Name: ניתוח ציטולוגית של תאי זרע: הכנות בשידור חי והקבועות של דרוזופילה אשכים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: למדו הכנת אשכי זבובי פירות לצפייה מיקרוסקופית באמצעות ניתוח, ריסוק, קיבוע וצביעה נוגדנים. שיטה זו מאפשרת מחקר שלבים שונים בסpermatogenesis וזיהוי ליקויים בפיתוח תאי זרע בדרוזופילה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות למייקל אנדרסון להקמה במעבדה לי שיטות המקובלות אלה לחקר תאי זרע עם ייעוץ מקצועי מקארן חאלס. ה &#39;עוד וי&#39; אקיאמה-Oda סיפקו בנדיבות γ-טובולין-GFP לטוס מניות. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH R01 לLAL (GM074044).

1. Dissection אשכים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי זבובים בבקבוק או בקבוקון באמצעות זרם של CO 2 ולהעביר למשטח לטוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיין זבובים תחת מיקרוסקופ לנתח באמצעות מכחול קטן, ולאסוף מספר מתאים (תלוי בניסוי) של הזכרים דרוזופילה של גנוטיפים הרצויים. זכרים צעירים (בן 0-2 ימים) הם אידיאליים לבחינת תאים בשלבים המוקדמים של תאי זרע (למשל spermatogonia, spermatocytes, וspermatids פוסט meiotic המוקדם), ואילו גברים מעט מבוגרים (בן 2-5 ימים) הם אידיאליים לבחינת תאים בשלבים הסופיים של תאי זרע (בפרט, להבשיל זרע). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים כדי להסיר את הכנפיים מלטוס (כדי למנוע מהזבובים צפים בנוזל בזמן נתיחה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף ~ 500 מיליליטר של פוספט שנאגרו מלוח (130 mM NaCl, 7 מ&quot;מ Na 2 HPO 4, 3 מ&quot;מ לאא 2 PO 4; PBS) בירידה לצלחת לנתיחה מצופה סיליקון עלרקע שחור. תמיסות מימיות אחרות שימשו בהצלחה לאשכים לנתיחה 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקודת המלקחיים לכיוון הקדמי של הזבוב, לתפוס אותו על ידי בית החזה, ולטבול אותו בטיפת PBS. במהלך הצגה מבעד למיקרוסקופ לנתח, להשתמש בזוג נוסף של מלקחיים לתפוס ולמשוך את אברי המין החיצוניים (מבנה בצבע חום כהה הממוקם בקצה האחורי של בטן הגחון) בדיעבד עד שהוא מתנתק מהבטן. ברוב המקרים, האשכים, שלפוחית ​​זרע ובלוטת אבזר יוסרו מהבטן יחד עם אברי המין החיצוניים, אם לא, להכניס זוג אחד של מלקחיים לתוך הבטן ולהקניט את האשכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אשכים נפרדים מבלוטת אבזר ואברי מין חיצוני באמצעות שני זוגות מלקחיים בירידת PBS (איור 2). אשכים wild-type בקלות להבחין בין רקמות שכנות הלבנות לפי צבעם הצהוב. פנה מייד לצעד 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבודד אשכים מזכרי pharate (i<html> .. הדואר הסגור בתוך המקרה גלמי), צריך קודם לבצע צעד נוסף שכרוך בהסרה לטוס מהמקרה גלמי; שלב זה כבר תואר בעבר במקום אחר ביום 31. להמשיך עם נתיחה כלאשכים למבוגרים מתחילים בצעד 1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבודד אשכים מזכרי זחל, לבצע שינוי של פרוטוקול לבידוד השחלות זחל דרוזופילה 32. בקצרה, זחלי זכר ניתן להבחין בין זחלים נשיים על ידי הנוכחות של זוג המבנים גדולים, ברורים, סגלגלים (אשכים זחל) משובצים בשליש האחורי של השומן בגוף. כדי לבודד אשכים זחל, באופן חלקי לפשוט את העור לפתוח את זחל הזכר לבודד את האשכים ושומן הגוף סביב מהבטן כפי שתואר עבור הבידוד של השחלות זחל. פנה מייד לשלב 2 של הפרוטוקול המתואר במסמך זה; האשכים יכולים להיות מאוחר יותר הוסרו מהגוף השומן רק לפני ההרכבה (שלבים 2.3 או 3.14) כפי שתואר לשחלות 32. </li></ol>ss = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. לדוגמא הכנה והדמית חיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש זוג מלקחיים למקום בעדינות 2-3 זוגות של אשכים בירידה של 4-5 מיליליטר של PBS על להחליק את מכסה זכוכית מרובע. שים לב שהיחס בין מספר אשכים לPBS עוצמת שמע עשוי צריך להיות מותאם: יותר מדי נוזלים ימנעו תאים מלהתפשט כראוי כאשר נמעכו, ואילו נוזל מעט מדי יגרום לתאים להתפוצץ כאשר מעוך. אופציונאלי: כיסוי siliconized שימוש מחליק כדי למזער את ההיצמדות של רקמות כדי לכסות להחליק בשלב 3.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש זוג המלקחיים לקרוע פתוח כל אשך בעמדה מתאימה כדי למקסם את נוכחותם של סוגי התאים הרצויים בתאי מין בהכנה (שים לב שהתוכן של האשך תהיה בעיקר יציאה מהאזור הקרוע לשקופית במעיכה צעד.) כדי להעשיר לspermatogonia וspermatocytes, לקרוע לפתוח את האשך סמוך לקצה הקודקוד שלה (ברמה 1, איור 2). כדי להעשיר לspermatocytes וspermatids, דמעה לפתוח את האשך בקופהition מעט בסיס לרמת 1 (רמה 2, איור 2). כדי להעשיר את תאים בתאי מין בוגרים יותר, קורע את האשך קרוב יותר למקום שבי העקמומיות מתחילה (רמה 3, תרשים 2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח בעדינות שקופית מיקרוסקופ זכוכית על להחליק את המכסה למחוץ את האשכים; לא להפעיל לחץ באופן ידני כמו המשקל של להחליק את המכסה בלבד מספיק כדי להשיג מדגם מעוך כמו שצריך. נסה להימנע מלכידת בועות אוויר. אופציונאלי: מיקרוסקופ השתמש פולי-L-ליזין מצופה מחליק לקדם היצמדות של רקמות כדי להחליק בשלב 3.