Name: זיהוי לאחר translational השינויים של קומפלקסי חלבוני צמח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: למד לזהות שינויים לאחר תרגום בקומפלקסי חלבוני צמח באמצעות ביטוי זמני בצמחים וספקטרומטריית מסה. שיטה זו מאפשרת לחקור אינטראקציות חלבוניות ותפקוד ביולוגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

VN נתמך על ידי החברה המלכותית. JPR הוא עתיד עמית מועצה למחקר אוסטרלי (FT0992129). אנו מודים לד&quot;ר מרים גיפורד לקריאה ביקורתית של כתב היד.

הערה: כל הצעדים נעשים בטמפרטורת חדר, אלא אם כן צוין אחרת. 1. הכנה של צמח חומרים וחוצצים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנ &#39; benthamiana <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול Agrobacterium tumefaciens זנים של עניין לביטוי חולף (בדוגמא זו PRF-FLAG, PRF-3xHA, PTO-FLAG ווקטור ריק כביקורת) על ידי טלטול (200 סל&quot;ד) בתרבות נוזלית (בינוני L עם אנטיביוטיקה מתאימה) ב28 ° C עד שלב נייח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף וגלולת agrobacteria ידי צנטריפוגה (3,000 XG במשך 5 דקות). בטל supernatant ו resuspend agrobacteria טבליות במאגר הסתננות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את כמות agrobacteria ידי קבלת הצפיפות האופטית ערך (OD) בספיגה של 600 ננומטר (ABS 600 ננומטר). התאם את OD של חיידקים ל0.1-.8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחדור נ 4 בן שבוע צמחי benthamiana (22 ° C, שעות אור 16) עם agrobacteria ידי האןד (עם מזרק מחטים 1 מ&quot;ל) או על ידי ואקום (להוסיף 0.02% פעילי שטח V / V). שים לב: השתמש העלה התרחב כמעט באופן מלא, הראשון ושני עלים מייד מבוגרים לביטוי חלבון היעיל ביותר. לגילוי של חלבוני ubiquitinated או acetylated לחדור עלים עם 100 MG-132 או 100 ng ננומטר / מיליליטר Trichostatin, בהתאמה, ב 1 ו 2 ימים לאחר חדירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצור את העלים הסתננו 2-5 ימים לאחר חדירה והקפאה בחנקן נוזלי. לאחסן דגימות ב-80 ° C במקפיא. הערה: קבע את הרמה הטובה ביותר של ביטוי של החלבון של עניין לפני כן על ידי לקיחת דגימות מעל קורס של 5 ימים זמן ולזהות רמות חלבון על ידי immunoblotting. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור א &#39; thaliana קווים מהונדסים יציבים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול א thaliana זרעים ב6 צלחות היטב בתוספת 5 מיליליטר של מדיום MS הנוזלי (1% w / סוכרוז v) לכל טוב. שים 04:57 זרעים (מעוקר ומרובדת) של הקו המהונדסעניין או בשורת שליטת untransformed לכל טוב. לנער בסל&quot;ד 200 יומיים לפני העברת הצלחת לחדר צמיחה ולהשאיר למשך 2 שבועות (22 C °, 10 אור hr). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות קציר והקפאה בחנקן נוזלי. הערה: ניתן להשתמש כביקורת קו מהונדס מבטא חלבון שאינו קשור עם אותו התג כמו החלבון של עניין. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חוצצים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן א De-גז הצפת חיץ ל1-2 שעות (לRLKs, חלבוני קרום מחויב אחרים וחלבונים גרעיניים, להוסיף 1% IGEPAL v v / CA-630 53). הערה: ניתן לשמור על מאגר על 4 מעלות צלזיוס לזמן בלתי מוגבל. אתה יכול להשתמש ב1% V / V טריטון במקום IGEPAL CA-360. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 80 מיליליטר של שעה לפחות 1-2 B הצפת קרה לפני החילוץ. הערה: היחס האידיאלי של רקמה לעומת חיץ חילוץ הוא 01:04 (w / v). </li></ol></li></ol> 2. הפקת חלבון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רק לפני המיצוי להכין 80 מיליליטר של הצפת הקרה ג <li style=";text-align:right;direction:rtl"> טוחנים 20 גרם של נ &#39; רקמת benthamiana (כ 15 עלים) או א thaliana שתילים (2-4 גרם לכל צלחת 6 היטב) בחנקן נוזלי באמצעות מכתש ועלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 80 מיליליטר של קר הצפת C ל20 גרם של רקמת קרקע, ומערבב היטב, ולהפשיר על קרח. הערה: טוחנים את כל הדגימות באותו הזמן (חלבון של עניין ושליטה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize