Name: אבלציה של תא בודד משמונה תאי עוברים של סרטנאים Amphipod Parhyale hawaiensis (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-16T23:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: למדו אבלציה של תא בודד בעוברי שמונה תאים של הסרטן Parhyale hawaiensis. שיטה זו מאפשרת חקירת תאי קדם גרמליין ומנגנוני התפתחות בארתרופודים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לריחאן עריף וHassaan Shahawy לעבודת מצלמה, טריפטיכון גופטה ופרדריקה Alwes לסיוע שיפור טכניקת אבלציה התא, וחברי המעבדה Extavour למשוב על נתונים, וידאו וכתב היד. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי תאי גזע מכון הרווארד (מספר גרנט זרע SG-0057-10-00) קרן אליסון הרפואית (ניו Scholar פרס מספר AG-NS-07,010-10) לCGE, והפרסים הרווארד תכנית המחקר במכללה ל ARN.

תגובות שעשויות להיות מועילים בביצוע צעדים מסוימים מסומנות בכתב נטוי. 1. יום 1: הכנה של חומרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את החומרים הבאים (ראה טבלה של חומרים וציוד): <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 15 סנטימטר ו22 טפטפות פסטר סנטימטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סופר יהלומים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מי ים מלאכותי מסונן (מליחות בין 0.0018-.0020) המכילה 1 מ&quot;ג / מיליליטר Amphotericin B (1:100 של פתרון מניות 100 מ&quot;ג / מיליליטר), 100 יחידות / מיליליטר פניצילין ו100 מ&quot;ג / מיליליטר סטרפטומיצין (01:50 של פתרון מניות המכיל 5,000 / מיליליטר יחידות פניצילין ו -5,000 מ&quot;ג / מיליליטר סטרפטומיצין) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מים מסוננים מלאכותיים ים (מליחות בין 0.0018-0.0020) ללא תוספים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיכל פלסטיק גדול לזוג לדיור (לפחות 15 סנטימטר x 15 סנטימטר X 5 ס&quot;מ) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות פטרי קטנות (3 סנטימטר או 5 ס&quot;מ) מרופדות בSylgard </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות פטרי (3 סנטימטר או 5 ס&quot;מ) קטנות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> watchglass או זכוכית רב גם </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלקחיים (אנו משתמשים במלקחיים בוטים נגזרים לכאן ולכאןמלקחיים מ &#39;ישן דומון # 5 שנפגעו בטעות בנהלי מעבדה אחרות, שיש לנו לשנות את ייעודו באמצעות מלקחיים חידוד אבן, כדי להבטיח שקצות המלקחיים חלקים, ששני שיניים הן באותו אורך, ושכבר אין להם נקודות חדות. מלקחיים עדינים ביותר, כגון דומון # 5 מלקחיים חדשים, אינם רצויים כיוון שהם עלולים לפגוע בעוברים ו / או נקבות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה פסטר עם הסוף התרחבה (ראה שלב 1.2 להלן) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלי אחזור עובר מורכב מחוט דק, מעוקל טונגסטן מוטבע לתוך הסוף הדק של פיפטה פסטר (יכולים להיות מוחלפים על ידי חלופה ליישם; לראות 1.3 להלן) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה בפה עם פתח קטן (ראה שלב 1.4 להלן) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחט זכוכית עשויה מזכוכית משך נימים (ראה שלב 1.5 להלן) </li></ul> אין חומרים רעילים לבני אדם נמצאים בשימוש בפרוטוקול זה. עם זאת, חוקרים צריכים להבטיח שהם לובשים כפפות או הלבוש מגן אחר כפי שנדרשו על ידי guidel ניהול הסיכוניםאינס של המוסד שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך את פיפטה התרחבה פסטר, ציון בסיבוב הראשון פיפטה פסטר 15 סנטימטר בנקודה שבי פיפטה תתחיל לצמצם עם סופר יהלומים, לעטוף את האזור קלע של פיפטה במגבת Kimwipe או נייר כדי להגן על האצבעות, ולאחר מכן בזהירות לשבור את הקצה בקו הציון. החזק את קצו השבור של פיפטה מעל להבת מבער בונזן במשך כמה שניות כדי להחליק את הקצוות. הפתיחה צריכה להיות מעט צרה יותר מהרוחב המרבי של טפטפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להפוך את הכלי לנתח תיל טונגסטן, הכנס תיל טונגסטן לסוף הזכוכית פיפטה פסטר 15 סנטימטר, ומחזיק לזמן קצר על אש מבער בונזן כדי להמס את הזכוכית, תיקון החוט במקום. שימוש במלקחיים בעדינות לעקומת קצה החוט לצורת מכור. ראה איור 3 לדוגמה לצורה מתאימה לכלי הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך את פתח קטן לפיפטה בפה, למשוך את הקצה הדק של פיפטה פסטר 22 סנטימטר לשני החלקים ovאה להבה, ולשבור את הקצה של הקצה הקטן. הכנס לסוף בעל פיפטה בפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את מחט הזכוכית שתשמש לנקב לסטומרים של עניין במהלך הליך אבלציה באמצעות חולץ מחט. מחט בצורה כראוי מוצגת באיור 4. מחט זו משכה על חולץ מחט p97 סאטר באמצעות תכנית עם פרמטרים 2x (חום = 566, למשוך = 100, מהירות = 20, זמן = 250) + 1X (חום = 566, למשוך = 100, מהירות = 100, זמן = 250). התכנית הספציפית והמכשיר משמש לייצור את המחט יכולים להשתנות, אבל המחט חייבת להיות נקודה עדינה, ועם זאת גם להיות יציב מספיק כדי לא לשבור כאשר דחף נגד סיסית של העובר. </li></ol> 2. יום 1: זוגות התכנסות Parhyale מזווגים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה פסטר התרחבה (שלב 1.2 לעיל) כדי לאסוף הזדווגות פ זוגות hawaiensis מיכל התרבות הגדול, ולהעביר אותם למכל המכיל ג נפרדלהישען מי ים מלאכותי. אין זה הכרחי כי מי ים זה להיות מסונן. עדיף לאסוף זוגות הזדווגות בשעתי אחר הצהריים המאוחרים ולהשאיר את הזוגות בטמפרטורת חדר (20-23 מעלות צלזיוס) בלילה, כך שלמחרת בבוקר, רוב העוברים יהיו כבר מופרים לאחרונה והופקדו, ולכן במחשוף שלבים המוקדם מתאים אבלציה. לאסוף לפחות 20 זוגות הזדווגות כדי להבטיח שכמה נקבות תהיה נשיאת עוברי שלב מוקדם על ידי מחשוף למחרת בבוקר. </li></ol> 3. יום 2: התכנסות Parhyale עוברים <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בוקר למחרת, להחדיר מי ים מלאכותי מסונן (FASW) עם CO 2. כמה מהנשים תהיה בשחייה חופשית מהזכרים שלהם במהלך הלילה; לאסוף נשים מופרדות אלה ומרדימים