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בתכשיר באופן מיידי (באופן אידיאלי בתוך 15 דקות של הכנה) להתבונן תאי חיים על ידי מיקרוסקופ שלב בניגוד; לזבובים מהונדסים עם ביטוי של חלבונים מתויגים fluorescently באשכים, ניתן לבדוק תאי חיים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשלב זה. לחלופין, להמשיך עם קיבעון ומכתים נוגדן (פרוטוקול 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות פתיל את נוזלי עודפים מתחת coverslip באמצעות ניקוי wipe לאפשר השטחת ההכנה עד תאי הנבט הם בבירור בפוקוס. </li></ol> 3. פורמלדהיד קיבוע ונוגדן מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד להקפיא כל שקופית המכילה אשכים מעוכים (מפרוטוקול 2) באמצעות מלקחי מתכת כדי לטבול אותו בקצרה בחנקן נוזלי (עד חנקן נוזלי מפסיק מבעבע). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את תלוש לכסות באופן מיידי באמצעות סכין גילוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במלקחי מתכת כדי להעביר שקופיות למדף זכוכית שקופית prechilled מלא באתנול 95% קרים כקרח (הכיתה spectrophotometric, נטול מתנול). חנות ב -20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במלקחי מתכת כדי להעביר שקופיות למתלת שקופיות זכוכית מלאות בפורמלין 4% ב-PBS בתוספת 0.1% טריטון X-100 (PBS-T). לאחסן בטמפרטורת חדר למשך 7 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במלקחי מתכת כדי להעביר שקופיות למתלת שקופיות זכוכית מלאות PBS. לשטוף שקופיות PBS במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. חזור על 1x. לבצע את כל שוטף על ידי השלכת פתרון במעמד שקופיות זכוכית ( <em&gt; כלומר. על ידי שפיכתו החוצה) והחלפה עם פתרון טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את PBS ולטבול את השקופיות ב-PBS-T ל30 דקות בטמפרטורת חדר כדי permeabilize קרום תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות PBS במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. חזור על 2x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסימת צעד (לא חובה): לטבול את השקופיות ב PBS בתוספת BSA 1% ל45 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בעט מחסום הידרופובי לצייר עיגול בשקופית סביב רקמה מעוכה (נראית בקלות בעין) על מנת להגביל את פתרונות הנוגדנים (הוסיפו בצעדי 3.9 ו3.11). הרקמות צריכה להישמר לחה בכל העת בעת ביצוע immunostaining. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 30-40 מיליליטר של נוגדן ראשוני (בדילול מלא PBS-T, 1:400 ל1:50, בהתאם לנוגדנים) לרקמה בתוך המעגל. אם החסימה בוצעה, לדלל נוגדן ראשוני ב-PBS-T בתוספת BSA 1%. נוגדן אנטי גמא טובולין (לצביעת centrosomes באיור 4) היה מדולל 1:100. דגירה בתא לח, כהה (קופסא פלסטיק סגורה לדוגמא.במגבות לחות נייר) עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר או הלילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות PBS במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר 3x. אם החסימה בוצעה, לשטוף פעמים PBS-T ופעם אחת ב-PBS (5 דקות בטמפרטורת חדר כל אחד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 30-40 מיליליטר של נוגדן fluorophore מצומדות המשני (בדילול 1:400 ב-PBS) לרקמות דגירה בחושך במשך 1-2 שעות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות PBS במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. חזור על 2x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 30-40 מיליליטר של תמיסת DAPI (0.2 מ&quot;ג / מיליליטר PBS) לרקמה בתוך המעגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח בעדינות להחליק את מכסה זכוכית על הרקמות, לטפל כדי למנוע לכידת בועות אוויר. אם בועות האוויר אמורות להופיע, לנוע בזהירות סביב להחליק את המכסה מבלי להרוס את הקישואים עד שהבועות לברוח מן הצדדים של להחליק את המכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ניקוי לנגב למחוק DAPI העודף מהקצוות של השקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום להחליק את המכסה לשקופית באמצעות לק ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בתכשיר זהבתוך 3-4 שעות הבאות כדי להציג תאי immunostained על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. עבור אחסון לטווח ארוך של שקופיות (עד לפחות כמה שבועות), יש להשתמש באמצעי תקשורת קשה הר מבוסס גליצרול עם DAPI, ושקופיות חנות ב -20 ˚ C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, לתקן את הדגימות במתנול במקום פורמלדהיד (תלוי באנטיגן). לאחר שסיים את הפרוטוקול כולו דרך שלב 3.2, לטבול את השקופיות של אשכים מעוכים במתנול 10 דקות ב -20 מעלות צלזיוס ולהמשיך בשלב 3.5 ואילך. </li></ol>