עם 3 התפרצויות של 10 שניות כל אחד במלוא מהירות עם homogenizer רקמות (prechilled על 4 מעלות צלזיוס). לסנן דרך רקמות 22-25 מיקרומטר ו צנטריפוגות ב XG 30,000 עבור 30 דקות ב 4 ° C. הערה: לחלופין, homogenize עם מרגמה prechilled טרי ועלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצעדי חסימה ושטיפה של מטריצת הזיקה, להכין 20 מיליליטר של הצפת ד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> של מטריצת זיקה המתאימה בלוק 100 מיליליטר באמצעות 500 מיליליטר של D מאגר הקר המכיל BSA 1% למשך 5 דקות בשעה 4 ° C. הערה: המועדף afמטריצות finity כוללות agarose אנטי הדגל M2, agarose Streptavidin, ה-GFP-Trap_A וagarose אנטי HA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3x לשטוף עם הצפת 1 ד הקר מיליליטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant של תמצית עליי ומסנן דרך מסנן מזרק 0.45 מיקרומטר לתוך צינור חדש על קרח. הערה: צבע התמצית צריך להיות ירוק או צהוב, אם המדגם הפך חום, לבטל ולהתחיל מחדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח aliquot של התמצית הגולמי לimmunoblot, להוסיף חיץ טעינת SDS-PAGE 5x, מערבולת ולפגל על ​​ידי דגימות רותחים 10 דקות ב 80-100 ° C בגוש חום. </li></ol> 3. Immunoprecipitation חלבון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפצל את תמצית החלבון לשני 50 צינורות מיליליטר ולהוסיף 50 μl של מטריצת הזיקה תלויה בהצפת D לצינור אחד. דגירה עם סיבוב עדין במשך שעה 2 ב 4 ° C. הערה: incubations הארוך יותר לא נמצא כדי להגדיל את התשואה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 600 μl (חרוז 6x נפח של מטריצת זיקה) של חיץ elution על ידי הוספה להחיץ D (ריכוזים סופיים): BSA 0.5%, פפטיד FLAG 0.25 מ&quot;ג / מיליליטר (לagarose M2 אנטי FLAG) או 10 מ&quot;מ D-ביוטין (לagarose Streptavidin). הערה: Elution אינו מומלץ במקרה של מטריצות ה-GFP-Trap_A ואנטי HA, כך להמשיך ישירות רותח בחיץ טעינת עמוד SDS 1x, צעד 3.11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזרז את מטריצת הזיקה על ידי צנטריפוגה ב 4 ° C (5 דקות ב1,000 XG). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח aliquot של התמצית מאוגדת לimmunoblot, לבטל את שאר supernatant, עוזב כ 500 μl בחלק התחתון של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend פתרון slurry עם קצה רחב נשא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את פתרון slurry מעורב משני הצינורות לצינור מיליליטר בודד 1.5. שים לב: מעתה והלאה, השתמש 1.5 מיליליטר דל חלבון מחייב צינורות microfuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3x דופק ל5 שניות באמצעות צנטריפוגות המעבדתיים כדי לזרז את מטריצת הזיקה ולהסיר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3-5x עם 1 מיליליטר חיץ קר ד בין שוטף לזרז את מתרי הזיקהx כפי שתואר לעיל וזורקים supernatant. בכביסה האחרונה להסיר עודפי הצפת D עם המחט של מזרק. הערה: לשטוף סופי באמצעות הצפת D עם IGEPAL 0.1% יכולים לשמש כדי להפחית עוד יותר ספציפי מחייב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute עם 200 μl של חיץ elution המתאים (לאנטי הדגל M2 או Streptavidin צעד ראה agarose 3.2) 3x, 5 דקות בכל פעם עם רעד קבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת 3 eluates בצינור יחיד. לרכז את החלבונים באמצעות 30 μl של שרף קליטה. וורטקס, לתת לעמוד במשך 5 דקות ולזרז את השרף (2 דקות ב 10,000 XG). בטל supernatant. הערה: agarose-GFP-Trap_A ואנטי HA, לדלג על השלבים 3.9 ו3.10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של חיץ טעינת עמוד SDS 1x למטריצת הזיקה זירז או שרף קליטה. ורטקס ורתיחה 10 דקות ב 80-100 ° C בגוש חום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה המטריצה ​​מבושלת זיקה או שרף למשך 2 דקות ב 10,000 X גרם. Aliquot 5 μl של supernatanלא לimmunoblot, ולרוץ עם שברים אחרים על ג&#39;ל SDS-PAGE ~ ארוך 10 סנטימטר (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפרדה וזיהוי של חלבוני פוספורילציה על ידי