אותם בFASW / CO 2. הזכרים מזווגים הנותרים ניתן להסיר מיכל זוג הזדווגות וחזרו לתרבות הגדולה. זוגות הזדווגות שנותרו ניתן לשמור לאוסף עובר מאוחר יותרביום או ביום שלמחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הנקבה מורדמת אחת נושאת עובר לזכוכית שעון בFASW / CO 2. כל הנקבות מופרדות צפויות הפקידו ביצים, שיהיה גלוי על ידי העין כורודה חיוור או סגולים הספרואידים דרך צלחות coxal השקופה של הנקבות (איור 1 א). כדי לקבוע אם הם עובר בשלבי מחשוף מוקדמים ובכך מתאים לאבלציה blastomere, החוקר צריך להסיר את העוברים מהכיס להרהר ולבחון אותם תחת מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צופה בהליך תחת מיקרוסקופ לנתח, לתפוס את צלחות coxal לאורך צד אחד של הגוף עם מלקחיים. עוברים יהיו גלויים בכיס הדגירה הגחון בין צלחות coxal אלה (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכניס את הכלי הדק, מעוקל תיל (איור 3; צעד 1.3 לעיל) אל הקצה האחורי של כיס הדגירה, ועדינות להרים את החוט לקראת הסוף הקדמי של הנרתיק להרהר להפריד הגוזליםכיסויי נרתיק (אלה הותאמו נספחים הגחון נקראים oostegites 30), שפתח את הכיס והתרופפות העוברים. עוברים שנמצאים בשעה הראשונה של שהניח כולם סגורים בתוך קרום דק מאוד ושקוף שיהיה בקלות להיות מופר על ידי כלי התיל; קרום זה נעלם על ידי כ 2-3 שעות לאחר הטלת ביצים, ועוברים אינם מאוגדים לזה או לנקבה בכל דרך מנקודה זו ואילך בכל עובר. אם חוקרים מוצאים את זה לא נוח או קשה לתמרן את כלי התיל המעוקל להסיר את העוברים מכיס הדגירה, אלטרנטיבי ליישם עשוי לשמש, כל עוד התנועות עדינות ולא בלחץ קשה מוחל על העוברים או את כיס הדגירה. כלים אחרים מתאימים להסרת עוברים מכיס הדגירה כוללים מלקחיים קהות או נימי זכוכית עם קצה אטום ומוחלק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה 15 פסטר סנטימטר ללא שינוי כדי לשטוף מים דרך כיס הדגירה נפתח, דוחף החוצה tהוא עובר, שאמור ליישב לתחתית של זכוכית השעון. העבר את הנקבה כדי לנקות FASW (ללא CO 2), כדי לאפשר התאוששות לפני reintroducing לתרבות המרכזית. ניתן להציב נקבות מרובות לתוך את אותה המנה התאוששות, אלא לאפשר נקבות כדי להחלים לחלוטין לפני שמחזירים אותם לתרבות הראשית, כיוון שהם עלולים להיאכל על ידי בעלי חיים אחרים אם הם עדיין מורדמים באופן חלקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה 15 פסטר סנטימטר ללא שינוי להעביר את העוברים לצלחת פטרי עם FASW הנקי, ולהציג תחת מיקרוסקופ כדי לקבוע בשלב העוברי שלהם. עוברים נפרדים שנמצאים במחשוף השלישי (שלב 4 5), אשר מתאים להליך זה. זה צריך להיות אפשרי גם להחלת פרוטוקול זה לכל שלב מחשוף לפני היווצרות דיסק נבט (שלבי 7-8 מאי). </li></ul> 4. תאים בודדים ablating: יום 2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא צלחת פטרי מרופדת Sylgard בשכבה רדודה של FASW. השתמש pi פסטר 15 סנטימטר ללא שינויpette להעביר עובר אחת לצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים בוטים, בעדינות מגלגל את העובר כדי לזהות את התא להיות ablated (2A דמויות ו2B). גרם מבשר שורת הנבט יכול להיות מזוהה כmicromere הקטן ביותר, היושב על גבי Mav macromere הקטן ביותר. בנוסף, גרם לא ישירות לפנות לתא צמוד, המהווה את micromere ישירות מולו, כמיליליטר micromeres מבשר המזודרם ונתח mr גבול תא באמצע של העובר. Mr הוא blastomere מימין גרם, ו מיליליטר הוא micromere משמאל גרם. Macromeres אחותו של מר, מיליליטר, וחדר הם מבשרי האאקטודרם אה, אל, ופרקים בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מלקחיים בLEFיד לא אם החוקר הוא ימני (או ביד ימין אם החוקר הוא שמאלי), לכוון את העובר עם התא של עניין לימין (או לשמאל אם החוקר הוא שמאלי), ו בעדינות לתפוס את העובר בין המלקחיים כדי לייצב אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט משכה זכוכית (שלב 1.5 לעיל; איור 4), בעדינות לנקב את התא של עניין. אל תכניס את המחט עמוקה מדי, כדי שלא לדחוף את המחט לתוך תאי שכנים או מתחת לתא של עניין. המחט רק צריכה לנקב את סיסי וקרום תא בסיסי, ואין צורך להאריך עמוק לתוך התא להיות ablated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליף את המחט נהגה לנקב את העובר לסוף כוס פיפטה בפה עם קנס הוציאה קצה פיפטה פסטר (שלב 1.4 לעיל). החזק את קצה פיפטה כדי לסגור את החור נוצר בתא של עניין, ולהחיל שאיבה עדינה מאוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאוד ללחוץ בעדינות את העובר עם המלקחיים. כמו התוכן של blastoסתם נדחף אל מחוץ לסיסי דרך החור שנוצר בשלב 4.4, למצוץ אותו לתוך פיפטה הפה כדי לאפשר מבט פתוח של העובר. אם החור גדול מספיק, גרעין התא ניקב ניתן לראות לצוץ גם כן. זו בדיקה טובה כדי לוודא את תוכן התא כולו הוסר, ולא יכול להיות מחדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנא קראו בעיון את העובר כblastomere של עניין מוסר. הגבול של התא ניקב יהיה לסגת לעבר החור בסיסי, מה שהופך את צמתים של תאי הבסיס נראים לעין. המשך להפעיל לחץ עד שכל blastomere עניין הוסר. שימוש במלקחיים לגלגל את העובר מצד לצד וחזותי לאשר כי כל blastomere של עניין הוא נעלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פיפטה פסטר 15 סנטימטר ללא שינוי, להעביר את העובר כדי לנקות FASW + (מ&quot;ג FASW + 1 / מיליליטר Amphotericin B, 100 יחידות / מיליליטר פניצילין ו100 מ&quot;ג / מיליליטר סטרפטומיצין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם עוברים-ablated blastomere בבארות בודדותצלחת 48 היטב נקייה בFASW +, שינוי 50% מFASW-בתוספת האנטיביוטיקה + יומית. בידיים שלנו עוברים לשרוד ולהתפתח היטב, אבלציה אף שלאחר מכן, בטווח של טמפרטורות 18-28 º C. חוקרים צריכים להעלות העוברים שלהם בטמפרטורה אשר יש להם משטח נקי (אך לא בהכרח סטרילי) שעליו להעלות את העוברים עם הפרעה מינימאלית. כדי להיות מסוגל להשוות את העיתוי של אירועים התפתחותיים בעוברים-ablated blastomere עם פקדים, אנחנו מפנים את הקורא למידע היערכות התפתחותית מפורט שזמין עבור עוברים הועלו ב18 º 4 C, C º 25 4, ו26 º C 5,6. </li></ol>