<ol><li>McKim, K. S., Joyce, E. F., Jang, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytological+analysis+of+meiosis+in+fixed+Drosophila+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytological analysis of meiosis in fixed Drosophila ovaries.</a> Methods Mol. Biol. 558, 197-216 (2009).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBonaccorsi%2C+S+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 87-109 (2000).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunostaining+of+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">Immunostaining of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1273-1275 (2011).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methanol-acetone+fixation+of+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">Methanol-acetone fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1270-1272 (2011).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+live+testis+squashes+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">Preparation of live testis squashes in Drosophila.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, (2011).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+fixation+of+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, (2012).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraformaldehyde+fixation+of+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 102-104 (2012).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F-actin+staining+of+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">F-actin staining of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 105-106 (2012).</li>
<li>Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+fluorescence+imaging+of+whole-mount+Drosophila+testes+for+studying+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis.</a> Anal. Biochem. 436, 55-64 (2013).</li>
<li>Singh, S. R., Hou, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistological+techniques+for+studying+the+Drosophila+male+germline+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunohistological techniques for studying the Drosophila male germline stem cell.</a> Methods Mol. Biol. 450, 45-59 (2008).</li>
<li>Zamore, P. D., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Drosophila+melanogaster+Testes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Drosophila melanogaster Testes.</a> J. Vis. Exp. (2641), (2011).</li>
<li>de Cuevas, M., Matunis, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stem+cell+niche%3A+lessons+from+the+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The stem cell niche: lessons from the Drosophila testis.</a> Development. 138, 2861-2869 (2011).</li>
<li>Fabian, L., Brill, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+spermiogenesis%3A+Big+things+come+from+little+packages%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages.</a> Spermatogenesis. 2, 197-212 (2012).</li>
<li>Giansanti, M. G., Sechi, S., Frappaolo, A., Belloni, G., Piergentili, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinesis+in+Drosophila+male+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Cytokinesis in Drosophila male meiosis.</a> Spermatogenesis. 2, 185-196 (2012).</li>
<li>Matunis, E. L., Stine, R. R., de Cuevas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+Drosophila+male+germline+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Recent advances in Drosophila male germline stem cell biology.</a> Spermatogenesis. 2, 137-144 (2012).</li>
<li>McKee, B. D., Yan, R., Tsai, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis+in+male+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Meiosis in male Drosophila.</a> Spermatogenesis. 2, 167-184 (2012).</li>
<li>Zoller, R., Schulz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+cyst+stem+cell+lineage%3A+Partners+behind+the+scenes%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">The Drosophila cyst stem cell lineage: Partners behind the scenes.</a> Spermatogenesis. 2, 145-157 (2012).</li>
<li>Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+and+microtubule+organization+during+premeiotic%2C+meiotic+and+early+postmeiotic+stages+of+Drosophila+melanogaster+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci.%22%5BJournal%5D)">Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis.</a> J. Cell Sci.. 107, 3521-3534 (1994).</li>
<li>Rebollo, E., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+spindle+checkpoint+in+Drosophila+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes.</a> EMBO Rep. 1, 65-70 (2000).</li>
<li>Castrillon, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+molecular+genetic+analysis+of+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster%3A+characterization+of+male-sterile+mutants+generated+by+single+P+element+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Toward a molecular genetic analysis of spermatogenesis in Drosophila melanogaster: characterization of male-sterile mutants generated by single P element mutagenesis.</a> Genetics. 135, 489-505 (1993).</li>
<li>Giansanti, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+meiotic+cytokinesis+in+Drosophila+males%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of meiotic cytokinesis in Drosophila males.</a> Mol. Biol. Cell. 15, 2509-2522 (2004).</li>
<li>Wakimoto, B. T., Lindsley, D. L., Herrera, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+comprehensive+genetic+analysis+of+male+fertility+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Toward a comprehensive genetic analysis of male fertility in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 167, 207-216 (2004).</li>
<li>Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFuller%2C+MT+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-147 (1993).</li>
<li>Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tokens+of+love%3A+functions+and+regulation+of+Drosophila+male+accessory+gland+products%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tokens of love: functions and regulation of Drosophila male accessory gland products.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 179-192 (1997).</li>
<li>Tram, U., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+seminal+fluid+proteins+are+essential+for+sperm+storage+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Male seminal fluid proteins are essential for sperm storage in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 153, 837-844 (1999).</li>
<li>Kemphues, K. J., Raff, E. C., Raff, R. A., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+in+a+testis-specific+beta-tubulin+in+Drosophila%3A+analysis+of+its+effects+on+meiosis+and+map+location+of+the+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mutation in a testis-specific beta-tubulin in Drosophila: analysis of its effects on meiosis and map location of the gene.</a> Cell. 21, 445-451 (1980).</li>
<li>Gunsalus, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+twinstar%2C+a+Drosophila+gene+encoding+a+cofilin%2FADF+homologue%2C+result+in+defects+in+centrosome+migration+and+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mutations in twinstar, a Drosophila gene encoding a cofilin/ADF homologue, result in defects in centrosome migration and cytokinesis.</a> J. Cell Biol. 131, 1243-1259 (1995).</li>
<li>Anderson, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asunder+is+a+critical+regulator+of+dynein-dynactin+localization+during+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Asunder is a critical regulator of dynein-dynactin localization during Drosophila spermatogenesis.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 2709-2721 (2009).</li>
<li>Sitaram, P., Anderson, M. A., Jodoin, J. N., Lee, E., Lee, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+dynein+localization+and+centrosome+positioning+by+Lis-1+and+asunder+during+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of dynein localization and centrosome positioning by Lis-1 and asunder during Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 139, 2945-2954 (2012).</li>
<li>Martins, A. R., Machado, P., Callaini, G., Bettencourt-Dias, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopy+methods+for+the+study+of+centriole+biogenesis+and+function+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Microscopy methods for the study of centriole biogenesis and function in Drosophila.</a> Methods in cell biology. 97, 223-242 (2010).</li>
<li>Maimon, I., Gilboa, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+staining+of+Drosophila+larval+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection and staining of Drosophila larval ovaries.</a> J. Vis. Exp. (10), (2011).</li>
<li>Gonzalez, C., Casal, J., Ripoll, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+chromosome+content+and+nuclear+diameter+in+early+spermatids+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genet.+Res%22%5BJournal%5D)">Relationship between chromosome content and nuclear diameter in early spermatids of Drosophila melanogaster.</a> Genet. Res. 54, 205-212 (1989).</li>
<li>Liebrich, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+cytochalasin+B+and+colchicine+on+the+morphogenesis+of+mitochondria+in+Drosophila+hydei+during+meiosis+and+early+spermiogenesis.+An+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue.+Res%22%5BJournal%5D)">The effects of cytochalasin B and colchicine on the morphogenesis of mitochondria in Drosophila hydei during meiosis and early spermiogenesis. An in vitro study.</a> Cell Tissue. Res. 224, 161-168 (1982).</li>
<li>Wong, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIP2+hydrolysis+and+calcium+release+are+required+for+cytokinesis+in+Drosophila+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">PIP2 hydrolysis and calcium release are required for cytokinesis in Drosophila spermatocytes.</a> Curr. Biol. 15, 1401-1406 (2005).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+cell+type+and+stage-specific+ectopic+gene+expression+and+RNAi+induction+in+the+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Tissue cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis.</a> Spermatogenesis. 2, 11-22 (2012).</li>
<li>Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+noncentrosomal+microtubules+to+spindle+assembly+in+Drosophila+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes.</a> PLoS Biol. 2, (2004).</li>
<li>Cheng, J., Hunt, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+live+imaging+of+stem+cells+in+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Stem+Cell.+Biol.%22%5BJournal%5D)">Time-lapse live imaging of stem cells in Drosophila testis.</a> Curr. Protoc. Stem Cell. Biol.. 2, 10-1002 (2009).</li>
<li>Sheng, X. R., Matunis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+the+Drosophila+spermatogonial+stem+cell+niche+reveals+novel+mechanisms+regulating+germline+stem+cell+output%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output.</a> Development. 138, 3367-3376 (2011).</li>
<li>Belloni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+Cog7+affect+Golgi+structure%2C+meiotic+cytokinesis+and+sperm+development+during+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis.</a> J. Cell Sci. 125, 5441-5452 (2012).</li>
<li>Moon, S., Cho, B., Min, S. H., Lee, D., Chung, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+THO+complex+is+required+for+nucleolar+integrity+in+Drosophila+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The THO complex is required for nucleolar integrity in Drosophila spermatocytes.</a> Development. 138, 3835-3845 (2011).</li>
<li>Wang, Z., Mann, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+two+nearly+identical+TGIF-related+homeobox+genes+in+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Requirement for two nearly identical TGIF-related homeobox genes in Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 130, 2853-2865 (2003).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