ספקטרומטריית מסה, טען 45 μl שנותר על ג&#39;ל SDS-PAGE ~ ארוך 19 סנטימטר אם נדרשת הפרדה נוספת (איור 2). הערה: מסלול ריק יכול להיכלל בין כל הדגימות כדי להפחית את הזיהום של דגימות. </li></ol> 4. עיכול חלבון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם ג&#39;ל SDS-PAGE עם כתם מבריק colloidal Coomassie הכחול (cCBB). הערה: מזעור טיפול בג&#39;ל להפחתת זיהום עם keratins. ודא שאף אחד מהציוד או הכלים שימש במשך immunoblotting או פעילויות אחרות שאולי השאירו זיהום חלבון שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Destain ג&#39;ל עם כביסה שופעת במים, רצוי O / נ חותכים את הלהקה של עניין מן הג&#39;ל בסכין גילוח נקי. הערה: יישר את הג&#39;ל עם immunoblot אם necessaר&quot;י כדי לאתר את האזור הנכון. כזרחון יכול לעכב העברה של חלבונים על SDS-PAGE לחתוך את האזור באופן מיידי מעל ומתחת ללהקה של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קוביות הפרוסה ג&#39;ל לקוביות של 2-4 מ&quot;מ (זה מבטיח כי הג&#39;ל יהיה מכוסה על ידי פתרונות בצינור מבלי לחסום טיפים פיפטה). הנח בתוך שפופרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאמוד את ההיקף הנדרש כדי לשמור את הג&#39;ל שקוע היטב. השתמש בסכום זה עבור derivatization, דגירה עם פרוטאז ומיצוי פפטיד, ולאחר מכן להשתמש כפול לכרכים משולשים לרחצה. הערה: בטיפוסי לעכל עם כ 100 μl של חתיכות ג&#39;ל לחתוך, שימוש פתרון 500 μl לשטיפה, 2 x 180 μl להתייבשות, 150 μl להפחתה, 120 μl לאלקילציה, ו120 μl לעיכול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את חתיכות ג&#39;ל 2 x 20 דקות (או עד destained) על ידי הוספת אצטוניטריל 50% (באמוניום ביקרבונט 50 מ&quot;מ, ABC). פיפטה את הפתרון נזהר שלא להסיר את חתיכות ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליבש עם Aceto 100%nitrile למשך 5 דקות ולהסיר נוזל חופשי. הערה: ג&#39;ל אמור להופיע מצומק ולבן. אם הצבע הכחול נמשך, דגירה ארוכה יותר באצטוניטריל / ABC ו / או בטמפרטורה גבוהה (C ° 45-55). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפחית את אגרות חוב דיסולפיד חלבון על ידי הוספת 10 מ&quot;מ DTT במים ודגירה של 30-45 דקות ב56 º C עם רעד. הסרת נוזל חופשי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שאריות ציסטאין Alkylate על ידי תוספת של 55 chloroacetamide מ&quot;מ (ב50 מ&quot;מ ABC) של 20-30 דקות (בטמפרטורת חדר, כהה). הסרת נוזל חופשי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חתיכות ג&#39;ל 2 x 10 דקות עם אצטוניטריל 50% (ב50 מ&quot;מ ABC). הסרת נוזל חופשי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבש את חתיכות ג&#39;ל עם אצטוניטריל 100% למשך 5 דקות ולהסיר נוזל חופשי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לtryptic לעכל, להוסיף 40 μl של פתרון עובד טריפסין (של טריפסין 100 ng במאגר עיכול: 50 מ&quot;מ ABC, אצטוניטריל 5% ללהקה צבעונית Coomassie ממוצע). אפשר חתיכות ג&#39;ל לרעננות ל10 דקות. הוסף מספיק של חיץ עיכול כדי לכסות חתיכות ג&#39;ל במידת צורך. לדגור על 37 º CO / נ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעצור את העיכול ולחלץ את הפפטידים חתיכות ג&#39;ל, להוסיף 5% חומצה פורמית (באצטוניטריל 50%) (להוסיף את אותו נפח כמו עיכול הנפח). Sonicate ל5-10 דק &#39;. מעביר את supernatant לצינור חדש. חזור על פעולה החילוץ 3x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את הפפטידים על ידי lyophilization (מועדפת) או רכז ואקום (כגון Speed-Vac או Savant). חנות ב -20 º C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלח המדגם שלך לספקטרומטריית מסה. הערה: הגשנו המדגם שלנו למתקן ספקטרומטריית המסה במעבדה סיינסבורי (Norwich, בריטניה). פרוטוקולים במתקני ספקטרומטריית מסה להשתנות במידה ניכרת, אך בדרך כלל פפטידים יפורק ב0.2% חומצת trifluoroacetic עם אצטוניטריל 2% לפני שהעמיסו על מערכת כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב אלקטרו ריסוס ספקטרומטריית מסת טנדם. </li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים (כספיים או אחרים).

