שיטה לחקר ההשפעה של כשל שחל מושרה כימי ביכולת גופנית ולב הסתגלות בעכברים

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להאיץ את התהליך הטבעי של דגנרציה זקיקית (follicular atresia) בשחלות, ובכך להביא לכשל שחלאי, לדלדול האסטרוגן ולמצב שבו הנקבה אינה נמצאת במחזור, מצב המדמה באופן הדוק גיל המעבר. דבר זה מושג תחילה על ידי מתן של הכימיקל התעשייתי vinyl cycline dioxide או VCD למשך 15 עד 20 ימים רצופים, אשר הוכח כי הוא פוגע באופן ספציפי ומשמיד זקיקי שחלה ראשוניים ופרימורדיאליים קטנים על ידי האצת תהליך הדגנרציה הטבעי שלהם. השלב השני הוא קביעת מחזור האסטרוס והמחזוריות השחלאית באמצעות ציטולוגיה וגינלית, החל משש שבועות בקירוב לאחר תחילת ההזרקות של VCD.

יש להוסיף מעקב של 15 עד 20 ימים של ציטולוגיה ואגינלית המעידה על מצב dste מתמשך או חוסר מחזוריות כדי לאשר את הפסקת המחזוריות וכשל שחלאי. השלב הסופי הוא יישום התערבות שעשויה להיות מושפעת מהמנופאוזה או מהמעבר למנופאוזה, כגון פעילות התנדבותית בגלגל רכיבה בכלוב, והסתגלות לבבית. בסופו של דבר, פעילות התנדבותית בגלגל רכיבה בכלוב והסתגלות לבבית משמשות כדי להראות האם המנופאוזה מפחיתה את הפעילות בגלגל הרכיבה.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ectomy, הוא ש-ectomy הוא הליך כירורגי הגורם לדלדול פתאומי של אסטרוגן, בניגוד לאובדן הפרוגרסיבי והטבעי של אסטרוגן המתרחש במהלך המעבר מתקופה טרום-מנומנפאוזית לתקופה פוסט-מנומנפאוזית. השלכותיה של טכניקה זו חולות על הטיפול במחלות מטבוליות ומחלות לב וכלי דם בנשים לאחר גיל המנופאוזה, שכן נשים פוסט-מנומנפאוזיות רגישות יותר לתסמונת המטבולית ולתחלואה הנלווית לה, כולל מחלות לב וכלי דם, בהשוואה לנשים טרום-מנומנפאוזיות. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן את שלבי הציטולוגיה הוגינלית קשה ללמוד, מכיוון שיש לנקוט משנה זהירות בביצוע טכניקת המריחה הנכונה ובזיהוי מחזור ה-EST.

שומרי vinyl cycline dioxide או VCD בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. כדי להכין את ה-VCD לפרוטוקול ההזרקה, העבירו 0.587 מיליליטר של VCD לבקבוק מינון נקי והביאו את הנפח הסופי ל-10 מיליליטר באמצעות שמן שומשום; סגרו ואטמו עם פקק גומי וערבבו על ידי הפיכה עדינה. אחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבעה ימים.

כדי להתחיל את פרוטוקול ההזרקה של VCD, שקלו שתי עכברים בני חודשיים למשך 20 ימים רצופים, והזריקו מדי יום בתוך הפרטון VCD בטמפרטורת החדר במינון של 160 milligrams per kilogram, תוך שימוש במחט בכיליבר 27 במהלך תקופת ההזרקה. נסו לגוון את אתרי ההזרקה כדי להפחית את הסיכויים לזיהום מקומי באופן דומה. לאחר השלמת תקופת ההזרקה, הזריקו לעכברי ביקורת את תמיסת הנשאי, שמן שומשום, בנפח של 2.5 milliliters per kilogram.

יש לנטר את מחזור ה-estrus מדי יום באמצעות השגת משטחי נרתיק. אחד הגורמים הקריטיים להצלחת מחקר זה הוא השגת משטחי נרתיק באיכות גבוהה לצורך קביעה ציטולוגית. יש להחזיק את העכברים בשיטת ה-dorsum scruff.

החדירו טפטפת המכילה 0.2 milliliters של סליין סטרילי אל פתח הנרתיק לעומק של 0.5 centimeters. ערבבו את הסליין המוזרק שלוש פעמים באמצעות הטפטפת, ולאחר מכן טפטפו טיפה אחת על תבנית זכוכית ריקה. העריכו מיד כל דגימה מיקרוסקופית באמצעות מיקרוסקופ אור סטנדרטי בהגדלה של 100 x כדי לאשש כשל שחלאלי.

בשלב הבא, העכברים לאחר השראת גיל המעבר באמצעות VCD משמשים לניסויי הפעילות הגופנית. מכשיר גלגל הכלוב מורכב מגלגל בקוטר 11.5 centimeter עם משטח ריצה ברוחב חמישה centimeter, המצויד במונה מגנטי דיגיטלי המופעל על ידי סיבוב הגלגל. לפני כל ריצה בגלגל, יש לכייל את גלגל הכלוב בהתאם להנחיות היצרן.