למרות שהאשכים של זבובים פראי מסוג ניתן לזהות בקלות בשל צבעם הצהוב (בניגוד לרקמות שכנות הלבנות), האשכים של זבובים שעברו מוטציה לבנים הם לבנים ולכן לעתים ניתן להתבלבל עם הבטן. זנים מהונדסים ביותר, אשר בדרך כלל ברקע לבן, יש גם אשכים לבנים בגלל גן המיני לבן שנמצא בP-אלמנטים אינו מקדם הצטברות הפיגמנט באשכים. כאשר לא ניתן להבחין אשכים דרוזופילה לפי צבע, תכונות קלות לזיהוי אחרים כוללות דפוס שלהם הספירלה והתרחשות בזוגות 12. שים לב שח...

האשכים דרוזופילה הם מערכת מודל אידיאלית לחקר תהליכים ביולוגיים רבים, כולל רגולציה של תאי גזע, מיוזה, ופיתוח זרע 13-18. Spermatocytes וצירי meiotic שלהם הם גדולים, ולכן נוחים לניתוח ציטולוגית, ומחסומי מחזור התא רגועים במהלך spermatogenesis להקל על המחקר של מוטציות בגנים מחזור התא. ניתן להבחין בסוגים שונים של תאים בהתקדמות הורה לאורכו של האשכים, ושיבוש כלשהו בתאי זרע יכול להוביל לשינויים בהסדר הכולל הזה. תכונות אלה בשילוב עם כלים גנטיים דרוזופילה הקלו ניתוח מוטאציות של תאי הזרע 21-23. השלבים של spermatogenesis דרוזופילה כבר מוגדרים היטב. תאים בתאי מין שמתפתחים באופן סינכרוני בתוך ציסטות התקדמות רציפות בשלבים של תאי זרע לאורכו של האשך. במהלך בוה המיטוטי וחטיבות meiotic של תאי נבט הזכר, cytokinesis מתרחש באופן חלקי כך שתאי הבת להישאר מחוברים על ידי גשרי cytoplasmic המכונים תעלות טבעת (איור 1). קצה הקודקוד של האשך מכיל אוכלוסייה של תאי גזע בתאי מין שמעוררת תאי spermatogonial, אשר עוברים ארבע חטיבות המיטוטי עם cytokinesis שלם כדי לייצר ציסטות 16 תאים של spermatocytes העיקרי. לאחר שלב S premeiotic, spermatocytes העיקרי להיכנס G2, תקופת צמיחה ממושכת של ~ 90 שעות שבמהלכו עליות נפח סלולארי ~ פי 25. התקדמות דרכי מיוזה ומיוזה השנייה תוצאות בהיווצרות ציסטות 32 תא של spermatocytes המשני וציסטות 64 תא של spermatids הפלואידים, בהתאמה. Spermatids לא בשלה, העגול עובר שיפוץ נרחב סלולארי כדי ליצור זרע בוגרים. תאים שלאחר meiotic, בפרט הצרורות של מתארך וspermatids הבוגר, תופסים הרבה הנפח של האשך. Tהוא הובלה מוצלחת של זרע פונקציונלי לזבובים נשיים דורשת תיאום בין החלקים השונים של מערכת הרבייה הגברית, שמורכבת מכמה מבני זיווג (האשכים, שלפוחית ​​זרע ובלוטות עזר) ותעלת שופכה אחד (איור 2). זרע מיוצר בתוך האשכים ומאוחסן בתוך שלפוחית ​​הזרע עד הזדווגות 24. בלוטות האבזר מכילות תאי הפרשה המייצרים את נוזל זרע. הזרע נודד משלפוחית ​​הזרע מעורבב עם נוזל זרע בתוך צינור השופכה, אשר מחובר לשתי שלפוחית ​​הזרע ובלוטות האבזר. תערובת זו של זרע ונוזל זרע נשאבת סופו של דבר מחוץ לזכר לתוך הנרתיק של הנקבה לעוף בנורת השפיכה ממוקמת בקצה האחורי של 25 בטן הגברית. חלבונים בתוך נוזל הזרע הם חיוניים לאחסון ממושך של זרע בתוך איברים מתמחים המכונים spermathecae בנציגמערכת roductive של נקבות דרוזופילה 26. שיטות מצוינות לבידודה של אשכים דרוזופילה ויזואליזציה של תאים בשלבים שונים של תאי זרע זמינות בספרות המדעית 3-12. אנחנו בזאת להוסיף לגוף זה של ידע על ידי הצגת דוגמאות של פרוטוקולים אלה עם הפגנת וידאו נלווית. הפרוטוקול להכנת דגימות אשכים חיים למיקרוסקופ שלב בניגוד מבוסס על שיטה שתוארה לעיל 27. הפרוטוקול לקיבעון פורמלדהיד וimmunostaining של אשכים מבוססים גם על שיטה שתוארה לעיל 28. הגישות המתוארות כאן נעשו שימוש במחקרים רבים של תאי זרע דרוזופילה (לדוגמא, על מנת להעריך את התפקידים של dynein, מנוע microtubule מינוס מכוון סופו של דבר בתאי זרע דרוזופילה). בנוסף לפרוטוקולים הבסיסיים, הצעות ניתנות לvaryinגרם לנתיחה על מנת להעשיר לspermatogonia, spermatocytes, או זרע בוגרים. שיטות שונות לעיבוד האשכים כך שציסטות או יישארו ללא שינוי או הם שיבשו במידת הצורך מתוארים. יתרון בשימוש באשכי דרוזופילה כמערכת מודל הוא כי בהשוואה לביציות דרוזופילה ועוברים, נוגדנים וצבעים יכולים בקלות לחדור לתאים הבאים פיזורם מהאשכים, ושלבי כביסה פחות נדרשים, ולכן ניתן לבצע פרוטוקולים באופן יחסי זמן קצר.

