ניתוח ציטולוגית של תאי זרע: הכנות בשידור חי והקבועות של
20 בינואר 2014
שיטות לבידוד והכנת דגימות דרוזופילה אשכים (לחיות וקבוע) להדמיה על ידי שלב בניגוד ומיקרוסקופ פלואורסצנטי מתוארים במסמך זה.
המטרה הכללית של נוהל זה היא לנצול ולהכין אשכים של זבובים לצורך מיקרוסקופיה. זאת על ידי הפקה ראשונית של זוגות אשכים מבטנו של זבובים זכרים. השלב השני הוא לקרוע את האשכים בשלב ההתפתחות המתאים ולמעוך אותם כדי לשחרר את התאים שבתוכם.
בשלב הבא, נבצע קיבוע של האשכים המעוכים ולאחר מכן נדגיר אותם בנוגדנים ראשוניים ושניוניים. השלב הסופי הוא קיבוע של הרקמה על עלית זכוכית לצורך דימוי. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה או באימונופלואורסצנציה כדי לבחון תאים בשלבים שונים של הספירמטוגנזה לאיתור פגמים ומורפולוגיה, וכדי לבחון לוקליזציות תת-תאיות של חלבונים שונים.
שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה ההתפתחותית, כגון זיהוי תפקידים קריטיים של חלבונים במהלך התקדמות הספירמטוגנזה. הדגמה חזותית של נתיחה של אשכים ב-RAs היא קריטית, כיוון שמי שאינו מנוסה בפרוצדורה זו עלול להיתקל בתחילה בקושי באיתור האשכים בתוך בטן הזבוב. בנוסף, קל יותר להדגים מאשר לתאר במילים את הדרך המצליחה ביותר לביצוע ריסוק (squashing) של הרקמה.
כדי להתחיל בדיסקציה, הרדימו את הזבובים בתוך בקבוק או מבחנה באמצעות זרם של carbon dioxide. לאחר מכן, העבירו את הזבובים המורדמים למשטח עבודה לזבובים (fly pad). מיינו את הזבובים תחת מיקרוסקופ דיסקציה באמצעות מכחול קטן כדי לאסוף כשישה עד שמונה זכרים מסוג oph מהגנוטיפ הרצוי.
בשלב הבא, הסר את הכנפיים מכל זבוב באמצעות פינצטה. פעולה זו תמנע מהזבובים לצוף בנוזל. במהלך הדיסקציה, הוסף 500 µL של phosphate buffered saline או PBS בטיפה אחת על גבי צלחת דיסקציה מצופה סיליקון עם רקע שחור.
לאחר מכן, כוון את הפינצטה לעבר הקצה הקדמי של אחת הזבובים שכונפיהם הוסרו. אחז בה באזור החזה וטבול אותה בטיפת ה-PBS. זהה את המבנה החום הכהה הממוקם בקצה האחורי של הבטן הוונטרלית, והשתמש בזוג פינצטות נוסף כדי לתפוס ולמשוך את איברי המין החיצוניים לאחור עד להפרדתם מהבטן.
ברוב המקרים, האשכים, שלפוחית הזרע ובלוטת העזר יוסרו מהבטן יחד עם איברי המין החיצוניים. עם זאת, אם הם לא הוסרו, הכניסו פינצטה אל תוך הבטן והוציאו בעדינות את האשכים. הפרידו את האשכים מבלוטות העזר ומאיברי המין החיצוניים באמצעות שתי פינצטות.
הבדילו בין אשכים מסוג הטיפוס הפראי (wild type) לבין רקמות לבנות סמוכות על פי צבעם הצהוב. כדי להכין את הדגימה לדימוי חי, השתמשו בפינצטה כדי להניח בעדינות שני עד שלושה זוגות של אשכים בטיפה של 4 עד 5 µL של PBS על ליתור זכוכית ריבועי. לאחר מכן, קרעו.
פתחו כל אשך באמצעות פינצטה במיקום גובה מתאים כדי למקסם את נוכחותם של סוגי תאי נבט הרצויים בדגימה. תכולת האשכים תצא מהאזור הקרוע אל על העגלה. במהלך שלב המעיכה להעשרת הספירמטוגוניה והספירמטוציטים, קרעו את האשכים בסמוך לקצה האפיקלי שלהם כדי להגביר את הריכוז.