<ol><li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+3%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Model+Organisms%3A+A+Laboratory+Manual+Volume%22%5BJournal%5D)">Chapter 3.</a> Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual Volume. , CSHL Press. 373-404 Forthcoming.</li>
<li>Sander, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+insect+embryogenesis%3A+the+evolution+of+concepts+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.Insect+Morphol.+Embryol%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in insect embryogenesis: the evolution of concepts and mechanisms.</a> Int. J.Insect Morphol. Embryol. 25, 349-367 (1997).</li>
<li>Regier, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arthropod+relationships+revealed+by+phylogenomic+analysis+of+nuclear+protein-coding+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Arthropod relationships revealed by phylogenomic analysis of nuclear protein-coding sequences.</a> Nature. 463, 1079-1083 (2010).</li>
<li>Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fate+of+isolated+blastomeres+with+respect+to+germ+cell+formation+in+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The fate of isolated blastomeres with respect to germ cell formation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 277, 387-402 (2005).</li>
<li>Browne, W. E., Price, A. L., Gerberding, M., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+in+the+amphipod+crustacean%2C+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis.</a> Genesis. 42, 124-149 (2005).</li>
<li>Gerberding, M., Browne, W. E., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+analysis+of+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis+reveals+an+early+restriction+of+cell+fates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cell lineage analysis of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis reveals an early restriction of cell fates.</a> Development. 129, 5789-5801 (2002).</li>
<li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+and+dissection+of+Parhyale+hawaiensis+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fixation and dissection of Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li>
<li>Price, A. L., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+divergent+mechanisms+of+mesoderm+development+in+arthropods%3A+the+expression+of+Ph-twist+and+Ph-mef2+in+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+B.+Dev.+Evol%22%5BJournal%5D)">Investigating divergent mechanisms of mesoderm development in arthropods: the expression of Ph-twist and Ph-mef2 in Parhyale hawaiensis.</a> J. Exp. B. Dev. Evol. 310, 24-40 (2008).</li>
<li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+of+labeled+RNA+probes+to+fixed+Parhyale+hawaiensis+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protoc%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization of labeled RNA probes to fixed Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li>
<li>Browne, W. W., Schmid, B. G. M., Wimmer, E. A., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+otd+orthologs+in+the+amphipod+crustacean%2C+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Expression of otd orthologs in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Genes Evol. 216, 581-595 (2006).</li>
<li>Prpic, N. M., Telford, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+homothorax+and+extradenticle+mRNA+in+the+legs+of+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis%3A+evidence+for+a+reversal+of+gene+expression+regulation+in+the+pancrustacean+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Expression of homothorax and extradenticle mRNA in the legs of the crustacean Parhyale hawaiensis: evidence for a reversal of gene expression regulation in the pancrustacean lineage.</a> Dev. Genes Evol. 218, 333-339 (2008).</li>
<li>Kizil, G., Havemann, J., Gerberding, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+cells+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis+depend+on+Vasa+protein+for+their+maintenance+but+not+for+their+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ cells in the crustacean Parhyale hawaiensis depend on Vasa protein for their maintenance but not for their formation.</a> Dev. Biol. 327, 320-239 (2009).</li>
<li>Liubicich, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+Parhyale+Ultrabithorax+recapitulates+evolutionary+changes+in+crustacean+appendage+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Knockdown of Parhyale Ultrabithorax recapitulates evolutionary changes in crustacean appendage morphology.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13892-13896 (2009).</li>
<li>Pavlopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+evolution+of+appendage+specialization+by+Hox+gene+misexpression+in+an+emerging+model+crustacean%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Probing the evolution of appendage specialization by Hox gene misexpression in an emerging model crustacean.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13897-13902 (2009).</li>
<li>Vargas-Vila, M. A., Hannibal, R. L., Parchem, R. J., Liu, P. Z., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+prominent+requirement+for+single-minded+and+the+ventral+midline+in+patterning+the+dorsoventral+axis+of+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A prominent requirement for single-minded and the ventral midline in patterning the dorsoventral axis of the crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Development. 137, 3469-3476 (2010).</li>
<li>Simanton, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+arthropod+midline+netrin+accumulation+revealed+with+a+cross-reactive+antibody+provides+evidence+for+midline+cell+homology%5BTitle%5D)+AND+%22Evol.+Dev%22%5BJournal%5D)">Conservation of arthropod midline netrin accumulation revealed with a cross-reactive antibody provides evidence for midline cell homology.</a> Evol. Dev. 11, 260-268 (2009).</li>
<li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+staining+of+Parhyale+hawaiensis+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protoc%22%5BJournal%5D)">Antibody staining of Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li>
<li>Pavlopoulos, A., Averof, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+genetic+transformation+for+comparative+developmental+studies+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Establishing genetic transformation for comparative developmental studies in the crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7888-7893 (2005).</li>
<li>Kontarakis, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+strategy+for+gene+trapping+and+trap+conversion+in+emerging+model+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A versatile strategy for gene trapping and trap conversion in emerging model organisms.</a> Development. 138, 2625-2630 (2011).</li>
<li>Zeng, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+assembly+and+characterization+of+a+maternal+and+developmental+transcriptome+for+the+emerging+model+crustacean+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genom%22%5BJournal%5D)">De novo assembly and characterization of a maternal and developmental transcriptome for the emerging model crustacean Parhyale hawaiensis.</a> BMC Genom. 12, 581 (2011).</li>
<li>Zeng, V., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ASGARD%3A+an+open-access+database+of+annotated+transcriptomes+for+emerging+model+arthropod+species%5BTitle%5D)+AND+%22Database%22%5BJournal%5D)">ASGARD: an open-access database of annotated transcriptomes for emerging model arthropod species.</a> Database. , (2012).</li>
<li>Nestorov, P., Battke, F., Levesque, M. P., Gerberding, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Maternal+Transcriptome+of+the+Crustacean+Parhyale+hawaiensis+Is+Inherited+Asymmetrically+to+Invariant+Cell+Lineages+of+the+Ectoderm+and+Mesoderm%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The Maternal Transcriptome of the Crustacean Parhyale hawaiensis Is Inherited Asymmetrically to Invariant Cell Lineages of the Ectoderm and Mesoderm.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li>
<li>Alwes, F., Hinchen, B., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+cell+lineage%2C+movement%2C+and+migration+from+germ+layer+specification+to+gastrulation+in+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Patterns of cell lineage, movement, and migration from germ layer specification to gastrulation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 139, 110-123 (2011).</li>
<li>Ewen-Campen, B., Schwager, E. E., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+machinery+of+germ+line+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">The molecular machinery of germ line specification.</a> Mol. Reprod. Dev. 77, 3-18 (2010).</li>
<li>Price, A. L., Modrell, M. S., Hannibal, R. L., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoderm+and+ectoderm+lineages+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis+display+intra-germ+layer+compensation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mesoderm and ectoderm lineages in the crustacean Parhyale hawaiensis display intra-germ layer compensation.</a> Dev. Biol. 341, 256-266 (2010).</li>
<li>Fraser, S. E., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+metamorphosis+of+experimental+embryology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The molecular metamorphosis of experimental embryology.</a> Cell. 100, 41-55 (2000).</li>
<li>Olsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clash+of+traditions%3A+the+history+of+comparative+and+experimental+embryology+in+Sweden+as+exemplified+by+the+research+of+G%C3%B6sta+J%C3%A4gersten+and+Sven+H%C3%B6rstadius%5BTitle%5D)+AND+%22Theory+Biosci%22%5BJournal%5D)">A clash of traditions: the history of comparative and experimental embryology in Sweden as exemplified by the research of Gösta Jägersten and Sven Hörstadius.</a> Theory Biosci. 126, 117-129 (2007).</li>
<li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+Parhyale+hawaiensis+blastomeres+with+fluorescently+labeled+tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protoc%22%5BJournal%5D)">Injection of Parhyale hawaiensis blastomeres with fluorescently labeled tracers.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li>
<li>Chaw, R., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+migration+of+cell+populations+in+the+early+gastrulation+of+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Independent migration of cell populations in the early gastrulation of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 371, 94-109 (2012).</li>
<li>Schmitz, E. H. Crustacea Microscopic Anatomy of Invertebrates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchmitz%2C+EH+%22Microscopic+Anatomy+of+Invertebrates%22">Microscopic Anatomy of Invertebrates</a>. Harrison, F. W. 9, Wiley-Liss, Inc.. 443-528 (1992).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