<table><tbody><tr><td>Sylgard</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>אלסטומר סיליקון דו-חלקי להכנת צלחת דיסקציה מצופה סיליקון מצלחת פטרי קימקס</td></tr><tr><td>עט PAP פישר</td><td>סיינטיפיק</td><td>NC9888126</td><td>טד פלה #22309</td></tr><tr><td>מגן ציפורניים שקוף</td><td>Wet n Wild</td><td>7780235001</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Reagent עם DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד גמא-טובולין לעכבר (שיבוט GTU-88)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6557</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-AffiniPure עז אנטי-עכבר IgG&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>AC61511-0040</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>16% פורמלדהיד</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>סיגמקוט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>SL2</td><td>השתמש בהתאם להוראות היצרן לסיליקון תלושי כיסוי</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-9542</td><td>0.5 מ"ג/מ"ל ב-75% אתנול; אחסן ב-20 מעלות; C</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>מוצרי מחקר אינטרנשיונל קורפ</td><td>S23020</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>מגבי משימות עדינים Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47299</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Research Products International Corp.</td><td>A30075</td> צנצנת מכתים מזכוכית קופלין <td>בדרגת ביולוגיה מולקולרית</td></tr><tr><td>, מכסה בורג</td><td>מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים</td><td>70315</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ חלביות בודדות</td><td>קורנינג</td><td>2948-75X25</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ מצופה פולי-L-ליזין Polysciences</td><td>, Inc.</td><td>22247-1</td><td>אופציונלי (להחלפת שקופיות מיקרוסקופ לא מטופלות)</td></tr> <tr><td>זכוכית כיסוי מרובע</td><td>קורנינג</td><td>2865-22</td><td></td></tr><tr><td>סכיני גילוח</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי קימקס</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S31473</td><td>קימבל #23060 10015 מלקחיים EMD</td></tr><tr><td></td><td>דומונט</td><td>52100-51S</td><td>דפוס 5 סטריאוסקופ</td></tr> <tr><td></td><td>INOX Stemi 2000-CSCarl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse 80i</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-Fluor 40X אובייקטיבי</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiophot</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-Neofluar Ph2 40X אובייקטיבי</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח ציטולוגית של תאי זרע: הכנות בשידור חי והקבועות של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אשכים

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

תסיסנית היא מערכת מודל רבת עוצמה שכבר בשימוש נרחב על מנת להבהיר מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים. לדוגמא, מחקרים של שתי נשים וקווים נבט זכר של דרוזופילה תרמו רב להבנה הנוכחית של מיוזה כמו גם ביולוגיה של תאי גזע. פרוטוקולים מצוינים זמינים בספרות לבידוד וההדמיה של השחלות ואשכים דרוזופילה 3-12. בזאת, שיטות לנתיחה והכנת האשכים דרוזופילה ניתוח מיקרוסקופי מתוארות בהפגנת וידאו נלווית. פרוטוקול לבידוד אשכים מהבטן של זכרים בוגרים והכנת שקופיות של רקמת חיה לניתוח על ידי מיקרוסקופ שלב בניגוד, כמו גם פרוטוקול לתיקון וimmunostaining אשכים לניתוח על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי מוצגים. ניתן ליישם את הטכניקות הללו באפיון של מוטציות דרוזופילה כי תערוכת דefects בתאי זרע, כמו גם בהדמיה של מגויר subcellular של חלבונים.