עבור ספרמטוציטים וספרמטידות, קרעו את האשכים במיקום הנמצא מעט בסיסלית לרמה אחת כדי להעשיר את הדגימה בתאי נבט בוגרים יותר. קרעו את האשכים בקרבה למקום בו מתחיל הקימור. השלב הבא הוא ריסוק האשכים על ידי הנחת זכוכית כיסוי בעדינות מעל סמיכה של מיקרוסקופ.
אין להפעיל לחץ ידנית ויש להימנע מכליאת בועות אוויר. יש להשתמש בדגימה תוך 15 דקות מההכנה כדי לצפות בתאים חיים. באמצעות מיקרוסקופ ניגודי פאזה (phase contrast), יש לספוג בעדינות כל עודף נוזל מתחת לזכוכית המכסה באמצעות מגב ניקוי, כדי לאפשר את השטחת הדגימה עד שהתאי הנבטים יהיו במיקוד ברור.
בצעו הקפאה מהירה (Snap freeze) לשקופיות המוכנות המכילות אשכים בשיטת ריסוק (squash), על ידי טבילתן באמצעות מלקחי מתכת בחנקן נוזלי עד להפסקת הבעבוע של הנוזל. הסירו מיד את זכוכית הכיסוי באמצעות להב תער. לאחר מכן, העבירו את השקופיות באמצעות מלקחי מתכת למעמד שקופיות מזכוכית שקודר קירור ומולא ב-95% ethanol קר מאוד, ואחסנו את הדגימה בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
העבירו את השקופיות שעברו שיווי משקל למעמד שקופיות זכוכית המלא ב-4% formaldehyde ב-PBS בתוספת 0.1% Triton X 100 או PBST, ואחסנו בטמפרטורת החדר למשך שבע דקות. לאחר מכן, העבירו את השקופיות למעמד מלא ב-PBS. שטפו את השקופיות ב-PBS למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר על ידי ריקון התמיסה מהמעמד והחלפתה בתמיסת PBS רעננה.
חזרו על השטיפה פעם אחת. השליכו את ה-PBS והטבילו את השקופיות ב-PBST למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי להגמיש את ממברנות התאים. לאחר מכן, שטפו את השקופיות שלוש פעמים ב-PBS למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. שרטטו עיגול סביב הרקמה המעוכה על השקופית באמצעות עט מחסום הידרופובי, כדי להגביל את תמיסות הנוגדנים ולשמור על לחות הרקמה בכל עת במהלך ביצוע הצביעה האימונית.
לאחר מכן, הוסיפו 30 עד 40 µL של נוגדן ראשוני המדולל ב-PBST לרקמה בתוך המעגל. הדגרימו את השקופית בתא לח ומחשיך למשך שעתיים בטמפרטורת החדר, או למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C לאחר הדגירה עם הנוגדן הראשוני. שטפו את השקופיות שלוש פעמים ב-PBS למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, הוסיפו לרקמה 30 עד 40 µL של נוגדן שני משלים המצומד לפלואורופור ומדולל ב-PBS, והדגירו בחושך למשך שעה אחת עד שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את הפלטים שלוש פעמים ב-PBS למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לבסוף, הוסיפו 30 עד 40 µL של תמיסת DAPI לרקמה בתוך המעגל.
הניחו בעדינות זכוכית כיסוי מעל הרקמה, תוך הקפדה יתרה על מניעת כליאת בועות אוויר. אם מופיעות בועות אוויר, הזיזו בזהירות את זכוכית הכיסוי מבלי להרוס את הדגימה, עד שהבועות יצאו מצדי הכיסוי. ספגו את העודפים משולי השקופית באמצעות מטפית ניקיון.
לאחר מכן, אטמו את זכוכית הכיסוי באמצעות לק ציפורניים ובחנו את התאים הצבועיים אימונו-היסטוכימית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה תוך שלוש עד ארבע שעות. איור זה מציג את מיקומם של שלבי הבשלה שונים של תאים בתוך אשכי Drosophila. שלב 1 מכיל תאים צעירים הנמצאים בשלבים מוקדמים של ספרמטוגנזה, ושלב 3 מכיל תאי זרע בשלים יותר.