אנו מתארים פרוטוקול לאבלציה ידנית וההסרה פיזית מלאה של לסטומרים אחד מהשלבים המוקדמים של מחשוף פ amphipod hawaiensis. אנו מדגימים שימוש בפרוטוקול זה על ידי הסרת תאים גרם מבשר שורת החיידק הבודד מעובר בשלב שמונה תאים, ומראים כי אבלציה הייתה מוצלחת אם תאשר היעדרות של תאי בת של g בעובר מאוחר יותר. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להסיר כל micromeres מהעובר בשלבים מוקדמים מחשוף. כדי להשתמש בפרוטוקול זה כדי להסיר macromeres בשלב זה, או לסטומרי...

Hawaiensis Parhyale סרטני amphipod התפתחה בעשור האחרון כאורגניזם מודל מבטיח עם פוטנציאל גדול לשימוש במחקר בביולוגיה התפתחותית אבולוציונית 1. בין פרוקי הרגליים, רוב מערכות מודל הן חרקים, ולמדו נרחב ביותר של אלה הוא זבוב הפירות melanogaster דרוזופילה. ד melanogaster הוא חבר Diptera כדי חרקים, וכמו תכונות עובריות רבות מציג באופן שנגזרות ביחס לאלו של חרקים basally הסתעפות 2. יתר על כן, חרקים מקוננים בתוך subphylum Pancrustacea 3, כלומר יש לי חרקים קרובי המשפחה הקרובות ביותר שלהם בתוך הקבוצה ארוכת השנים &quot;הטבעית&quot; בשם pancrustaceans, וכי קבוצה זו היא paraphyletic. הדבר מצביע על כך, בנוסף להסתעפות basally דגמי חרקים, מחקרים של סרטנים אחרים נדרשים כדי לקבל תצוגה רחבה יותר של ההיסטוריה האבולוציונית של התכונות התפתחותיותמנגנונים מולקולריים nd שנחקרו כל כך טוב בד melanogaster. עם זאת, מעט מאוד סרטנים כבר מבוססים היטב על ניתוח מעבדה ניסיוני של פיתוח. Amphipod פ hawaiensis היא מערכת מודל מעבדה צייתנית מאוד, נוחה למגוון של טכניקות ניסוי. Amphipods להציג תכונות ייחודיות רבות בתוך superorder ההורה שלהם Peracarida (מינן חוף, סקדים, ושרימפס היטב), ולכן חשב שניתן להפיק יחסית בתוך קבוצה זו של סרטנים. עם זאת, קלות היחסית של מניפולציה גנטית עוברית ופונקציונלית המוצע על ידי Parhyale להפוך amphipod זו תוספת רבת ערך למלאי הנוכחי של אורגניזמים מודל. כחיות מעבדה, פ hawaiensis מציע יתרונות רבים. בעלי חיים הם סובלניים למגוון רחב של טמפרטורות ומליחות, ולשרוד גם בתרבויות גדולות של מי ים מלאכותי 1. זה קל להבחין betwזכרים ונקבות een מבוססים על הבדלים מורפולוגיים ברורים, בעיקר, איברים הגדולים, מכור, תא מטען קדמי כי גברים להשתמש בו כדי לתפוס את הנקבות בעת ההזדווגות. לעבודה עוברית והתפתחותי, פ יש hawaiensis כמה תכונות מושכת מאוד. עובר נמשך כ 10 ימים והזמן לבגרות מינית הוא כשישה שבועות ב28 º C (אבל שים לב שParhyale שורד גם בטמפרטורות הנעות בין כ 20-30 º C, וכי מידע בימוי התפתחותית מפורט נגיש לעוברים הועלו ב18 º C 4 , 25 C º 4, ו26 º C 5,6). מבוגרים הזדווג בכל ימות במעבדה השנה, כך שהעוברים זמינים בכל עת של שנה. נקבות מטיל 2-20 (תלוי בגיל של נקבה) ביצים המופרות לתוך כיס דגירה הגחון ממוקם בין כמה הזוגות הראשונים של רגליים (איורים 1 א ו 1 ב &#39;), ואפשר לאסוף עובר אלהזה מוקדם מאוד בפיתוח בלי להרוג את הנקבה או פגיעה בעוברים (איור 1 ג). העוברים לשרוד במי ים מלאכותיים מסוננים דרך לבקיעה, יכולים להיות קבועים לביטוי גנים שלאחר מכן או ניתוח היסטולוגית 7, ושולחן היערכות מפורט מאפשר זיהוי מדויק של ההתקדמות בפיתוח 5. פרוטוקולים חזקים שימשו כדי לבצע ניתוח ביטוי גנים על ידי הכלאה באתר 8-15 או immunostaining 4,16,17, מציאה פונקציונלית על ידי התערבות RNA 13,15 או 12 morpholinos, וקו נבט יציב Transgenesis 18. שימוש במערכת transgenesis, הביטוי מושרה 14 ומלכודת משפר גם 19 שיטות יכולות לשמש כדי לחקור את תפקוד גן בפ hawaiensis. בעוד רצף הגנום זמין לציבור אינו זמין כרגע, יש transcriptome מכיל תעתיקים נוצרים במהלך oogenesis ועובר דבורהn דה נובו התאסף ומבואר 20, והופקד במסד נתונים לחיפוש 21, הנחיית גילוי גן. לסיכום, פ hawaiensis הוא אורגניזם מודל צייתן מאוד מתאים לגישות ניסיוניות וגנטיות רבות להבנת התפתחות. בניגוד לשסעים לי עובריים המוקדמים של ד melanogaster, פ עוברי hawaiensis לדבוק holoblastically הבא (איור 2 א) הפריה. ניתוח התחקות שושלת הראה כי על ידי מחשוף שלישי, כל אחד מלסטומרים המחשוף השלישי נגזר במיוחד כדי להצמיח אחד משלוש השכבות נבט או הקו נבט 6 (איור 2). נתונים אלה, יחד עם נתוני microarray 22, שושלת תא מנתח 6,23, וניסויים בידוד blastomere 4 הראו כי פוטנציאל התפתחותי מופרד ללפחות חלק לסטומרים מחשוף שלישי בירושה סימטרית של celגורמי גורל ליטר. בהתאם לכך, בניסויי אבלציה blastomere שבמבשר שורת הנבט (שמכונה &quot;G&quot; במינוח שושלת תא Parhyale 6) הוסר בשלב התא שמונה, עוברים חסרי תאי נבט בשלבי התפתחותיים מאוחרים יותר 4, כפי שצוינו על ידי ההעדר של תאים המבטא את החלבון ושה, אשר מהווה סמן שורה נבט ברוב metazoans 24. לעומת זאת, ניסויי אבלציה blastomere גופניים הראו כי פ עוברי hawaiensis גם בעלי יכולות רגולציה משמעותיות, כך שגורלם של מבשר לסטומרים המזודרם או האאקטודרם מלוטש בשלב שמונה תאים שניתן לנקוט על ידי צאצאיהם של חלק מלסטומרים נותר 25. איך החלפת גורל תא ויסות יכולה להתרחש, ועל ידי לסטומרים סומטיים היקף אימוץ גורל תא אוטונומי, נותר עלום. טכניקות עובריות ניסיוניות כגון אבלציה blastomere יכולות להיות שימושיות במבדינג האוטונומיה היחסית וnonautonomy של החלטות גורל תא 26,27 ולכן עניין במחקר של פ עובר hawaiensis. בניסויים שהדגימו החלפה רגולטיביות של שושלות ectodermal וmesodermal, אבלציה blastomere בוצעה על ידי הזרקה 28 והעירור הבא של צובעת phototoxic 25. אמנם שיטה זו היא יעילה להרוג blastomere (ים) המוזרק, זה לא להסיר לחלוטין את גוף תאים המת מן העובר. בנוסף, הבדלים שנצפו בין נתונים שנאספו באמצעות שושלת תא לשלבי gastrulation של עובר על ידי הזרקת לסטומרים עם קליעים נותבים שושלת ניאון 28,29, ונתונים שנאספו על ידי ביצוע לסטומרים מוטרד באמצעות פיתוח של אותו שלבים עובריים 23. ההסרה גופנית מלאה של לסטומרים ספציפי ולכן עשויה להיות שיטה מועדפת של אבלציה עבור יישומים מסוימים. אנחנו שפורסמו בעבר התוצאות של שושלת תא ניתוחים של עוברים שבו תאים בודדים היו ablated 23 באופן ידני. יחד עם זאת, הפעולות העדינות נדרשו להסיר לסטומרים אחד מעוברים בשלב מחשוף מוקדמים טרם תוארו באופן מלא. כאן אנו מציגים פרוטוקול לאוסף של פ עוברי hawaiensis ואבלציה הידנית של blastomere בודד מעובר בשלב שמונה תאים. מטרתה של שיטה זו היא להשיג הסרה מלאה של גוף התא מהעובר, ומאפשר התבוננות בהתנהגויות הסלולר ויכולות גורל תא של התאים שנותרו בעובר והתפתחות פוסט עוברי. הפרוטוקול שלנו מראה הסרת g שורת נבט המבשר (איור 2 ג), אבל יכול להיות מיושם על כל תא בשלב שמונה תאים, או ללסטומרים שלבי מחשוף קודם לכן. באופן עקרוני, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם להסרת תאים בודדים מעוברי שלב מחשוף המוקדמים של other holoblastically ביקוע חסרי חוליות ימיות.