דוגמא של זוג גזור כהלכה של איברי הרבייה של גבר דרוזופילה מוצגת באיור 2 א. אשכים הוסרו מהבטן של זבוב זכר הבוגר מצורפים בדרך כלל לצינור השופכה (חום, איור 2 א &#39;) וזוג בלוטות אבזר (הירוק, איור 2 א&#39;) באמצעות זוג שלפוחית ​​זרע (הכחול, איור 2 א &#39;) . כדי להפריד את האשכים מרוב הרקמות הנלוות סומטיים, צינור השופכה ואת בלוטות האבזר צריך להיות מנותק וזנוח כזה שרק זוג האשכים ושלפוחיות הזרע יישארו (2...

שיטות לבידוד והכנת דגימות דרוזופילה אשכים (לחיות וקבוע) להדמיה על ידי שלב בניגוד ומיקרוסקופ פלואורסצנטי מתוארים במסמך זה.

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

המטרה הכללית של נוהל זה היא לנצול ולהכין אשכים של זבובים לצורך מיקרוסקופיה. זאת על ידי הפקה ראשונית של זוגות אשכים מבטנו של זבובים זכרים. השלב השני הוא לקרוע את האשכים בשלב ההתפתחות המתאים ולמעוך אותם כדי לשחרר את התאים שבתוכם.בשלב הבא, נבצע קיבוע של האשכים המעוכים ולאחר מכן נדגיר אותם בנוגדנים ראשוניים ושניוניים. השלב הסופי הוא קיבוע של הרקמה על עלית זכוכית לצורך דימוי. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה או באימונופלואורסצנציה כדי לבחון תאים בשלבים שונים של הספירמטוגנזה לאיתור פגמים ומורפולוגיה, וכדי לבחון לוקליזציות תת-תאיות של חלבונים שונים.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה ההתפתחותית, כגון זיהוי תפקידים קריטיים של חלבונים במהלך התקדמות הספירמטוגנזה. הדגמה חזותית של נתיחה של אשכים ב-RAs היא קריטית, כיוון שמי שאינו מנוסה בפרוצדורה זו עלול להיתקל בתחילה בקושי באיתור האשכים בתוך בטן הזבוב. בנוסף, קל יותר להדגים מאשר לתאר במילים את הדרך המצליחה ביותר לביצוע ריסוק (squashing) של הרקמה.כדי להתחיל בדיסקציה, הרדימו את הזבובים בתוך בקבוק או מבחנה באמצעות זרם של carbon dioxide. לאחר מכן, העבירו את הזבובים המורדמים למשטח עבודה לזבובים (fly pad). מיינו את הזבובים תחת מיקרוסקופ דיסקציה באמצעות מכחול קטן כדי לאסוף כשישה עד שמונה זכרים מסוג oph מהגנוטיפ הרצוי.בשלב הבא, הסר את הכנפיים מכל זבוב באמצעות פינצטה. פעולה זו תמנע מהזבובים לצוף בנוזל. במהלך הדיסקציה, הוסף 500 µL של phosphate buffered saline או PBS בטיפה אחת על גבי צלחת דיסקציה מצופה סיליקון עם רקע שחור.לאחר מכן, כוון את הפינצטה לעבר הקצה הקדמי של אחת הזבובים שכונפיהם הוסרו. אחז בה באזור החזה וטבול אותה בטיפת ה-PBS. זהה את המבנה החום הכהה הממוקם בקצה האחורי של הבטן הוונטרלית, והשתמש בזוג פינצטות נוסף כדי לתפוס ולמשוך את איברי המין החיצוניים לאחור עד להפרדתם מהבטן.ברוב המקרים, האשכים, שלפוחית הזרע ובלוטת העזר יוסרו מהבטן יחד עם איברי המין החיצוניים. עם זאת, אם הם לא הוסרו, הכניסו פינצטה אל תוך הבטן והוציאו בעדינות את האשכים. הפרידו את האשכים מבלוטות העזר ומאיברי המין החיצוניים באמצעות שתי פינצטות.הבדילו בין אשכים מסוג הטיפוס הפראי (wild type) לבין רקמות לבנות סמוכות על פי צבעם הצהוב. כדי להכין את הדגימה לדימוי חי, השתמשו בפינצטה כדי להניח בעדינות שני עד שלושה זוגות של אשכים בטיפה של 4 עד 5 µL של PBS על ליתור זכוכית ריבועי. לאחר מכן, קרעו.פתחו כל אשך באמצעות פינצטה במיקום גובה מתאים כדי למקסם את נוכחותם של סוגי תאי נבט הרצויים בדגימה. תכולת האשכים תצא מהאזור הקרוע אל על העגלה. במהלך שלב המעיכה להעשרת הספירמטוגוניה והספירמטוציטים, קרעו את האשכים בסמוך לקצה האפיקלי שלהם כדי להגביר את הריכוז.עבור ספרמטוציטים וספרמטידות, קרעו את האשכים במיקום הנמצא מעט בסיסלית לרמה אחת כדי להעשיר את הדגימה בתאי נבט בוגרים יותר. קרעו את האשכים בקרבה למקום בו מתחיל הקימור. השלב הבא הוא ריסוק האשכים על ידי הנחת זכוכית כיסוי בעדינות מעל סמיכה של מיקרוסקופ.אין להפעיל לחץ ידנית ויש להימנע מכליאת בועות אוויר. יש להשתמש בדגימה תוך 15 דקות מההכנה כדי לצפות בתאים חיים. באמצעות מיקרוסקופ ניגודי פאזה (phase contrast), יש לספוג בעדינות כל עודף נוזל מתחת לזכוכית המכסה באמצעות מגב ניקוי, כדי לאפשר את השטחת הדגימה עד שהתאי הנבטים יהיו במיקוד ברור.בצעו הקפאה מהירה (Snap freeze) לשקופיות המוכנות המכילות אשכים בשיטת ריסוק (squash), על ידי טבילתן באמצעות מלקחי מתכת בחנקן נוזלי עד להפסקת הבעבוע של הנוזל. הסירו מיד את זכוכית הכיסוי באמצעות להב תער. לאחר מכן, העבירו את השקופיות באמצעות מלקחי מתכת למעמד שקופיות מזכוכית שקודר קירור ומולא ב-95% ethanol קר מאוד, ואחסנו את הדגימה בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.