רמה שתיים מכילה אוכלוסייה מעורבת של תאי רכבת נבטות מיאוטיים ופוסט-מיאוטיים. תמונת ניגודיות פאזה תואמת מראה את שחרורם של ספרמטוגוניה ותאי ספרמטוציטים ראשוניים בשלב מוקדם ומאוחר כאשר האשכים נקרעים ברמה אחת. החץ הצהוב מצביע גם על התמזגות של שני תאים או יותר המקושרים ביניהם כתוצאה מציטוקינזה לא מלאה.
תוצר לוואי של פרוצדורת המעיכה המוצגת כאן הוא תמונת ניגודיות פאזה תואמת המראה שחרור של ספרמטוציטים ראשוניים מאוחרים ותאים פוסט-מיוטיים, כולל ספרמטידות עגולות, ספרמטידות מתארכות וזרע בוגר כאשר האשכים נקרעו ברמה שתיים. ניתן להשתמש בדימות בניגודיות פאזה של אשכים מעוכים כדי לזהות בקלות פגמים בספרמטידות העגולות השכיחות. ספרמטידות מסוג בר (wild type) בעלות גרעין בהיר בפאזה מוצגות כאן כשהן מחוברות לצבר מיטוכונדריאלי בודד כהה בפאזה בגודל שווה בקירוב.
בניגוד לכך, ספרמטידים מאשכי Aun מכילים גרעינים קטנים מרובים ואגרגט מיטוכונדריאלי אחד גדול, כתוצאה מכישלון בציטוקינזה ושגיאות בהפרדת כרומוזומים. תמונות גווניי האפור המוצגות כאן הן מהכנה של אשכים בשיטת מעיכה (squash), שנצבעו בריאגנטים המזהים בצבע את המיקרוטובוליים, ה-DNA והצנטרוסומים. התמונות המשולבות מראות ספרמטוציט במצב חלוקה, שדה רחב של ספרמטידים עגולים ואגודה של זרעים בשלים. לאחר רכישת מיומנות בהכנת דגימות למיקרוסקופיה בניגודי פאזה, ניתן לבצע את התהליך בתוך 20 עד 30 דקות.
ניתן להכין דגימות עבור מיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה תוך שש שעות אם הפעולה מבוצעת כראוי. בנוסף לעיבוד אשכים של oph לצורך מיקרוסקופיה, ניתן להשתמש באשכים מבודדים כחלופה לצורך ניתוח ביוכימי של חלבונים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטות לבידוד והכנה של דגימות אשחכים של Drosophila עבור מיקרוסקופיה. הטכניקות כוללות דיסקציה, קיבוע ודגירה עם נוגדנים לצורך תצפית על מבנים תאיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה
- מיקרוסקופיה
רקע
- Drosophila משמשת כאורגניזם מודל במחקר ביולוגי.
- התפתחות האשכים היא קריטית להבנת הספרמטוגנזה.
- טכניקות מיקרוסקופיה מאפשרות תצפית תאית מפורטת.
- אימונופלואורסצנציה יכולה לחשוף את מיקום החלבון.
מטרת המחקר
- להשקיף ולהכין אשכים עבור מיקרוסקופיה.
- לתצפת על תאים בשלבים שונים של ספרמטוגנזה.
- לזהות פגמים ומורפולוגיה בתאים מתפתחים.
שיטות שנחלקו
- דיסקציה של זוגות אשכים מזכרי Drosophila.
- קריעה ומעיכה של האשכים לשחרור התאים.
- קיבוע של אשכים מעוכים לצורך ניתוח המשך.
- אינקובציה עם נוגדנים ראשוניים ושניוניים.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של אשכים לצורך דימוי.
- תצפית על מבנים תאיים בשלבים התפתחותיים שונים.
- זיהוי פגמים בתהליך הספירמטוגנזה.
- מיקום של חלבונים בתוך תאים.
מסקנות
- השיטות מספקות דרך מהימנה להכנת אשכים של Drosophila למיקרוסקופיה.
- הממצאים תורמים להבנת תהליך הספרמטוגנזה.