הבהרת המנגנון של הפעלת קולט ידי PAMPs וeffectors יכולה לתרום רבה להבנה של חסינות מפעל שלנו. בשנים האחרונות 20, מסכי שני היברידיים גנטיים ושמרים כבר סייעו לגילוי PRRs והחלבונים NB-LRR. לאחרונה, פרוטוקולים מבוססי ספקטרומטריית מסה הוקמו לצורך זיהוי של חלבונים מווסתים באופן דיפרנציאלי במהלך חיסוניים מאותתים 55-58, PTMs 11,33,59,60, ההרכב של קומפלקסים חיסוניים 61 ומפעיל מטרות 62. כאן אנו מתארים פרוטוקול פשוט לזיהוי PTMs המסדיר את ההפעלה של מתחמים חיסוניים. בהשוואה לפרוטוקולים שתוארו קודם לכן, פרוטוקול זה מאפשר זיהוי מפורט של שינויים דינמיים של PTMs. פרוטוקולים של גישות פרוטאומיקה בקנה מידה גדולה יכולים לזהות PTMs של חלבונים אבל לא מסוגל לחשוף את פלסטיות האתר של PTMs בשל להגבילed הסכומים של חלבון. במקרה של זירחון חלבון, גישות פרוטאומיקה בקנה מידה גדולה בדרך כלל לזהות רק אתרי זירחון השולט 11,33,59. האפיון מפורט של מעמד זירחון החלבון דורש כמות משמעותית של חלבון שיכול להיות מושגת רק באמצעות טיהור חלקית של חלבון המטרה 47. הפרוטוקול מתואר כאן זוגות גישת טיהור חלבונים שמניבה כמות משמעותית של חלבון המטרה, עם ניתוח ספקטרומטריית מסה של החלבון מטוהר. בעקבות פרוטוקול זה, אירוע זירחון היחיד של Pto יוחס בעיקר לSer-198 כפי שתואר קודם לכן 52 אבל כמה ספקטרום ספקטרומטריית מסה נתמך גם על אירוע זירחון יחיד על THR-195 או THR-199. כאשר אירועי זירחון כפולים של Pto נצפו, שילוב הדומיננטי של חומצות אמינו פוספורילציה היה Ser-198 וTHR-199 למרות שילובים באתרים אחרים נצפו גם (טבלה 1). תוצאות אלו מראות בבירור פלסטיות אתר זירחון של קינאזות חלבון והיכולת של הפרוטוקול המתואר לאפיין בפרטים כל אתרי זירחון האפשריים. השלבים הקריטיים ביותר של פרוטוקול זה הם: 1) מיצוי מספק של חלבונים, 2) הגנה על PTMs: 3) כמות מספקת של חלבון המטרה של. ראשית, למיצוי מספק של חלבונים, חשוב לטחון את הרקמות בחנקן נוזלי ולאחר מכן להשתמש homogenizer רקמות כפי שתואר בפרוטוקול. אם homogenizer רקמות אינו זמין, ניתן להשתמש במכתש ועלי. כמו כן, חשוב להשתמש ביחס של אחד לשלוש (או ארבעה) של גרמים של רקמה לנפח של מיצוי מאגר. רקמה זו למאגר יחס וחיץ החוזק הגבוה שאנו מציעים תבטיח כי את ה-pH תישאר ניטראלית במהלך תהליך החילוץ. מצאנו שזו היא בעלת חשיבות מיוחדת עבור א thaliana ועגבניות נוספותctions 52. הגנה של PTMs יכולה להיות מושגת על ידי כולל בכל מאגרי מעכבים המתאימים של אנזימים שיכולים להסיר PTMs. זה גם קריטי לבצע את כל צעדים על 4 מעלות צלזיוס וprechill מאגרים ומכשירים. תשואות גבוהות יותר חלבון המטרה של יכולות להיות מושגת על ידי שימוש בצמחים המבטאים את החלבון בכמויות מספיקות ועל ידי שימוש בכמויות גדולות של רקמה (כ 20 ז). הצעד החשוב ביותר להשגת כמות מספקת של חלבון המטרה של מתרכז חלבון המטרה על ידי immunoprecipitation הישירה. המשמעות של הצעד הזה מודגש על ידי כישלוננו לזהות PTMs של Pto לאחר immunoprecipitation PRF בשל הכמות המוגבלת של coimmunoprecipitated Pto (איור 2). לעומת זאת, immunoprecipitation הישירה של Pto הניבה פפטידים באופן משמעותי יותר למדידה (איור 2 ג) שמוביל לכיסוי כ 80% מרצף החלבון וזיהוי של PTMs (טבלת 1). אנחנו גם strongly ממליץ על שימוש בepitope תגים לimmunoprecipitation חלבון. בהשוואה לנוגדנים שהועלו נגד מטריצת זיקת epitope תגי חלבונים האם יכול להניב כמויות גדולות יותר של חלבון מטוהר באופן חלקי. באמצעות נוגדן שהועלה נגד חלבון ילידי Pto 51 (איור 2 א) לimmunoprecipitation, הצלחנו לזהות זירחון אחד בלבד של שני אתרי זירחון השולט של Pto. פרוטוקול זה בעיקר פותחו לטיהור חלקית של נ &#39; benthamiana חלבון cytoplasmic וההזדהות הבאה של אתרי זירחון שלהם. עם זאת, באמצעות השינויים המתוארים במסמך, פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות לא חלבוני thaliana וחלבונים קרום מחויב. המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא להניב כמויות מספיקות של חלבון המטרה לזיהוי PTMs ולא כדי להשיג את הטוהר הגבוה ביותר של המתחם. אם טוהר גבוה יותרמנדרש המורכב ניתן להוסיף שלב