How does RNA interference work to silence genes in C. elegans?

Double-stranded RNA enters C. elegans cells after ingestion. The enzyme Dicer cleaves dsRNA into short interfering RNA (siRNA), 21-23 nucleotides long. The siRNA associates with the RNA-induced silencing complex (RISC) and binds target mRNA via complementary base pairing, leading to mRNA degradation and gene knockdown.

What is the first step in preparing bacteria for RNAi experiments?

Transform the plasmid encoding your target dsRNA into HT115(DE3) E. coli strain, which lacks RNA polymerase III and contains an IPTG-inducible T7 DNA polymerase gene. Also transform bacteria with an empty plasmid as a control. Spread transformed bacteria on LB agar plates containing tetracycline and carbenicillin, then incubate overnight at 37°C.

Why is worm synchronization important before RNAi treatment?

Synchronizing developmental stages ensures that observed phenotypic differences result from gene knockdown rather than developmental variation. Transfer L4 worms to RNAi plates overnight at 20°C to become young adults, then move them to new plates for 6-8 hours to lay eggs. This produces developmentally synchronized progeny for analysis.

How do researchers use RNAi to perform reverse genetic screens?

Reverse genetic screens knock down known genes from a library and assess phenotypic results to discover gene function. Researchers culture bacteria expressing dsRNA for many C. elegans genes on multi-well plates and feed them to worms. Phenotypic effects reveal normal in vivo gene functions and can be automated for high-throughput analysis of thousands of genes.

What happens during the bacterial culture preparation phase?

Select a single bacterial colony and add it to 1 ml LB broth with 100 μg/ml ampicillin. Incubate overnight at 37°C with agitation. Then add 5 ml fresh LB broth with ampicillin and incubate 4-6 hours at 37°C. This culture is then added to RNAi worm plates and incubated overnight at 37°C to create a bacterial lawn.

What phenotypes can be observed when analyzing RNAi-treated worms?

Compare RNAi knockdown worms with controls and note differences in size, developmental stage, morphology, and localization patterns of fluorescently tagged proteins. Scientists can also assess developmental timing effects, such as genes that delay development when knocked down, or genes involved in organ development and other biological processes.

How is a microscope slide prepared to visualize C. elegans?

Tape two glass slides with labeling tape as spacers. Place a clean slide between them and pipet 150 μl of 4% molten agar onto it. Cover with a perpendicular slide, then gently separate. Add 10 μl sodium azide anesthetic to the agar pad, transfer worms using a platinum wire pick, add a cover slip, and observe under a microscope.

RNAi in C. elegans

0 צפיות09:51 דק׳

הפרעות RNA, או RNAi, היא טכניקה נפוצה שבה RNA נטוש כפול הוא הציג אורגניזם, וכתוצאה מכך השתקת גנים ממוקדת. תגלית הנובל הזוכה של הפרעות RNA אפשרה לחוקרים להשתיק כל גן C. elegans כדי לקבוע את תפקידו. אנחנו יכולים לגרום RNAi ב C. elegans על ידי הכנת צלחות הראשונות עם E. coli המבטאים dsRNA גן היעד, אשר התולעים יאכלו. לאחר מכן, תולעי שלב הזחל הרביעי מועברות לצלחות RNAi ומותר להטיל ביצים. בשלב הרצוי של הפיתוח הצאצאים נאספים ומבקיעים עבור פנוטיפים.

טכנולוגיית RNAi משמשת לעתים קרובות ב- C. elegans כדי לנהל מסכים גנטיים הפוכים, מסכי תפוקה גבוהה אוטומטיים, ככלי לחקר תהליכים התפתחותיים. בסרטון זה, נסביר את הרעיון של הפרעות RNA, להדגים כיצד להשתמש בטכניקת RNAi ב- C. elegans, ולדון כיצד מדענים משתמשים ב- RNAi ככלי להבנת תהליכים ביולוגיים נרחבים טוב יותר.

בואו נתחיל על ידי הראשון מראה לך איך הפרעות RNA עובד. במקרה של C. elegans, התולעים ניזונות מחיידקים, אשר השתנו עם plasmids כי קוד עבור RNA נטוש כפול משלים לגן שאתה רוצה להשתיק. כאמור, C. elegans יהיה להאכיל על החיידקים שהשתנו. באמצעות מנגנון לא ידוע כרגע, dsRNA נכנס לרקמת C. elegans לאחר שנבלע.