<table><tbody><tr><td>15 ס"מ פיפטה פסטר</td><td>ויטון</td><td>53499-630 VWR</td><td>להעברת עוברים שלמים ובלסטומר ממנה לצלחת.</td></tr><tr><td>22 ס"מ פסטר פיפטה</td><td>וויטון</td><td>53499-632 VWR</td><td>להכנת קצות פיפטה לפה.</td></tr><tr><td>צלחות פטרי 3 ס"מ</td><td>Thermo Scientific</td><td>25382-334 VWR</td><td>השתמשו בחלקם ללא שינוי כדי לאסוף ולאחסן עוברים; צפו חלקם בשכבה של סילגארד (ראו להלן) כדי ליצור משטח עבודה לאבלציה של בלסטומרים.</td></tr><tr><td>48 בארות</td><td>צלחות Greiner Bio-One</td><td>82051-004 VWR</td><td>לתרבית עוברים לאחר אבלציה.</td></tr><tr><td>מסנני בקבוק 0.2 ומיקרו; m</td><td>Nalge Nunc International</td><td>28199-296 VWR</td><td>ליצירת FASW (ראה להלן).</td></tr><tr><td>מבער בונסן</td><td>VWR</td><td>89038-530 VWR</td><td>ליצירת כלי חוט טונגסטן ופיפטה עדינה של הפה.</td></tr><tr><td>סופר יהלומים</td><td>Musco Sports Lighting</td><td>52865-005 VWR</td><td>ליצירת פיפטות פסטר בעלות פה רחב לאיסוף זוגות.</td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>11050-10 כלים מדעיים עדינים</td><td>להחזקת נקבות מורדמות במהלך הוצאת עוברים מכיס הגידול. אלה לא חייבים להיות מלקחיים של דומונט עדינים - הקצוות יכולים להיות קהים לפחות כמו אלה של המלקחיים שעבורם מופיע המספר הקטלוגי כאן.</td></tr><tr><td>Fungizone-Amphotericin B</td><td>Sigma</td><td>A2942 Sigma Aldrich</td><td>הוסף ל-FASW לריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל, והשתמש בתמיסה זו לתרבית עוברים שעברו כריתת בלסטומר.</td></tr><tr><td>נימי זכוכית באורך 4 אינץ', 1/0.58 OD/ID (מ"מ)</td> <td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>1B100-4 מכשירי דיוק</td><td>עולמיים להכנת מחטים לניקוב הבלסטומר שיש להסיר.</td></tr><tr><td>שעון זכוכית בקוטר 300 מ"מ</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>70543-30 מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>לשימוש בהוצאת עוברים מכיס הגידול של נקבות מורדמות.</td></tr><tr><td>מי ים מלאכותיים מיידיים באוקיינוס (ASW)</td><td>Instant Ocean</td><td>IS160 Aquatic EcoSystems</td><td>מייצרים ASW על ידי המסת מלח במים נטולי יונים למליחות של 1.022-1.024.</td></tr><tr><td>מי ים מלאכותיים מסוננים מיידיים (FASW)</td> <td>Instant Ocean</td><td>IS160 Aquatic EcoSystems</td><td>שימוש ב-0.2 ומיקרו; מסנני m לעיקור ASW. יש להתאפר בכמויות קטנות (< 250 מ"ל) לפי הצורך.</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>21905-026 VWR</td><td>לשבירת הקצה העדין של פיפטות פסטר שהותאמו לאיסוף זוגות.</td></tr><tr><td>מתאם פיפטה לפה</td><td>Drummond Labware</td><td>A5177-5EA Sigma Aldrich</td><td>הכנס את קצה פיפטת פסטר המשוך דק לקצה זה, שישמש להסרת תוכן תאים מוחצן במהלך הליך האבלציה.</td></tr><tr><td>צינורות פיפטה בפה</td><td>Aldrich</td><td>Z280356 Sigma Aldrich</td><td>חתכו את זה כדי להיות ארוך מספיק כדי לתלות בנוחות סביב הצוואר במהלך הליך האבלציה.</td></tr><tr><td>מושך מחט</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P97 Sutter Instrument Company</td><td>לייצור מחטים מנימי זכוכית לניקוב הבלסטומר שיש להסיר.</td></tr><tr><td>תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Mediatech</td><td>45000-650 VWR</td><td>הוסף ל-FASW לריכוז סופי של 100 יחידות/מ"ל פניצילין ו-100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין, והשתמש בתמיסה זו לתרבית עוברים שעברו הסרת בלסטומר.</td></tr><tr><td>נורת גומי</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>100488-418 VWR</td><td>לשימוש בפיפטות פסטר להעברת עוברים ממנה לצלחת.</td></tr><tr><td>סילגארד 184</td><td>ק. ר. אנדרסון, בע"מ</td><td>NC9659604 פישר סיינטיפיק</td><td>מייקאפ לפי הוראות היצרן. יוצקים שכבה בעובי 2-5 מ"מ לתוך צלחת פטרי בגודל 3 ס"מ ליצירת משטח עבודה לאבלציות בלסטומרים.</td></tr><tr><td>חוט טונגסטן בקוטר 0.004 אינץ'</td><td>מערכות A-M</td><td>719000 מערכות A-M</td><td>השתמש בזה כדי ליצור כלי להוצאת עוברים מכיס הגידול של נקבות מורדמות.</td></tr></tbody></table>