מדדו את הקוטר הפנימי של גלגל הריצה. חשבו את ההיקף והזינו ערך זה למונה הדיגיטלי כגודל הגלגל. כדי להתקין את הגלגל בכלוב, החליקו את תושבת הגלגל דרך החיווט העליון של כלוב בעל החיים.

הדק את מעמד הגלגל לסורגי הכלוב באמצעות תלישי נייר. על התלישים להיות בחלק העליון של הסורגים, הרחק מהבעל חיים. העבר את חלק המחשב ואת כל כבלים מיותרים דרך סורגי הכלוב.

מקמו את המחשב ואת הכבל העודף מחוץ להישג של בעל החיים. ניתן לבצע זאת על ידי הנחת צלחת שקילה פלסטית בגודל בינוני מעל חיווט הכלוב כדי להחזיק את המחשב ואת הכבל העודף. לאחר מכן, חברו את חלק המחשב של המונה המגנטי הדיגיטלי למעמד הגלגל.

בעזרת סרט הדבקה (duct tape), הצמידו את המגנט החופשי של מונה המגנטים הדיגיטלי למוט המרכזי, באותו צד שבו נמצא כבל המגנט המחובר למחשב. שוב, הדביקו את המגנט באופן מספיק כדי להגן עליו מפני נזקי לעיסה. יש למקם את המגנט כך שכל סיבוב של הגלגל יירשם במחשב ללא הפרעות או התנגדות להשלמת סיבוב הגלגל.

חברו את גלגל הריצה אל הגלגל. הניחו את המעמד על ידי הכנסת מוטות התמיכה של מעמד הגלגל אל חורי ההרכבה שבמוטות המרכזיים של הגלגל. ודאו שהגלגל מסוגל להסתובב בחופשיות.

יש לנטר את מערך הניסוי מדי יום כדי לזהות נזקי לעיסה ולתקן אותם במידת הצורך. עבור הניסוי, עכברים נקבות בנות שבעה חודשים מזן C 57, black six ו-B six C3 F1 מתוך שגרייה נתונה יוקצו באופן אקראי לקבוצת משטר האימון או לקבוצת הביקורת השבטית. יש לשכן את בעלי החיים הניסיוניים באופן פרטני בכלוב בגודל 47 על 26 על 14.5 סנטימטר עם גישה ללא הפרעה לגלגל כלוב למשך 28 ימים. בעלי חיים מקבוצת הביקורת ישוכנו יחד בכלוב ללא גלגל.

ספקו לכל בעלי החיים מים ומזון סטנדרטי קשה למכרסמים. הוסיפו לִידו (lido) ורשמו ידנית ערכים יומיים עבור המרחק שנרץ וסך זמן הריצה כפי שמופיע במונה המגנטי; רשמו את ערכי המרחק והזמן באותו חלון זמן של שעה אחת בכל יום, כדי להבטיח ערכים מדויקים ועקביים לאורך תקופת הפעילות הגופנית בת 28 הימים. לאחר הרישום היומי, אפסו את המונה המגנטי כדי להבטיח קריאות מדויקות למחרת.

בסיום תקופת האימון הספציפית, נרשמים משקלי הגוף של בעלי החיים לאחר ההמתה, לפני קצירת הרקמות. כדי להוציא את הלב, בצעו חתך מדיאלי בצד הוונטרלי, פתחו את הסרעפת וחשפו במהירות את הלב. הסִירו את הלב בבסיסו והניחו אותו ב-phosphate buffered saline קר כדי לשטוף ביסוף דם ונטריקולרי שנותר. גזמו מהלב רקמות עודפות, שקלו את הלב השלם והקפיאו אותו בהקפאה מהירה (snap freeze) בחנקן נוזלי במידת הצורך.

אספו רקמות נוספות, שטפו אותן בתמיסת סלקיין פוספט (PBS) קרה בקרח ומודגשת, והקפיאו באופן מהיר ב-isopentane שקורר בחנקן נוזלי. במחקר זה, נגרם כשל שחלה באמצעות טיפול ב-VCD, ואומת באמצעות בדיקה מיקרוסקופית של משטחי הפרשה מהנרתיק. השלב במחזור הבעסרה נקבע לפי הפרופורציה של תאי אפיתל, כמות תאי האפיתל ותאי הלויקוציטים; ב-PROEs שולטים תאי אפיתל גרעיניים.

כאן החצים מצביעים על תאים עם גרעין; במהלך שלב ה-estro התאים הם בעיקר תאי אפיתל קשקיים ללא גרעין. שלב ה-metestrus מאופיין בתערובת של סוגי תאים עם דומיננטיות של לוקוציטים. שלב ה-diestrus נשלט על ידי לוקוציטים.

מחזור הנסתרה בעכברים נמשך בדרך כלל ארבעה ימים לפני ההזרקה של VCD. בעלי חיים נחשבו לא-מחזוריים לאחר 15 ימים של דיאסטרוס מתמשך. איור זה מציג את האורך הממוצע בימים של מחזור הנסתרה בקבוצות שהוזרקו vehicle ו-VCD.

