זיהוי לאחר translational השינויים של קומפלקסי חלבוני צמח

המטרה הכללית של הליך זה היא לזהות מודיפיקציות פוסט-טרנסלציוניות של חלבונים המעורבים בקומפלקסים של חלבונים בצמחים, אשר הובעו תחילה באופן זמני או יציב ב-plana עם תגיות לחלבון המבוקש. לאחר מכן, יש לחלץ את סך החלבונים מרקמת הצמח, ולבצע שיקוע חיסוני (immunoprecipitation) של החלבון המבוקש. בשלב הבא, יש להפריד את החלבונים ששוקעו חיסונית על ג'ל אקרילמיד, ולאחר מכן לחלץ ולעכל את החלבונים מרצועת הג'ל הרלוונטית.

כעת העבירו את דגימות החלבון לבדיקת ספקטרומטריית מסות. בסופו של דבר, תוצאות ספקטרומטריית המסות יכולות לזהות שינויים דינמיים במודיפיקציות פוסט-טרנסלציוניות כגון פוספורילציה. בניגוד לשיטות חלופיות, כגון דגירה in vitro של קינאז עם סובסטרט, שיטה זו מבטאת חלבונים בתוך הצמח.

כך שאין צורך לדעת איזו קינאז אחראית על הפספורילציה. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הצמחים, כגון האופן שבו אותות מועברים בתגובה למעקה, שינויים סביבתיים או זיהוי פתוגנים. בנוסף לזיהוי אתרי פספורילציה של קומפלקסים מופעלים של חלבוני עמידות, ניתן להחיל שיטה זו באופן רחב על כל מודיפיקציה פוסט-טרנסלציונית של כל קומפלקס חלבונים בצמח.

באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקשו בהתחלה, מכיוון שאינם רגילים לעבוד עם כמויות גדולות של תמצית ולבצע מספר רב של שלבי פרוטוקול ביום אחד. עבור ביטוי זמני, גדלו את זני ה-agrobacterium עד לשלב סטציונרי. קצרו את ה-agro bacteria באמצעות סנטריפוגציה ב-3000 Gs למשך חמש דקות.

השביה את המשקעים בבופר אינפילטרציה (infiltration buffer). כעת בצע אינפילטרציה לצמחי NCOA hamana בני ארבעה שבועות עם אגרובקטריות באופן ידני באמצעות מזרק ללא מחט של 1 mL, או באמצעות ואקום עם 0.02% surfactant, שניים עד חמישה ימים לאחר האינפילטרציה.

קצרו את העלים שהוחדרו, הקפיאו אותם בחנקן נוזלי ואחסנו בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. לאחר מכן, גרסו 20 גרם של רקמת צמחים וחנקן נוזלי באמצעות מכתש ועלי, והוסיפו 80 מיליליטר של בופר C קר ל-20 הגרמים. ערבבו היטב והמיסו על קרח.

כעת בצעו הומוגניזציה בשלושה פולסים של 10 שניות כל אחד במהירות מלאה. סננו את ההומוגנאט ובצעו סנטריפוגה ב-30,000 Gs למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. במקביל, הוסיפו 100 µL של מטריצת זיקה מתאימה ל-500 µL של בופר חסימה D קר למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, ושטפו שלוש פעמים עם 1 mL של בופר D קר. לאחר מכן, הסירו את הסופרנאט של תמצית העלה והעבירו אותו דרך מזרק עם מסנן של 0.45 µm.

סננו למבחנה חדשה על קרח. חלקו את התמצית הגולמית למנות. עבור אימונו-בלוט (immuno blot).

הוסיפו חמישה µL של תחליל טעינה SDS, ערבבו במכשיר וורטקס ובשלו את הדגימות כדי לגרום לדנטורציה. הוסיפו לכל מבחנה 50 µL של מטריצת זיקה, התלויה בבופר D. דגרו עם סיבוב עדין למשך שעתיים בטמפרטורה של 4 °C, וסבבו בצנטריפוגה כדי לשקיע את מטריצת הזיקה.

לאחר מכן, קחו מנה (aliquot) מהתמצית שאינה קשורה עבור אימונו-בלוט (immuno blot). השליכו את שאר הדגימה, כך שיישארו כ-500 microliters בתחתית המבחנה. השביו את תמיסת השעירה (slurry solution) באמצעות טיפ בעל פיה רחבה (wide bore tip).

העבירו את תמיסת השרי (slurry) המעורב משני המבחנות למבחנה אחת בנפח 1.5 מיליליטר. בצעו סבב של שלוש פעימות של חמש שניות באמצעות צנטריפוגת שולחנית כדי לשקיע את מטריצת האפיניות, והסירו את הנוזל העליון (supernatant) לאחר שלושה עד חמישה שטיפות עם 1 מיליליטר של בופר D קר. הסירו את עודפי בופר D באמצעות מחט של מזרק ובצעו אלוציה עם 200 מיקרוליטר של בופר האלוציה המתאים תחת ניעור קבוע. רכזו את שלושת ה-EITs למבחנה אחת.

לאחר מכן, רכז את החלבונים באמצעות 30 µL של שרף ספיחה (absorption resin) תחת ערבוב בוורטקס. המתן חמש דקות להשקעת השרף, והסר את הנוזל העלון (supernat). הוסף 50 µL של תמיסת טעינה עבור SDS page בריכוז 1X למטריצת האפיניות המשקועה או לשרף הספיחה, ובשֵל למשך 10 דקות בטמפרטורה של 80 עד 100 °C בבלוק חימום של צנטריפוגה.