שני של טיהור לפרוטוקול זה 52. במקרה זה, צעד ראשון יאפשר elution של חלבון המטרה ממטריצת הזיקה ללא השימוש במלחים או חומצה גבוהות והשלב הבא עלול להיות כרוך במטריקס, אשר דורש תנאי elution קשים. חשוב להדגיש שיש לנו רק נבדקו פרוטוקול זה לזיהוי אתרי זירחון ושאנו בודקים את יכולתה לזיהוי מפורט של PTMs נוסף כרגע. תוצאות הנציג שלנו הראו בבירור את פלסטיות אתר זירחון של קינאזות חלבון והיכולת של הפרוטוקול המתואר לאפיין אתרי זרחון. והכי חשוב, הם מדגישים כי זיהוי של אתרי זירחון להסתמך בכמות נמוכה של חלבונים על ידי ספקטרומטריית מסה ועל ידי מוטציות נקודה אחת של אתרים האוטומטי זרחון יכול לתת תוצאות מבלבלות. אנחנו מראים כאן בעבר ו47 </sup&gt; כי זירחון הכפול של Pto על Ser-198 וTHR-199 קשור להפעלה של מתחם PRF / Pto. לעומת זאת, תוצאות שפורסמו בעבר 47,63 הראו כי מוטציות נקודה אחת של Ser-198 וTHR-199 לאלאנין, המונעים זירחון באתרים אלו, מסוגלים איתות המצביעה על זירחון שהאתרים האלה הוא לא תנאי הכרחי להפעלה מורכבת . כעת ניתן להסביר תוצאות אלו על ידי זירחון של האתר המשני THR-195. ניתן להשיג תובנה דומה לפלסטיות אתר זירחון של חלבון קינאז השונה הבאה בפרוטוקול זה. יתר על כן, גישה משולבת בשימוש באתרי זירחון להצביע מוטציות, חלבונים שיכולים לעכב קינאז הספציפי (מפעיל) בשילוב עם immunoprecipitation חלבון וניתוח ספקטרומטריית מסה יוביל להבנה טובה יותר של המשמעות האבולוציונית של פלסטיות אתר זירחון של קינאזות חלבון.

מסלולים חיסוניים להסתמך על שלאחר translational שינויים שונים (PTMs) של חלבונים לtransduce במהירות אותות ולהפעיל את תגובה חיסונית 1. PTMs הם שינויים כימיים מהירים, הפיכים, ומאוד ספציפיים של מבנה חלבון שיכול להשפיע על קונפורמציה בחלבון, פעילות, יציבות, לוקליזציה, ואינטראקציות בין חלבונים 2-4. בצמחים, יותר מ -300 סוגי PTMs זוהו כוללים ubiquitination, sumoylation, sulfation, glycosylation, וזירחון 2,5. גוף הולך וגדל של ראיות מדגיש את החשיבות של PTMs בהיבטים שונים של חסינות צמח 1,5,6. זירחון חלבון, הקובץ המצורף הפיך של קבוצת פוספט לסרין, שאריות תראונין או טירוזין הוא רגולטור של פונקציות רבות תאיות, שאינו מפתיע למדו PTM גבוה ביותר בהגנת צמח איתות מפלים 5-11. איתות זירחון תלוי היא חלק בלתי נפרד מהמפעל defeהפעלת NSE יזם לאחר תפיסה תאית של חיידקים על ידי קולטנים הטרנסממברני, או הכרה תאית על ידי חלבוני התנגדות multidomain 5,8. עם פלישה לצמחים, חיידקים זוהו על ידי קולטני קרום פלזמה נקרא קולטנים זיהוי תבניות (PRRs) 12. PRRs ידוע הם או חלבונים כמו קולטן (RLPs) או קינאזות כמו קולטן (RLKs), שניהם נושאים ectodomain מחייב ליגנד ותחום הטרנסממברני אחת לעבור. בניגוד לRLPs, יש לי RLKs תחום קינאז תאיים 13-15. Ectodomain של PRRs נקשר למולקולות elicitor חיידק שימור נקראות הקשורים דפוסים מולקולריים הפתוגן מוביל (PAMPs), במקרה של RLKs, לautophosphorylation וtransphosphorylation בתוך התחום תאיים 6, 16. במורד הזרם של זירחון-Induced תפיסת PRRs, זירחון הבא של חלבוני cytoplasmic כולל קינאזות 17, </sup&gt; 18, E3 ligases 19, קינאז החלבון מופעל mitogen (MAPKs) 20, 21, קינאז חלבון סידן תלוי (CDPK) 22, 23, ושעתוק גורמי 24, 25 מוביל לחסינות מופעלת-PAMP (PTI). בנוסף לתפיסה תאיים על ידי PRRs, הכרה תאית של פתוגנים מושגת באמצעות קולטנים cytoplasmic. חלבוני התנגדות multidomain אלה (R) מכילים תחום משתנה N-סופית, מוטיב מרכזי מחייב נוקלאוטיד (NB), וחוזר בטרמינל C-לאוצין עשיר (LRR) ונקראים לכן חלבוני NB-LRR 26, 27. חלבוני R במישרין או בעקיפין להכיר במולקולות המופקת ממחולל מחל ארסיות נקראות effectors, הידוע גם למקד PRRs וצומת אחרים של מערכת החיסון. הכרה גורמת לגינות חזקות שמובילות לחסינות-מופעל על מפעיל (ETI) 28-31. יש חלבוני NB-LRR requisite ATP מחייב מוטיב בתוך תחום NB 30, 32, אך הם חסרים תחום קינאז. זירחון של תחומים שימור של NB-LRRs כבר דיווח בסקר proteomic בקנה מידה גדולה 33, אבל הרלוונטיות שלה לETI אינן ברורה. בדומה לPTI, הפעלה של חלבוני NB-LRR מובילה לזירחון של חלבוני