אבלציה של תא בודד משמונה תאי עוברים של סרטנאים amphipod<em&gt; parhyale hawaiensis</em

Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

Hawaiensis amphipod Parhyale הוא סרטנים קטנים שנמצאו בבתי הגידול ימיים intertidal ברחבי העולם. במהלך העשור האחרון, Parhyale התפתחה כאורגניזם מודל מבטיח למחקרי מעבדה של פיתוח, מתן השוואת קבוצת חוץ שימושית לאורגניזם מודל arthropod למד היטב תסיסנית. בניגוד לשסעים לי עובריים של תסיסנית, השסעים המוקדמים של Parhyale הם holoblastic. מיפוי גורל באמצעות צבעים נותב מוזרקים לתוך לסטומרים מוקדם הראו כי כל שלוש השכבות הנבט והקו נבט נקבעו בשלב שמונה תאים. בשלב זה, שלושה לסטומרים נגזר על להצמיח האאקטודרם, שלוש נגזרו על להצמיח המזודרם, ושני לסטומרים הנותרים הם המבשרים של הקו האנדודרם ונבט בהתאמה. עם זאת, ניסויי אבלציה blastomere הראו כי עוברי Parhyale גם להחזיק capabiliti רגולציה משמעותיתes, כזה גורלות לסטומרים ablated בשלב שמונה התא ניתן השתלטו צאצאים כמה לסטומרים הנותר. אבלציה Blastomere כבר בעבר שתוארה על ידי אחת משתי שיטות: הזרקה וההפעלה הבאה של צבעי phototoxic או אבלציה הידנית. עם זאת, photoablation הורג לסטומרים אך אינו מסיר את התאים המת מהגוף את העובר. ההסרה פיזית מלאה של לסטומרים ספציפי ולכן עשויה להיות שיטה מועדפת של אבלציה עבור יישומים מסוימים. כאן אנחנו מציגים פרוטוקול להסרה ידנית של לסטומרים אחת מבמת שמונה התאים של עוברי Parhyale, הממחיש את המכשירים ונהלים ידניים הכרחיים להסרת תאי הגוף מלאה, תוך שמירה על לסטומרים שנותר בחיים ושלמים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על כל תא Parhyale בשלב שמונה תאים, או ללסטומרים שלבי מחשוף המוקדם אחרים. בנוסף, באופן עקרוני בפרוטוקול זה יכול להיות ישים לקליאה המוקדמתעובר שלב vage של חסרי חוליות ימיות holoblastically ביקוע אחרות.

בעקבות אבלציה מוצלחת של מחשוף הסינגל השלישי פ micromeres hawaiensis כפי שתואר בפרוטוקול זה, micromeres שנותר לעבור בהדרגה את עמדותיהם במקצת, כדי לכבוש את השטח הכבוש בעבר על ידי blastomere ablated באופן חלקי. לדוגמא, כאשר גרם מוסר, השכנה mr לסטומרים ומ&quot;ל להסיט מעט ובאו לחלוק גבולות תא לרוחב שהיו בעבר בקשר ישיר עם g (השווה איור 2 א ו 2 ג). בעקבות אבלציה מוצלחת...

Hawaiensis amphipod Parhyale הוא אורגניזם מודל מבטיח ללימודים של אמבריולוגיה הסרטנים ופיתוח arthropod השוואתי ואבולוציה. פרוטוקול זה מתאר שיטה להסרה ידנית של לסטומרים אחד מעוברים בשלב המוקדמים של מחשוף Parhyale.

אבלציה של תא בודד משמונה תאי עוברים של סרטנאים Amphipod<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

The amphipod Parhyale hawaiensis is a small crustacean found in intertidal marine habitats worldwide. Over the past decade, Parhyale has emerged as a ...

