקת Xenopus ביצית דנ"א, RNA / מטבע fUAA, ומדידות בו זמנית ו פלואורסצנטי.

מתח הידוק פלואומטריה ב<em&gt; קסנופוס</em&gt; ביציות באמצעות חומצות אמינו פלואורסצנטי לא טבעי

כל תא הקלטות של תסיסנית melanogaster photoreceptors לאפשר מדידה של ספונטני בליטות כהה, בליטות קוונטיות, תגובות מאקרוסקופיות לאור, ואת המתח הנוכחי היחסים בתנאים שונים. בשילוב עם ד melanogaster כלים מניפולציה גנטית, שיטה זו מאפשרת את המחקר של inositol- השומן ליפיד המסלול נתיב היעד שלה, ערוץ TRP.

שיטה אלקטרו-קולית לקולקציית מתח מלא<em&gt; תסיסנית</em&gt; פוטורספטורים

אנו מתארים שיטה להכנה והדמיה חיה של תמציות ציטופלסמיות לא מדוללות מביצי Xenopus laevis .

קסנופוס לאוויס הכנת תמצית ביצים ושיטות הדמיה חיות להדמיית ארגון ציטופלסמי דינמי

כאן אנו מציגים פרוטוקול לביטוי חלבוני צומת פערים בביציות קסנופוס ורישום זרם צומתי בין שתי ביציות באמצעות מגבר מסחרי המיועד לרישומי מהדק מתח ביציות כפול במצב מדידת זרם צד גבוה.

הקלטת זרם צומת גאפ מביציות קסנופוס

למד טכניקת cut-open Vaseline gap לרישום זרמים יוניים ומעברי שער ב-Xenopus oocytes ברזולוציה גבוהה. שיטה זו מאפשרת ניתוח קינטיקה מהירה של ערוצי יונים תלויי מתח.

גלה סרטונים נוספים