cytoplasmic כולל MAPKs 34-37 וCDPKs 38-40. והכי חשוב, הכרת מפעיל יכולה להוביל לזירחון של חלבוני אבזר המתקשרים ישירות עם חלבוני NB-LRR 41. כמה דוגמאות כוללות RIN4 (thaliana ארבידופסיס) וPto (עגבנייה, Solanum lycopersicum) חלבונים הפועלים באינטראקציה עם חלבוני NB-LRR, 42 RPM1, 43 ו44 PRF, בהתאמה. במהלך זיהום על ידי חיידקי Pseudomonas syringae, חלבון מפעיל AvrB גורם זירחון RIN4, ככל הנראה על ידי קינאז כמו קולטן RIPK 45, <sup&gt; 46. באופן דומה, בעגבניות פ syringae effectors AvrPto וAvrPtoB לגרום זירחון של Pto 47. בניגוד לRIN4 שחסר תחום קינאז וחייב להיות טרנס פוספורילציה, PTO הוא קינאז פעיל מסוגל האוטומטי זירחון 48 וטרנס זירחון של מצעים 49, 50. בעוד Pto דורש פעילות קינאז לייזום מפעיל תלוי של איתות, מוטציות Pto קינאז מת עדיין מסוגלת לאותת בדרך מפעיל עצמאי 51. לאחרונה הסבירו את התצפיות הללו על ידי הוכחת כי מורכב PRF / Pto הוא oligomeric, המכיל PRF מרובה וPto מולקולות 52 וכי מולקולות Pto בתוך אותו מורכב יכולות טרנס phosphorylate אחד את השני 47. הצענו מודל שבו מולקולה אחת של Pto (חיישן) אינטראקציה עם חלבון מפעיל, וגרמה לשינוי קונפורמציה לחלבון NB-LRR (PRF) שבתורו מפעיל מולקולה שנייה Pto (עוזר) שנינותהין המורכב. בהמשך לכך, העוזר Pto טרנס phosphorylates מולקולת החיישן Pto מוביל להפעלה מלאה של ההתנגדות המורכבת 47. דוגמאות אלו מראות כי זיהוי של רכיבים מורכבים חיסוניים וPTMs את הפוטנציאל שלהם בעת הכרת מפעיל יכול להוביל להבנה טובה יותר של כיצד אותות transduced מתפיסת מפעיל למטרות במורד הזרם. כאן אנו מתארים שיטת טיהור חלבונים לחלבוני NB-LRR-אינטראקציה וההזדהות הבאה של PTMs. אנו משתמשים benthamiana ניקוטיאנה ומורכב עגבניות PRF / Pto כמודל, אבל באותו הפרוטוקול בקלות יכול להיות מיושם על RLKs מנ benthamiana וא &#39; thaliana 53 עם שינויים קטנים כפי שאנו מתארים במסגרת הפרוטוקול.

<table><tbody><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>Acetosyringone</td><td>Sigma</td><td>D134406</td><td>רעיל - 1 M מלאי במזרק DMSO</td></tr><tr><td>1 מ"ל סטרילי</td><td>מחט מזרק Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Terumo</td><td>NN-2525R</td><td></td></tr><tr><td>Silwet L-77 (פעילי שטח)</td><td>Lehle Seeds</td><td>VIS-01</td><td>מלאי</td></tr><tr><td>MG-132 (Z-Leu-Leu-Leu-al)</td> <td>Sigma</td><td>C2211</td><td>1 M רעיל ב-DMSO, יש לאחסן ב-80 מעלות; מלחי C</td></tr><tr><td>MS</td><td>Sigma</td><td>M5524</td><td>מחמצן, רעיל</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא</td><td>16104</td><td></td></tr><tr><td>בסיס Trizma</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>התאם את ה-pH עם 1 N HCl כדי ליצור 1 M Tris-HCl buffer</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>5 M מלאי</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td>רעיל - 0.5 מיליון מלאי</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>National Diagnostics</td><td>EC-606</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td>PVPP קורוזיבי</td></tr><tr><td>(פוליוויניל פוליפירולידון)</td><td>Sigma</td><td>P5288</td><td>אל תתבלבלו עם PVP</td></tr><tr><td>DTT (DL-dithiothreitol)</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td>רעיל - 1 M מלאי, יש לאחסן ב-20 מעלות; </td></tr><tr><td>C קוקטייל מעכב פרוטאז צמחי</td><td>Sigma</td><td>P9599</td><td>אין להקפיא/להפשיר יותר מדי פעמים</td></tr><tr><td>PMSF (פנילמתיל-סולפוניל פלואוריד)</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>קליקולין A קורוזיבי, רעיל</td></tr><tr><td></td><td>טכנולוגיית איתות תאים</td><td>9902</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פלואוריד (NaF)</td><td>Sigma</td><td>S7920</td><td>רעיל - 1 M מלאי</td></tr><tr><td>נתרן מוליבדט (Na2MoO<תת>4)</td><td>Sigma</td><td>S6646</td><td>מלאי 0.5 M</td></tr><tr><td>נתרן אורתוואנדאט (Na3VO4)</td><td>Sigma</td><td>450243</td><td>toxic - הכן תמיסה של 200 מ"מ של נתרן אורתוואנדאט. התאם את ה-pH ל-10.0 באמצעות 1 N NaOH או 1 N HCl. ה-pH ההתחלתי של תמיסת הנתרן אורתובנדאט עשוי להשתנות עם הרבה מהכימיקלים. ב- pH 10.0 התמיסה תהיה צהובה. מרתיחים את התמיסה עד שהיא הופכת חסרת צבע (כ -10 דקות). מצננים לטמפרטורת החדר. התאם מחדש את ה-pH ל-10.0 וחזור על שלבים 3 ו-4 עד שהתמיסה נשארת חסרת צבע וה-pH מתייצב על 10.0.