הדגמה זו מציגה את הטכניקה להסרה של תא מקור גרמנלי (germline precursor cell) מעובריים בשלב מוקדם ב-pod. הסרטן Parhyale hawaiensis הוא אורגניזם מודל מתהווה בעל פוטנציאל רב לשימוש במחקר אבולוציוני והתפתחותי. רוב המפרקי-רגליים המשמשים כמודל הם חרקים, והנחקר ביותר מביניהם הוא זבוב הפירות Drosophila melanogaster. חרקים משובצים בתוך תת-פylum ה-Pancrustacea, ולימוד של סרטנים אחרים מחוץ לקבוצת החרקים מספק מבט רחב יותר על ההיסטוריה האבולוציונית של תכונות התפתחותיות ומנגנונים מולקולריים שנחקרו רבות ב-Drosophila.עם זאת, רק מספר קטן מאוד של סרטנים הוכשר היטב לניתוח מעבדתי ניסיוני של התפתחות. Parelli הוא מערכת מודל מעבדתית נוחה מאוד לעבודה, ולכן הוא מהווה תוספת בעלת ערך למלאי האורגניזמים-מודל. כבעל חיים למעבדה, Parelli קל מאוד לתחזוקה ולעבודה.המין יכול לשרוד היטב בתרביות גדולות של מי ים מלאכותיים, וקל להבחין בין זכרים לנקבות על סמך הבדלים מורפולוגיים ברורים. הבולט מכולם הוא האיברים הקדמיים הגדולים והמעוקלים שבהם משתמשים הזכרים כדי לתפוס את הנקבות במהלך ההזדווגות לצורך עבודות התפתחותיות. ל-Parelli יש מספר מאפיינים אטרקטיביים מאוד; זוגות מזדווגים לאורך כל השנה, ולכן ניתן לאסוף עוברים בכל עת.הנקבות מטילות את העוברים לתוך שקי השרבט הממוקמים בין מספר זוגות הרגליים הראשונים, וניתן לאסוף את העוברים בשלב מוקדם מאוד של ההתפתחות מבלי להרוג את הנקבה או לפגוע בעוברים. העוברים שורדים במי ים מלאכותיים מסוננים עד לשלב הבקיעה, וקיימת טבלת שלבים מפורטת המאפשרת זיהוי מדויק של ההתקדמות במהלך ההתפתחות. מוצגת כאן בחירה של שלבי התפתחות של paral עד לבקיעה, החל משלב שמונה התאים של ההתפתחות.כל אחד מהתאים בעובר הפרלי מוגדר באופן ספציפי לאחד משלושת שכבות העובר או לתאי הנבט הראשוניים. הגדרת אוכלוסיית תאי הנבט היא המוקד המרכזי בהדגמה זו. התא בשם G, עבור germline (קו נבט), ידוע כקדם-נבט הייחודי בפרלי; ניסויי מעקב אחר שושלות תאים מראים כי צאצאיו של G הופכים לכל תאי הנבט, ואף צאצא אינו מהווה חלק משכבות עובר אחרות.בנוסף, בוצעו ניסויים שבהם הוסר G מהעובר מבלי לפגוע בשאר התאים. בניסויים אלו, בעוברים שמהם הוסר G היו חסרים תאי נבט לאורך שאר תהליך האמבריוגנזה, כפי שהתבטא בהיעדר תאים המבטאים את החלבון vasa, המשמש כסמן לשורת הנבט באורגניזמי מודל בקרב המטזואים. כעת נדגים כיצד לאסוף עוברי parli ולהסיר ידנית את G מעובר בעל שמונה תאים.סרטון זה מדגים את הסרת G, אך ניתן להחיל זאת על כל תא בשלב שמונה התאים. לחלק זה של הפרוצדורה, נזדקק לפיפט פסטור שקציו הורחב, פיפט פסטור שני שלא שונה, מי ים מלאכותיים מסוננים, מכל גדול להוצאת זוגות, צלחוני פטרי קטנים, פלטת בארות מזכוכית, פינצטה וכלי ניתוח המורכב מחוט דק ומקומר בקצה של פיפט פסטור. בסרטון הדגמה זה לא נעשה שימוש בכפפות, אך יש לזכור להוסיף ציוד מגן בהתאם לניהול הסיכונים במוסדכם. כדי להכין את פיפט הפסטור המורחב, חרצו תחילה את הפיפט בעזרת עט יהלום ולאחר מכן שברו בזהירות את הקצה.החזיקו מעל להבה למשך מספר שניות כדי להחליק את הקצוות. הפתח צריך להיות צר מעט מהרוחב המקסימלי של הפיפטה. כדי להכין את כלי הניתוח מחוט, הכניסו חוט טונגסטן לקצה של פיפטת זכוכית והחזיקו מעל להבה כדי להמיס את הזכוכית.כדי לקבע את התיל במקומו, השתמשו בפינצטה כדי לכופף בעדינות את קצה התיל למניפולציה קלה יותר עם הכלי. הקצה המקושת צריך להיות באורך של מעט יותר מחצי סנטימטר. אספו זוגות באמצעות פיפטת פסטור רחבה והעבירו אותם למכל נפרד של מי ים מלאכותיים.השאירו את הזוגות בטמפרטורת החדר למשך לילה. למחרת בבוקר, הסיפו מי ים מלאכותיים מסוננים בבלחץ של פחמן דו-חמצני. אספו את הנקבות המופרדות והרדימו אותן במים אלו.העבירו נקבה אחת לפלטת בארות זכוכית המכילה מי ים מלאכותיים מסוננים עם פחמן דו-חמצני. תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי, אחזו בלוחיות הירך (coxal plates) לאורך צד אחד של הגוף באמצעות פינצטה. העוברים נראים בתוך שקי הדגירה. הכניסו את כלי הנתיחה התיל אל הקצה האחורי של שק הדגירה והרימו בעדינות את התיל לכיוון הקדמי כדי להפריד את כיסוי שק הדגירה, ובכך לפתוח את השק ולחשוף את העוברים.השתמשו בפיפטת פסטור כדי לשטוף מים דרך שקי ביצי ההתרבייה הפתוחים, ובכך דחפו החוצה את העוברים. העבירו את הנקבה למי ים מלאכותיים מסוננים ללא פחמן דו-חמצני כדי לאפשר לה להתאושש לפני החזרתה לתרבית הראשית.העבירו את העוברים לצלחית פטרי עם מי ים מלאכותיים מסוננים ובחנו אותם תחת המיקרוסקופ כדי לקבוע את שלב ההתפתחות שלהם. מכיוון שקשה לעיתים קרובות לקבוע את שלב העוברים לפני הוצאתם מהנקבה, עלינו לעיתים קרובות לאסוף עוברים ממספר נקבות רבות כדי להשיג כמות מספיקה של עוברים בשלב הנכון. לעיתים קרובות, הדרך הקלה ביותר להשגת עוברים בשלב שמונה תאים היא איסוף עוברים בשלבים מוקדמים יותר והמתנה להבשלתם לשלב הרצוי.בנוסף לעוברים שכבר אספנו עבור הליך האבלאציה, נזדקק לפינצטה של פסטור-פיפט, למי מלח מלאכותיים מסוננים, לכלי פטרי עם שכבת אגר, למחט העשויה מקפילרית זכוכית שנמתחה, למסחב פה עם פיה קטנה, לכלי פטרי נקיים ולמי מלח מלאכותיים מסוננים עם amphotericin ו-penicillin streptomycin עבור קצה מסחב הפה. יש למתוח פסטור-פיפט בעל קצה ארוך מעל להבה ולשבור את הקצה של הצד הקטן ולהכניסו אל סוף מסחב הפה. קצה זה הוא בגודל המושלם עבור הפרוצדורה.המחט מזכוכית, שמשמשת לדקירה של G במהלך הליך האבלציה, חייבת להיות בעלת חוד דק, אך חסונה מספיק כדי שלא תישבר כאשר היא נדחפת כנגד הקוריון. כאן מוצגת צורה נפוצה אחת המשמשת במעבדה שלנו. עבור האבלציה, עלינו לזהות תחילה איזה תא הוא G; העובר משמאל מציג את G מוקף בקו שחור, ובסעיף הבא נלמד כיצד להבדיל את G מהשאר של המיקרו-מראות.העובר מימין מראה את התוצאה המצופה לאחר אבלציה מוצלחת. בעובר זה, G הוסר באמצעות אבלציה כפי שסומן במעגל השחור, ונותרו שלושה micro meres בלבד בעזרת פינצטה. גלגלו בעדינות את העובר כדי לצפות בתאים ולהשוות ביניהם.ניתן לזהות את G כמיקרומרה (micromere) הקטנה ביותר השוכנת מעל המקרומרה (macromere) הקטנה ביותר. ניתן לזהות את MAV כמקרומרה הקטנה ביותר על ידי גלגול העובר. בנוסף, G אינה נוגעת בתא EN, שהוא המיקרומרה שמולה. מכיוון שתאי ה-el וה-er חולקים גבול בין G ל-EN בעובר זה, ניתן לראות שהמיקרומרה הקטנה ביותר ממוקמת משמאל וניתן לראות שהיא אינה נוגעת במיקרומרה שמולה.על ידי גלגול העובר, נוכל לוודא שמראת המיקרו זו מונחת על מראת המאקרו הקטנה ביותר. כעת, כשהיא ממוקמת בחלק השמאלי התחתון של העובר, נוכל להגדירה בביטחון כ-G ולהמשיך לשלב האבלאציה. בקצרה.בפרוצדורה זו, נייצב את העובר באמצעות פינצטה בעודנו דוקרים את G עם מחט זכוכית משוכה. לאחר מכן, נפעיל לחץ קל על העובר בעזרת הפינצטה, דבר שיגרום לתכולת G לצאת מהעובר דרך החור שיצרנו. נשתמש בפיפטה פה כדי להסיר את תכולת G לאחר יציאתה מהעובר, כדי שנוכל לראות מתי G הוסר לחלוטין.כעת נעבור על כך בפירוט, מלאו את פלטת מגן המשי בשכבה רדודה של מי ים מלאכותיים מסוננים. העבירו עובר בשלב שמונה התאים לפלטה באמצעות פיפטה של פסטור ופינצטה. ביד שמאל, כוונו את העובר כך ש-G יהיה פונה ימינה ואחזו בו בעדינות כדי לייצב אותו באמצעות מחט זכוכית שנמתחה, דקרו בעדינות את G; אין להחדיר את המחט עמוק מדי כדי למנוע דחיפתה אל תוך המקרו-מראות שמתחת ל-G. החליפו את המחט ביד ימינכם בפיפטה המצוידת בקצה פיפטת פסטור שנמתח.החזיקו את קצה הפפיתה קרוב לחור ב-G הפעילו שאיבה עדינה מאוד. לחצו בעדינות על העובר בעזרת הפנצטה בזמן שהתוכן של G נדחף החוצה מהקוריון. משכו אותו אל תוך פפיתת הפה כדי לאפשר תצפית ללא הפרעה על העובר.עקבו בקשב אחר העובר. עם הסרת G, שולי G יסוגו לכיוון החור ב-corion, ובכך יחשפו את נקודת המפגש של התאים שמתחתיו. המשיכו להפעיל לחץ עד שכל G יוסר, והשתמשו בפינצטה כדי לסובב את העובר ולוודא חזותית שכל G הוסר.באמצעות פיפטת פסטור, העבירו את העובר למי ים מלאכותיים מסוננים בתוספת amphotericin ו-pen strep. החליפו מחצית מהמים סביב העובר מדי יום כדי למנוע זיהום. כאן מוצג עובר לפני ואחרי אבלציה.כפי שניתן לראות, קיים חלל ריק במקום שבו היה ה-G קודם לכן. כאשר הפעולה מבוצעת בעדינות וכאשר העוברים מטופלים היטב לאחר הפרוצדורה, אחוז גבוה מהם שורד עד לבקיעה. במעבדה שלנו, שיעור ההישרדות הממוצע הוא מעט מעל 50%