- ניתן ליישם טכניקות אלו לחקר תהליכי התפתחות אחרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה מאפשר ויזואליזציה מפורטת של התפתחות תאי גמטואנאליים במודל גנטי ניתן לטיפול, ובכך תומך בתיקוף מטרות בביולוגיה של הרבייה ובמחקרים מכניסטיים של חלוקת תאים. באמצעות אספקת הכנה הדירה של אשכים של Drosophila עבור מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה ואימונופלואורסצנציה, הוא מקל על סריקה פנוטיפית של מוטנטים המשפיעים על הספירמטוגנזה. גישה זו מסייעת בהפחתת סיכונים בהשערות לגבי תפקוד חלבונים במהלך הגמטוגנזה באמצעות תצפית ישירה על לוקאליזציה סוב-סלולרית ופגמים התפתחותיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות על ידי ויזואליזציה של לוקליזציית חלבונים במהלך שלבי הספֶּרְמָטוֹגֶנֶזִיס.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף של מטרות פונקציונליות באמצעות תצפית ישירה על פנוטיפים תאיים ברקעים מוטנטיים.
- ערך ניבוי: מסייע בהסרת סיכונים מנגנוניים על ידי קישור הפרעות מולקולריות לפגמים ניתנים לתצפית בהתפתחות תאי הנבט.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: ייצור דגימות ביולוגיות סטנדרטיות המתאימות לסריקה כמותית מבוססת דימויים של הפרעות גנטיות או כימיות.
- שחזוריות: מאפשר הכנה עקבית של פריסות אשכים (testes squashes) לקבלת תוצאות אמינות של מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה ופלואורסצנציה לאורך ניסויים שונים.
- מדרגיות: תמיכה בעיבוד מקבילי של גנוטיפים מרובים לצורך ניתוח השוואתי של פגמים בספרמטוגנזה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מספק מערכת הרלוונטית למחלה לצורך חקר מנגנונים שמורים של מיוזה וציטוקינזה, הישימים למחקר של אי-פריון.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין ממצאי גילוי ב-Drosophila למודלים פרה-קליניים באמצעות נתיבים שמרים של ספרמטוגנזה.
- קידום מותאם סיכונים: מאפשר הערכה פנוטיפית בשלב מוקדם כדי לתעדף מטרות בעלות השפעה התפתחותית מדידה.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים, תומכת בבדיקת השערות בתיקוף מטרות ומייצרת נתוני דימיון כמותיים לזיהוי מובילים במסלולים של ביולוגיה רבייתית.
- ביולוגיה של גילוי: מסייעת בבדיקת היפותזות ובהבהרת מסלולים על ידי מתן אפשרות לוויזואליזציה של התקדמות תאי זרע ופגמים ביניהם.
- סריקה: מספקת דגימות מוכנות לבדיקה עם פלטים כמותיים להערכת משפעים גנטיים או פאראמקולוגיים של הספירמטוגנזה.
- אנליטיקה: מייצרת תוצרי הדמיה מדידים (למשל, מורפולוגיה של תאים, דפוסי לוקליזציה) להשוואת תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: תומכת בהמשכיות פרה-קלינית על ידי מידול של מנגנונים שמורים של גמטוגנזה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לשימוש חוזר לסריקה בביולוגיה התפתחותית על פני מספר קווי מוטציות או תנאי טיפול.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתפקידי המטרה על ידי הפחתת העמימות בפירושים מכניסטיים באמצעות תצפית ציטולוגית ישירה.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות של הכנת דגימות תאי נבט בין מעבדות שונות.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות של go/no-go על ידי אספקת ראיות פנוטיפיות להפחתת סיכונים של מטרות בשלב מוקדם של הגילוי.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות מותאם סיכון על בסיס פנוטיפים התפתחותיים ניתנים לתצפית במערכת התואמת לסריקה רב-דגימתית (high-throughput).
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ב-Drosophila, בדיסקציה ובטכניקות של מיקרוסקופיה.
- תלוי במיקרוסקופי דיסקציה, במערכות דימיון פלואורסצנטיות או במיקרוסקופיית ניגוד מופע (phase-contrast), ובכלי היסטולוגיה סטנדרטיים.
- מחייב סטנדרטיזציה של עיתוי המעיכה (squash), הקיבוע ודגירת הנוגדנים בין המשתמשים השונים כדי להבטיח תוצאות עקביות.
- שיקולי התאמה כוללים כיוונון של מיקום הקריעה ולחץ המעיכה בהתאם למטרות שונות של העשרה של תאי קו הנבט.
- מגבלות מעשיות כוללות את שבירות הרקמה במהלך המעיכה ואת הצורך בדימיון חי מהיר תוך 15 דקות מההכנה.