הרתיחו את מטריצת האפיניות (resin) למשך שתי דקות ב-10,000. קחו אליקווט של 5 µL מהסופרנאט לצורך חסימה אימונולוגית (immuno block) והריצו יחד עם שאר הפראקציות על ג'ל SDS-PAGE באורך של 10 ס"מ, לצורך הפרדה וזיהוי של חלבונים זפוספורפוספטיים באמצעות ספקטרומטריית מסות.

העמיסו את 45 µL הנותרים על ג'ל SDS page לצביעה. צבעו את ג'ל ה-SDS page באמצעות colloidal Coomassie brilliant blue. לאחר מכן, הסירו את הצבע מהג'ל באמצעות שטיפות מרובות במים, רצוי למשך לילה.

כעת, בעזרת סקלפל נקי, חלצו את הפס הרלוונטי מהג'ל, חתכו את פרוסת הג'ל לקוביות של שני עד ארבעה מילימטרים והעבירו את הדגימה למבחנה. שטפו את חלקי הג'ל ב-50% acetonitrile וב-50 millimolar ammonium bicarbonate עד להסרת הצבע. לאחר מכן, שאבו את התמיסה בעזרת פיפטה.

יש להקפיד לא להסיר חלקי ג'ל. יש להוסיף 100% acetonitrile להוצאת המים מהדגימה למשך חמש דקות, ולאחר מכן להסיר את הנוזל העודף. לאחר מכן, להפחתת קשרי הדיסולפיד בחלבון, יש להוסיף 10 millimolar DTT ולהדגיר למשך 30 עד 45 דקות ב-56 °C תוך כדי ניעור; יש להסיר את הנוזל העודף כדי לבצע אלקילציה של שאריות ציסטאין.

הוסיפו 55 millimolar chloro Acetamide למשך 20 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. הסירו את הנוזל העודף, ולאחר מכן שטפו את חתיכות הג'ל פעמיים עם 50%Aceto nitrile למשך 10 דקות. הסירו את הנוזל העודף.

כעת יש להוסיף 100% acetonitrile כדי לייבש את חלקי הג'ל במשך חמש דקות, ולהסיר את הנוזל החופשי עבור ה-Triptych Digest. הוסף 40 µL של תמיסת עבודה של trypsin, ואפשר לחלקי הג'ל להתר hydrated במשך 10 דקות בכמות מספקת של digestion buffer שתכסה את חלקי הג'ל. דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה כדי להשלים את העיכול, וחלצו את הפפטידים מחלקי הג'ל באמצעות 5% formic acid תוך סוניקציה למשך חמש עד 10 דקות.

לאחר מכן העבירו את הנוזל העליון (supernatant) למבחנה חדשה, ייבשו את הפפטידים באמצעות ליופיליזציה או מרכז Vacuum, ואחסנו את הדגימות בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. ניסוי זה מטהר את קומפלקס הקינאז P-R-F-P-T-O מ-nacoa hamana; NACOA hamana טרנסגני המבטא 35 SPTO עבר טרנספורמציה זמנית עם 35 SPRF flag, והקומפלקס הועשר באמצעות שיקוע חיסוני (immunoprecipitation) עם Anti-Flag M two aros. ה-immunoblots מדגימים שיקוע חיסוני יעיל של חלבון ה-PRF המטרה, כאשר הן PTO והן חלבון האפקטור המקישר טוהרו יחד עם PRF, כפי שמעידים זיהוי באמצעות נוגדנים ואנליזה של ספקטרומטריית מסות.

במקרה זה, האסטרטגיה הייתה לכוון לחלבון PTO באמצעות Anti-Flag. האסטרטגיה שונתה כדי לזהות את אתרי הפספורילציה של PTO.

הכמות הכוללת של חלבון PTO, הכוללת הן את קומפלקס ה-PRF והן את הצורה החופשית, הועשרה באמצעות שיקוע חיסוני (immunoprecipitation) עם נוגדני Anti-Flag M2, ועברה הפרדה ב-SDS page, עיכול טריפסין בתוך הג'ל ואנליזה באמצעות ספקטרומטריית מסות, מה שהוביל לזיהוי פפטידים של PTO המכסים כ-80% מרצפו. באופן מעניין, זוהה סט של אתרי פוספורילציה בודדים עבור פפטידי PTO. יש לציין כי אתרי פוספורילציה כפולים זוהו רק בנוכחות של אחד מחלבוני האפקטור.

חשוב להשיג כמויות מספיקות של חלבון צמחי כדי לזהות רכיבים של קומפלקס חלבוני וכן כדי לזהות מודיפיקציות פוסט-טרנסלציוניות של חלבון מטרה. זכרו כי מיפוי של מודיפיקציות כגון פוספורילציה דורש כמות סבירה של חלבון עבור ספקטרומטריית מסות, ולכן לאחר ביצוע פרוצדורה זו, צריכה להיות גלויה על הג'ל לפחות פס חלש. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון זיהוי רכיבי קומפלקס, כדי לענות על שאלות נוספות, למשל כיצד הפעלת קומפלקס חיסוני מובילה לחסינות תפקודית.

יש לזכור כי עבודה עם בופרים אורגניים, חיידקים ו-BBLs של תער עלולה להיות מסוכנת ביותר, לכן יש לנקוט באמצעי זהירות כגון חבישת כפפות ולבישת חלוקי מעבדה.