ablation-single-cell-from-eight-cell-embryos-amphipod-crustacean

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

גורלו של תא עוברי אדם יכול להיות מושפע על ידי מולקולות ירושה ו / או על ידי אותות מתאים שכנים. ניצול מפות גורלו של עובר Xenopus שלב המחשוף, לסטומרים בודדים ניתן לזהות לתרבות בבידוד כדי להעריך את התרומה של מולקולות ירושה לעומת אינטראקציות תא סלולרי.

Explants Blastomere לבדיקת מחויבות גורל תא במהלך התפתחות עוברית

סרטון זה מציג שיטה לבידוד בלסטומרים של C. elegans מעוברים מוקדמים. התאים המתקבלים מתאימים לתרבית תאים או לניסויים ex vivo.

ג. אלגנס דיסקציה של בלסטומיר: שיטה להסרת קליפת הביצה ולניתוק תאים עובריים

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד תאים בודדים מעוברי דג הזברה, העשרה לתאים מעניינים, לכידת תאי דג זברה במערכות מולטיפלקס תאים בודדים מבוססות מיקרופלואידית, והערכת ביטוי גנים מתאים בודדים.

בידוד ואפיון של תאים בודדים מעוברים דג הזברה

פרוטוקול זה מספק הדרכה שלב אחר שלב כיצד ליצור עוברי דג זברה פרביוטיים מרקע גנטי שונה. בשילוב עם יכולות ההדמיה שאין שני להן של עובר דג הזברה, שיטה זו מספקת אמצעי רב עוצמה ייחודי לחקור פונקציות אוטונומיות של תאים לעומת פונקציות לא אוטונומיות של תאים עבור גנים מועמדים מעניינים.

הדור של Parabiotic דג הזברה עוברים ידי Fusion כירורגי של פיתוח Blastulae

ניצול של Cas9 preassembled ribonucleoprotein מורכבים (RNP) היא שיטה חזקה לעריכת הגנום מדויק, יעיל. כאן, אנחנו להדגיש השירות שלה על פני מגוון רחב של תאים, אורגניזמים, כולל תאים אנושיים ראשי שני קלאסי והעתידיים דגם אורגניזמים.

הגנום משופרת עריכה עם Cas9 Ribonucleoprotein שונים תאים ואורגניזמים

המטרה של פרוטוקול זה היא גנוטיפ של כלנית המים ne, שושנת הימים במהלך המאבק מבלי להקריב את העובר.

הגנוזות של כלנית ימית במהלך ההתפתחות המוקדמת

רקמות המורכבות של מערכות רב-תאיים לבלבל את הזיהוי של הקשר הסיבתי בין רמזים החילוץ והתנהגויות הסלולר הפרט. כאן, אנו מציגים שיטה לבחון את הקשר הישיר בין הרמזים תלויי הקשר וצירי החלוקה באמצעות שימוש בשיטת C. אלגיה העובר בלסטומרים וחרוזי פוליסטירן מוקצף.

בחוקת חוץ גופית דפוסי יצירת קשר מרחבי המרחב עם מבודדים העובר בלייסטומרים וחרוזי קלקר

מניפולציות עובריות כגון סילוק והשתלת תאים הן כלים חשובים לחקר ההתפתחות המוקדמת. פרוטוקול זה מתאר מכשיר השתלה פשוט ויעיל לביצוע מניפולציות אלה בעוברי דגי זברה.

מכשיר השתלה פשוט ויעיל לעוברי דגי זברה

explants blastoderm דגי זברה נוצרים על ידי בידוד תאים עובריים ממרכזי איתות אנדוגני בתוך העובר המוקדם, ומייצרים אשכולות תאים נאיביים יחסית מניפולציה בקלות ו ex vivoתרבית . מאמר זה מספק הוראות להכנת explants כאלה ומדגים את התועלת שלהם על ידי חקירת תפקידים עבור נודל איתות במהלך gastrulation.

דור של מסלקי בלסטודרם נאיביים מעוברי דגי זברה

התפתחות עוברית דורשת תיאום בקנה מידה גדול של תנועת תאים. אבלציה תלת-ממדית של עירור דו-פוטון מאפשרת אבלציה תלת-ממדית מבוקרת מרחבית של קבוצות גדולות של תאים עמוקים. בנוסף, טכניקה זו יכולה לחקור את התגובה של תאים נודדים באופן קולקטיבי ב vivo להסתבכויות בסביבה המכנית שלהם.

אבלציות נפח עמוקות ומבוקרות מרחביות באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטון בגסטרולה דג הזברה

למדו אבלציה של תא בודד בעוברי שמונה תאים של הסרטן Parhyale hawaiensis. שיטה זו מאפשרת חקירת תאי קדם גרמליין ומנגנוני התפתחות בארתרופודים.

אבלציה של תא בודד משמונה תאי עוברים של סרטנאים Amphipod

גלה סרטונים נוספים