ברגע שהוא בתוך התא, האנזים דיקר מבקע את הרנ"א הכפול התקוע לתוך RNA קצר, או siRNA, שהוא בין 21 ל 23 נוקלאוטידים. לאחר מכן, siRNA מקשר עם RNA המושרה מתחם ההשתקה, הידוע גם בשם "RISC", והופך unwound. לאחר מכן, קומפלקס siRNA/RISC קושר את ה- mRNA היעד באמצעות שיוך בסיס משלים. זה מוביל להשפלה של ה-mRNA, ובכך להפיל את הגן הזה.

לפני תחילת ההליך, החיידקים המביעים את הרנ"א הכפול התקוע של עניין צריך להיות מוכן. ספריות של חיידקים המכילים פלסמידים קידוד dsRNA עבור אלפי גנים זמינים מסחרית. אחרת, רצף גן היעד צריך להיות משוכפל לתוך plasmid באמצעות טכניקות שיבוט סטנדרטיות. הפלסמיד מכיל גן לעמידות באמפיצלין אנטיביוטי, אשר ניתן להשתמש בו כדי לבחור עבור מושבות חיידקים המכילים את plasmid.

לאחר מכן, השתמש בטכניקות סטנדרטיות כדי להפוך את הקידוד הפלסמיד של dsRNA של עניין לזן (DE3) של חיידקי E. coli שיבטאו את הרנ"א הכפול. כמו כן, להפוך את החיידקים עם plasmid ריק כמו שליטה. חשוב לציין, הזן של E. coli המשמש בניסויים אלה חסר RNA פולימראז III, אשר אחרת היה לעכל RNA נטוש כפול. חיידק זה מכיל גם גן IPTG לא ניתן לתדלוק DNA T7, אשר מתמלל את ה- dsRNA ב plasmid. לבסוף, החיידקים (DE3) הם גם טטרציקלין וגם קרבניצילין עמידים, כדי לשמור על ביטוי RNA פולימראז III ולמנוע צמיחה חיידקית לא רצויה.

יש להפיץ את חיידקי HT115(DE3) שעברו טרנספורמציה על לוחות אגר LB המכילים 12.5 מיקרוגרם/מ"ל טטרציקלין ו-25 מיקרוגרם/מ"ל קרבניצילין. דגירה בלילה ב 37 °C (50 °F) ולמחרת בבוקר מושבות חיידקים יהיו נוכחים על הצלחות. לאחר מכן, בחר מושבת חיידקים אחת, ולהוסיף אותו 1 מ"ל של מרק LB המכיל 100 מיקרוגרם / מ"ל של אמפיצלין לבחור עבור חיידקים המכילים את plasmid. דגירה לילה ב 37 °C (50 °F) עם עצבנות. לאחר הדגירה הלילית, להוסיף 5 מ"ל של מרק LB המכיל 100 מיקרוגרם / מ"ל של אמפצילין לתרבות, ודגרה במשך 4-6 שעות נוספות ב 37 °C (7 °F).

ברגע שהחיידקים מוכנים, לוחות תולעת RNAi צריכים להיות מוכנים להאכלה. לוחות תולעת RNAi מכילים: אגר, מים, קרבניצילין, תערובת בינונית תולעת, ו- IPTG כדי לגרום לפולימראז ה- DNA T7 בחיידקים המתמללים את ה- dsRNA בפלסטיד. הוסיפו 0.5 מ"ל של תרבית חיידקים לצלחות תולעי RNAi ודגרו למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס, ויצרו מדשאה חיידקית.

לפני הוספת תולעים ללוחות RNAi, חשוב לסנכרן את השלב ההתפתחותי של התולעת, כך שכל ההבדלים שנצפו פנוטיפ אינם חפץ של השלב ההתפתחותי. על מנת לסנכרן את השלבים ההתפתחותיים, תחילה לעקר להבה פיק חוט פלטינה.

השתמש בבחירת התולעת כדי להוסיף תולעי L4 לכל צלחת RNAi, ודגרה לילה ב 20 °C (70 °F), המאפשר להם להיות מבוגרים מטילי ביצים צעירים. לאחר מכן, להעביר צעירים לצלחת RNAi חדשה ודגור במשך 6-8 שעות ב 20 °C (70 °F), שבמהלכו מטילים ביצים. ברגע שכל המבוגרים יוסרו, ביצים אלה יהיו מסונכרנות התפתחותית. לבסוף, לאפשר תולעים לגדול על לוחות RNAi עד שהם הגיעו לשלב ההתפתחותי של עניין לניתוח.