העבירו את השקופיות שעברו שיווי משקל למעמד שקופיות זכוכית המלא ב-4% formaldehyde ב-PBS בתוספת 0.1% Triton X 100 או PBST, ואחסנו בטמפרטורת החדר למשך שבע דקות. לאחר מכן, העבירו את השקופיות למעמד מלא ב-PBS. שטפו את השקופיות ב-PBS למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר על ידי ריקון התמיסה מהמעמד והחלפתה בתמיסת PBS רעננה.חזרו על השטיפה פעם אחת. השליכו את ה-PBS והטבילו את השקופיות ב-PBST למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי להגמיש את ממברנות התאים. לאחר מכן, שטפו את השקופיות שלוש פעמים ב-PBS למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. שרטטו עיגול סביב הרקמה המעוכה על השקופית באמצעות עט מחסום הידרופובי, כדי להגביל את תמיסות הנוגדנים ולשמור על לחות הרקמה בכל עת במהלך ביצוע הצביעה האימונית.לאחר מכן, הוסיפו 30 עד 40 µL של נוגדן ראשוני המדולל ב-PBST לרקמה בתוך המעגל. הדגרימו את השקופית בתא לח ומחשיך למשך שעתיים בטמפרטורת החדר, או למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C לאחר הדגירה עם הנוגדן הראשוני. שטפו את השקופיות שלוש פעמים ב-PBS למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, הוסיפו לרקמה 30 עד 40 µL של נוגדן שני משלים המצומד לפלואורופור ומדולל ב-PBS, והדגירו בחושך למשך שעה אחת עד שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את הפלטים שלוש פעמים ב-PBS למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לבסוף, הוסיפו 30 עד 40 µL של תמיסת DAPI לרקמה בתוך המעגל.הניחו בעדינות זכוכית כיסוי מעל הרקמה, תוך הקפדה יתרה על מניעת כליאת בועות אוויר. אם מופיעות בועות אוויר, הזיזו בזהירות את זכוכית הכיסוי מבלי להרוס את הדגימה, עד שהבועות יצאו מצדי הכיסוי. ספגו את העודפים משולי השקופית באמצעות מטפית ניקיון.לאחר מכן, אטמו את זכוכית הכיסוי באמצעות לק ציפורניים ובחנו את התאים הצבועיים אימונו-היסטוכימית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה תוך שלוש עד ארבע שעות. איור זה מציג את מיקומם של שלבי הבשלה שונים של תאים בתוך אשכי Drosophila. שלב 1 מכיל תאים צעירים הנמצאים בשלבים מוקדמים של ספרמטוגנזה, ושלב 3 מכיל תאי זרע בשלים יותר.רמה שתיים מכילה אוכלוסייה מעורבת של תאי רכבת נבטות מיאוטיים ופוסט-מיאוטיים. תמונת ניגודיות פאזה תואמת מראה את שחרורם של ספרמטוגוניה ותאי ספרמטוציטים ראשוניים בשלב מוקדם ומאוחר כאשר האשכים נקרעים ברמה אחת. החץ הצהוב מצביע גם על התמזגות של שני תאים או יותר המקושרים ביניהם כתוצאה מציטוקינזה לא מלאה.תוצר לוואי של פרוצדורת המעיכה המוצגת כאן הוא תמונת ניגודיות פאזה תואמת המראה שחרור של ספרמטוציטים ראשוניים מאוחרים ותאים פוסט-מיוטיים, כולל ספרמטידות עגולות, ספרמטידות מתארכות וזרע בוגר כאשר האשכים נקרעו ברמה שתיים. ניתן להשתמש בדימות בניגודיות פאזה של אשכים מעוכים כדי לזהות בקלות פגמים בספרמטידות העגולות השכיחות. ספרמטידות מסוג בר (wild type) בעלות גרעין בהיר בפאזה מוצגות כאן כשהן מחוברות לצבר מיטוכונדריאלי בודד כהה בפאזה בגודל שווה בקירוב.בניגוד לכך, ספרמטידים מאשכי Aun מכילים גרעינים קטנים מרובים ואגרגט מיטוכונדריאלי אחד גדול, כתוצאה מכישלון בציטוקינזה ושגיאות בהפרדת כרומוזומים. תמונות גווניי האפור המוצגות כאן הן מהכנה של אשכים בשיטת מעיכה (squash), שנצבעו בריאגנטים המזהים בצבע את המיקרוטובוליים, ה-DNA והצנטרוסומים. התמונות המשולבות מראות ספרמטוציט במצב חלוקה, שדה רחב של ספרמטידים עגולים ואגודה של זרעים בשלים. לאחר רכישת מיומנות בהכנת דגימות למיקרוסקופיה בניגודי פאזה, ניתן לבצע את התהליך בתוך 20 עד 30 דקות.ניתן להכין דגימות עבור מיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה תוך שש שעות אם הפעולה מבוצעת כראוי. בנוסף לעיבוד אשכים של oph לצורך מיקרוסקופיה, ניתן להשתמש באשכים מבודדים כחלופה לצורך ניתוח ביוכימי של חלבונים.

cytological-analysis-spermatogenesis-live-fixed-preparations

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הדמיה של חלבוני centrosomal במהלך spermatogenesis דרוזופילה היא שיטה רבת עוצמה לזיהוי חלבונים חדשים חיוניים לביולוגית centrosome, כמו גם על מנת להבהיר את הפונקציה המסוימת של שחקנים ידועים בתהליך זה.