מחזור אחד נמדד מהיום הראשון ב-ES ועד ליום הראשון של המחזור הבא. ב-ES ציטולוגיה וגינלית החלה כשישה שבועות לאחר תחילת ההזרקות. נצפה כי מחזורי ה-ESTRO של בעלי חיים שהוזרק להם VCD הפכו לאסנכרוניים בהשוואה לבעלי חיים שהוזרק להם vehicle, ולאחר 12 מחזורי estro, ציטולוגיה של כל בעלי החיים שהוזרק להם VCD כבר לא העידה על קיום מחזורים עם השלמת פרוטוקול ההזרקה של VCD; צביעת H ו-e של חתכי רקמה שחלאית חשפה אטרופיה משמעותית ברקמה שחלאית שטופלה ב-VCD בהשוואה לקבוצות הביקורת.

בבדיקה תחת הגדלה של 20x ו-200x, נצפתה דלטורה מלאה של זקיקים ראשוניים ופרימורדיאליים ברקמה שטופלה ב-VCD. בניגוד לרקמה שטופלה בביקורת (vehicle), השפעת הכשל השחלאי המושרה על ידי VCD על ביצועי פעילות גופנית נבדקה בעכברים בני שבעה חודשים מטופלי VCD וביקורת משני זנים; ערכי פעילות יומית בגלגל ריצה בכל כלוב נרשמו עבור זמן ומרחק עבור כל חיה שעסקה בפעילות לאורך תקופת אימון של ארבעה שבועות. איור זה מציג את הממוצעים השבועיים של ערכי הריצה היומיים עבור מרחק, זמן ומהירות.

עבור עכברי C 57, black six שטופלו בנשאי תרופה (vehicle) או ב-VCD, לא נצפו הבדלים משמעותיים בביצועי הפעילות הגופנית, שנמדדו על פי מרחק הריצה הממוצע היומי והזמן ששולם על הגלגל, בין הקבוצות שטופלו ב-VCD לאלו שטופלו בנשאי תרופה, הן בזן C 57, black six והן בזן B six C3 F1. תוצאה זו מעידה כי ההשפעה של כשל שחלאני המושרה על ידי VCD על פעילות גופנית רצונית בגלגל בכלוב חוצה לפחות שני זני עכברים לאחר משך הפרוטוקול של פעילות גופנית רצונית בגלגל בכלוב. מדידות מורפומטריות של הגוף תועדו, והלבבות הוצאו במהירות ונשקלו בהתאם לתצפיות קודמות.

נצפתה היפרטרופיה של הלב בתגובה לפעילות גופנית בגלגל ריצה בכלוב, שנמדדה על פי משקל לב מוחלט ומשקל לב מנורמל לאורך השוקה. למרות שמסת הלב המוחלטת ויחס משקל הלב לאורך השוקה היו גבוהים באופן מובהק בעכברים שטופלו ב-vehicle וב-VCD בהשוואה למקביליהם שאינם פעילים, לא נצפו הבדלים מדידים בהיפרטרופיה של הלב בין קבוצת הביקורת לבין כשל שחלאי המושרה על ידי VCD. לבסוף, עכברים לאחר פעילות גופנית רצונית בגלגל ריצה בכלוב, עכברים שטופלו ב-VCD ועכברים שטופלו ב-vehicle, הוכפפו לריצה מאולצת על מסוע כדי לקבוע את יכולות הפעילות הגופנית בעצימות גבוהה ונמוכה.

בפרוטוקול בעצימות גבוהה, מהירות המסוע הממוצעת הועלתה באופן מדורג מדי 10 דקות עד שהעכברים הראו סימנים של תשיאה. בממוצע, המהירות המקסימלית של עכברים שעובדו עם vehicle הייתה 26.7 פלוס או מינוס 0.95 מטרים לדקה, והמהירות המקסימלית של עכברים שעובדו עם VCD הייתה 28 פלוס או מינוס 1.4 מטרים לדקה לפני התשיאה. ריצה בעצימות נמוכה במהירות של 20 מטרים לדקה שימשה לבדיקת קיבולת הסיבולת.

בממוצע, הזמן המקסימלי של עכברים שטופלו בביקורת (vehicle) היה 28.3 פלוס או מינוס 1.3 דקות, והזמן המקסימלי של עכברים שטופלו ב-VCD היה 29.7 פלוס או מינוס 1.4 דקות לפני תשישות. לא נמצאו הבדלים מובהקים ביכולת הפעילות הגופנית בעצימות גבוהה או נמוכה בין הקבוצה שטופלה בביקורת לקבוצה שטופלה ב-VCD, מה שמעיד על כך שלכשל שחלתי המושרה על ידי VCD לא הייתה השפעה על יכולת הפעילות הגופנית של העכברים. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחומי המדעים התאיים, המולקולריים והפיזיולוגיים לחקור את תפקידה של גיל המעבר במכרסמים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תגמירו עם הבנה טובה של אופן ביצוע הזרקות VCD נכונות, ביצוע ציטולוגיה נרתיקית ויישום התערבות פיזיולוגית.