על מנת לדמיין את התולעים, שקופית חייבת להיות מוכנה עם כרית אגר 4%. ראשית, קלטת 2 שקופיות זכוכית עם סרט תיוג, יצירת מרווחים המבטיחים עובי אחיד של משטח אגר. מניחים מגלשת זכוכית נקייה בין שני המרווחים וצינור על 150 μl של 4% אגר מותך על המגלשה. לכסות במהירות את אגר מותך עם שקופית נוספת בניצב למרווחים. הפרד בעדינות את השקופיות ואת כרית אגר יהיה דבוק באחת השקופיות.

לאחר מכן, להוסיף 10 μl של הרדמה כגון נתרן אזיד כרית אגר כדי לשתק את בעלי החיים. בעזרת מלפפון חבור פלטינה, העבירו תולעים לרפידת אגר עם חומר הרדמה והוסיפו תלוש כיסוי. לבסוף, התבונן בתולעים תחת מיקרוסקופ. השווה תולעים שיש להם RNAi נוק-אאוט גנים עם פקדים, ולשים לב הבדלים בגודל, שלב התפתחותי, מורפולוגיה, דפוסי לוקליזציה של חלבונים מתויגים פלואורסצנטית, ופנוטיפים פוטנציאליים אחרים.

אחד היישומים החשובים ביותר של הפרעות RNA הוא היכולת לבצע בקלות מסכים גנטיים הפוכים. מסך גנטי הפוך הוא גישה לגילוי תפקוד הגנים על ידי הפלת אוסף ידוע של גנים והערכה של התוצאה הפנוטיפית. לדוגמה, חוקרים יכולים להשתמש בספרייה של חיידקים המבטאים dsRNA עבור כמעט כל הגנים בגנום C. elegans. חיידקים אלה מתורבתים על לוחות רב-באריים ומוזן לתולעים. לאחר מכן, ניתן להעריך את ההשפעות הפנוטיפיות של RNAi של גנים רבים, נותן תובנה על פונקציות גן vivo נורמלי.

מסכים גנטיים אוטומטיים הם סוג של מסך גנטי הפוך כי הם תפוקה גבוהה מאוד. במסכים גנטיים אוטומטיים, ניתן להפיל את כל הגנום C. elegans בקלות רבה באמצעות טיפול רובוטי באלפי שיבוטים חיידקיים, ושימוש במכשירים מיוחדים לניתוח כמותי.

לדוגמה, תולעים המבטאות כתב פלואורסצנטי מהונדס עבור הגן הפפטיד האנטי מיקרוביאלי nlp 29, כפופים RNAi נוקאאוט של אלפי גנים באמצעות האכלה חיידקית. במקביל, התולעים מוצגות לנבגים פטרייתיים. לאחר מכן, ניתן להעריך את תגובת הפפטיד האנטי-מיקרוביאלית לפטריה.

ג. פיתוח אלגנס נחקר לעתים קרובות באמצעות RNAi. מדענים יכולים להשתמש בהפרעות RNA כדי להפיל כל גן (או אוסף של גנים) של עניין ולהעריך בדיוק כיצד הגן הזה משפיע על תהליכים במהלך ההתפתחות ו/או התזמון ההתפתחותי. לדוגמה, RNAi נוקאאוט עשוי לחשוף גנים המעכבים את ההתפתחות כאשר הפילו, או גנים המעורבים בהתפתחות איברים.

הרגע צפית בהקדמה של ג'וב להפרעות רנ"א בסי אלגנס. סקרנו כיצד פועלת הפרעות RNA וכיצד להשתמש בהפרעות RNA ב- C. elegans באמצעות האכלה חיידקית. הפרעות RNA הן כלי רב ערך למסכים גנטיים הפוכים, כולל מסכי תפוקה אוטומטיים גבוהים, והוא גם כלי שימושי לחקר הפיתוח. תודה שצפיתם!

הפרעות RNA (RNAi) היא טכניקה נפוצה שבה RNA נטוש כפול הוא הציג באופן אקסוגני לתוך אורגניזם, גרימת נוקאאוט של גן היעד. בנמטודה, C. elegans, RNAi הוא קל…