Centrosomes הדמיה באשכים טוס

צביעה חיסונית היא טכניקה יעילה להמחשת סוגי תאים וחלבונים ספציפיים בתוך רקמות. על ידי שימוש בסוניקציה, הפרוטוקול המתואר כאן מקל על הצורך לנתח רקמות Drosophila melanogaster מעוברים וזחלים בשלב מאוחר לפני צביעה חיסונית. אנו מספקים מתודולוגיה יעילה לצביעה חיסונית של זחלי הר שלמים קבועים בפורמלדהיד.

הקל Sonication Immunofluorescence הכתמה של שלב מאוחר עוברי וזחל<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רקמות<em&gt; באתר</em

פרוטוקול זה מתאר את הנתיחה והטיפוח של אשכים שלמים וציסטות בקו הנבט מגלמים של Drosophila melanogaster. שיטה זו מאפשרת תצפית מיקרוסקופית על זרע הזרע ex vivo. יתר על כן, אנו מתארים בדיקה פרמקולוגית של השפעת המעכבים על שלבים ספציפיים של התפתחות תאי נבט באשכים גולמים.

אקס תרבות Vivo של דרוזופילה גלמי אשך וציסטות נבט אונליין רווק בן: Dissection, הדמיה, ותרופתי טיפול

אנו מציגים פרוטוקולים לאיסוף, הכנה והדמיה של ביציות דרוזופילה בוגרות. שיטות אלו מאפשרות הדמיה של התנהגות הכרומוזומים והרכבת הציר ותפקודו במהלך מיוזה.

טכניקות הדמיה prometaphase ו Metaphase של המיוזה ואני קבוע<em&gt; תסיסנית</em&gt; ביציות

מטרת טכניקה זו סקווש צנורית הוא להעריך במהירות תכונות cytological של פיתוח העכבר spermatocytes תוך שמירה על תקינות הסלולר. שיטה זו מאפשרת הלימוד בכל שלבי יצירת זרע, ניתן ליישם בקלות לצד הביוכימי והמולקולרי ביולוגי גישות אחרות לצורך המחקר של העכבר מיוזה.

טכניקה סקווש צנורית וכמה לניתוח Cytological של יצירת זרע שימוש במודל עכבר

המטרה של פרוטוקול זה היא לנתח את חלוקת התא ברקמה שלמה על ידי מיקרוסקופ התאים החיים והקבוע באמצעות דרוסוילה מיוטיק מאיוציטים. הפרוטוקול מדגים כיצד לבודד את כל האשכים שלמים, מזחלים מדרוזופילה ומהגלמים המוקדמים, וכיצד לעבד ולטעון אותם למיקרוסקופיה.

הכנת מדרוזופילה זחל ופופל אשכים לניתוח חטיבת תאים בשידור חי, רקמה שלמה

אנו מציגים כאן פרוטוקול משופר להכנה וחיסון של כל ההר של אשכי דרוזופילה, מתאים למיקרוסקופיה קונפוקלית וגם מאפשר תיוג ניתן לשחזור ואמין. אנו ממחישים פרוטוקול זה על ידי ייצוג תלת מימדי וכימות של ניסויי קולוקליזציה על זרעונים S4-S5 גדולים.

חיסון של אשכי דרוזופילה הר שלם לניתוח קונפוקלי תלת מימדי של זרעונים גדולים

מוצג כאן פרוטוקול microinject ובו זמנית תמונה עוברי Drosophila מרובים במהלך התפתחות עוברית באמצעות צלחת מבוססת, דימוי תוכן גבוה.

הכנת עובר Drosophila ומיקרו-היתוך למיקרוסקופיה של תאים חיים שבוצעו באמצעות מנתח תוכן גבוה אוטומטי

כאן אנו מציגים שיטה פשוטה ויעילה לבודד תאי חיידקים מיוטיים ופוסט-מיוטיים חיים מערכי עכבר בוגרים. באמצעות ציטוקסיות נמוכה, צבע מחייב DNA סגול-נרגש ומיון תאים המופעלים על-ידי פלואורסצנה, ניתן לבודד אוכלוסיות תאי זרע מועשרים מאוד עבור יישומים רבים במורד הזרם.

בידוד של תאי זרע מורין באמצעות צבע מחייב DNA סגול-נרגש תא חרוש

כאן, אנו מספקים פרוטוקול דיסקציה הנדרש כדי לצלם בשידור חי את הגונד הזכר העוברי המנוח של דרוזופילה . פרוטוקול זה יאפשר תצפית על תהליכים תאיים דינמיים בתנאים רגילים או לאחר מניפולציה מהונדסת או פרמקולוגית.

דיסקציה והדמיה חיה של דרוזופילה גונד העוברית המאוחרת

מאמר זה מדווח על עיכוב in vivo של CENP-E באמצעות ניתוח בטן והזרקת GSK923295 באשכים, מודל רב ערך לחלוקה מיוטית גברית. באמצעות בדיקות אימונופלואורסצנטיות, ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת, אנו מראים כי עיכוב CENP-E גורם לחוסר תיאום כרומוזומים וחוסר יציבות גנומית בזרעונים של עכברים.

הערכה תפקודית של קינזין-7 CENP-E בזרעונים באמצעות עיכוב Vivo , אימונופלואורסנציה וציטומטריית זרימה

למדו הכנת אשכי זבובי פירות לצפייה מיקרוסקופית באמצעות ניתוח, ריסוק, קיבוע וצביעה נוגדנים. שיטה זו מאפשרת מחקר שלבים שונים בסpermatogenesis וזיהוי ליקויים בפיתוח תאי זרע בדרוזופילה.

ניתוח ציטולוגית של תאי זרע: הכנות בשידור חי והקבועות של

גלה סרטונים נוספים