&nbsp;</td></tr><tr><td>חומצה אוקדאית</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-3513</td><td></td></tr><tr><td>קינמטיקה פוליטרון רקמות הומוגניזר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-451-320</td><td></td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>Merck Millipore</td><td>475855-1R</td><td></td></tr><tr><td>anti-FLAG M2 agarose</td><td>Sigma</td><td>A2220</td><td>מטריצה זו מומלצת</td></tr><tr><td>סטרפטווידין-אגרוז</td><td>תרמו-מדעי</td><td>20347</td><td>זה מטריצה מומלצת</td></tr><tr><td>GFP-Trap_A</td><td>Chromotek</td><td>gta-20</td><td>מטריצה זו מומלצת</td></tr><tr><td>Anti-HA-Agarose</td><td>Sigma</td><td>A2095</td><td>מטריצה זו מומלצת</td></tr><tr><td>0.45 &mu; m filter</td><td>VWR</td><td>513-1902</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>FLAG peptide</td><td>Sigma</td><td>F3290</td><td></td></tr><tr><td>D-biotin</td><td>Sigma</td><td>47868</td><td></td></tr><tr><td>שרף StrataClean</td><td>Agilent</td><td>400714</td><td>שרף ספיגה זה מומלץ למשקעי חלבון</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PROTEAN II XL Cell</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td>כתם זה מומלץ</td></tr><tr><td>צינורות קשירה נמוכה לחלבון (LoBind)</td> <td>Eppendorf</td><td>0030 108.116</td><td>צינורות אלה מומלצים</td></tr><tr><td>אמוניום ביקרבונט (ABC)</td> <td>Sigma</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>VWR</td><td>83639</td><td>רעיל, דליק</td></tr><tr><td>2-כלורואצטמיד</td><td>Sigma</td><td>22790</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>רעיל Promega</td><td>V5280</td><td>מגרה, רגיש</td></tr><tr><td>חומצה פורמית</td><td>סיגמא</td><td>14265</td><td>סוניקטור אמבט מים רעיל, קורוזיבי</td></tr><tr><td></td><td>Ultravawe</td><td>Ultra BT אמבט</td><td></td>אולטרסאונד</tr><tr><td>LTQ-Orbitrap XL</td><td>תרמו-מדעי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>טריכוסטטין A</td><td>סיגמא</td><td>T8552</td><td>רעיל</td></tr></tbody></table>

זיהוי לאחר translational השינויים של קומפלקסי חלבוני צמח

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

צמחים להסתגל במהירות לשינויים בסביבה בשל לפרט תפיסה ומערכות איתות. במהלך התקפת הפתוגן, צמחים במהירות להגיב לזיהום באמצעות הגיוס וההפעלה של מתחמים חיסוניים. הפעלה של מתחמים חיסוניים קשורה לאחר translational שינויים (PTMs) של חלבונים, כגון זרחון, glycosylation, או ubiquitination. ההבנה כיצד PTMs אלה כוריאוגרפיה תוביל להבנה טובה יותר של איך התנגדות מושגת. כאן אנו מתארים שיטת טיהור חלבונים לחוזרים מחייב נוקלאוטיד לאוצין עשיר (NB-LRR)-אינטראקציה חלבונים וזיהוי הבא של שינוייהם שלאחר translational (PTMs). עם שינויים קטנים, הפרוטוקול יכול להיות מיושם לטיהור של קומפלקסי חלבונים צמחיים אחרים. השיטה מבוססת על הביטוי של גרסה מתויג epitope של החלבון של עניין, אשר לאחר מכן הוא מטוהר באופן חלקי בimmunoprecipitation y ונתון ספקטרומטריית מסה לצורך זיהוי של חלבונים וPTMs אינטראקציה. פרוטוקול זה מוכיח כי: ט). שינויים דינמיים בPTMs כגון זרחון יכולים להיות מזוהים על ידי ספקטרומטריית מסה; השני). זה חשוב לנו כמויות מספיקות של החלבון של עניין, וזה יכול לפצות על חוסר טוהר immunoprecipitate; iii). על מנת לזהות PTMs של חלבון של עניין, חלבון זה יש immunoprecipitated כדי לקבל כמות מספקת של חלבון.

אנו מתארים כאן פרוטוקול לטיהור של חלבונים מתויגים מא המהונדס היציב thaliana קווים או אחרי ביטוי חולף של חלבונים בנ benthamiana. כפי שמודגם באיור 1 הטיהור של החלבון הממוקד בשילוב עם ספקטרומטריית מסה כדי לאפשר זיהוי של חלבוני אינטראקציה וPTMs של חלבון המטרה. הפרוטוקול תוכנן לטיהור של חלבונים מעורבים בחסינות צמח וזיהוי של PTMs שלהם, אבל יכול להיות מיושם לטיהור של כל חלבון צמחי מתויג. כדוגמא אנו משתמשים בטיהור המורכבת PRF / Pto מנ benthamiana. נ המהונדס שורת benthamiana 38-12 54, להביע 35S: PTO, הפכה transiently עם 35S: PRF-FLAG והמורכב היה immunoprecipitated עם agarose אנטי הדגל M2 (איור 2 א). Immunoblots (IB) באיור 2 אלהמחיש כי רוב החלבון הממוקד (PRF) היה immunoprecipitated. PTO וחלבון מפעיל האינטראקציה AvrPtoB היו copurified עם PRF וזוהה באמצעות נוגדנים וניתוח ספקטרומטריית מסה (2A דמויות ו2B). מצאנו כי Pto שcopurified עם PRF היגר איטי יותר על ג&#39;ל SDS-PAGE כאשר coexpressed עם מפעיל בונה 35S: (איור 2 א) AvrPtoB: AvrPto ו35S. שני חלבוני מפעיל מושרה הגירה איטית יותר של Pto PRF-האינטראקציה (איור 2 א). הגירה זו מפעיל ההכרה תלויה איטית של Pto יוחסה בעבר לזירחון כפי שניתן להסירו באמצעות טיפול עם phosphatase 44. כדי לזהות אתרי זירחון תורמים להגירה האיטית של PTO, אנחנו חשופים copurifying PRF Pto לניתוח ספקטרומטריית מסה. למרות הביטוי הגבוה של Pto וזיהוי קל שלה עם immunoblots אנחנו יכולים לאחזר פפטידים גovering רק 57% מהרצף Pto ואנחנו לא הצלחנו לזהות את כל אתרי זרחון (איור 2). בהמשך לכך, שינינו אסטרטגיות למקד את חלבון Pto עם אנטי דגל. נ צמחי benthamiana WT נהפכו transiently עם 35S: PRF-3HA ו35S: PTO-דגל, עם או בלי 35S: AvrPto ו35S:. AvrPtoB הסכום הכולל של חלבון PTO, הכולל גם את המורכבת-PRF וצורות חופשיות, היה immunoprecipitated עם אנטי הדגל M2 agarose וכפוף לחלוקה-SDS, עיכול tryptic בג&#39;ל וניתוח ספקטרומטריה (איור 2 ג). עם גישה זו זיהינו פפטידים Pto פורש כ 80% מהרצף שלו וחלבון kDa ידוע 100 אינטראקציה. זיהינו סדרה של אתרי זירחון יחיד וכפולים לפפטידים Pto 187-202 ו188-202 (טבלה 1). Ser-198 וTHR-199 היו אתרי זירחון הדומיננטיים אבל פו האחראתרי sphorylation גם התגלו (טבלה 1). זירחון והכי חשוב כפול על Ser-198 וTHR-199 זוהה רק בנוכחות של או חלבון מפעיל (טבלת 1). לאחרונה זיהו מערכת דומה של אתרי זירחון Pto ומאויר המשמעות של האירוע הכפול זירחון לאיתות 47. בעקבות הפרוטוקול שתואר כאן היינו מסוגלים לזהות שינויים דינמיים במדינת זירחון של חלבון המטרה. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51095/51095fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51095/51095fig1.jpg" /> איור 1. כללי עיצוב ניסיוני. חלבון המטרה לimmunoprecipitation (IP) מתויג ובא לידי ביטוי בPlanta, transiently בbenthamiana Nicotiana או ביציבות בthaliana ארבידופסיס. בעקבות מיצוי חלבוןחלבון המטרה הוא immunoprecipitated עם מטריצת זיקה. החלבונים מופרדים על ג&#39;ל אלקטרופורזה acrylamide ידי. להקות ג&#39;ל הם נכרת. חלבונים המופקים מלהקות ג&#39;ל ונתונים לספקטרומטריית מסה. אתרי זירחון וחלבונים אינטראקציה מזוהים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51095/51095fig1highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51095/51095fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51095/51095fig2.jpg" /> איור 2. PRF וimmunoprecipitation Pto.). 35S המבנה: PRF-FLAG התבטא transiently ב38-12 קו (35S: PTO), יחד עם וקטור ריק (EV), 35S: AvrPto או 35S: AvrPtoB. שלושה ימים לאחר חדירה-PRF היה immunoprecipitated באמצעות מטריצת זיקה אנטי דגל. אימונוגלובולינnoblots (IB) לPRF, AvrPtoB וPto בוצע. כפי שצוינו על ידי חצים בחלק התחתון של פנל immunoblot PTO, AvrPto וAvrPtoB לגרום להגירה איטית יותר של Pto. ב &#39;). 35S המבנה: PRF-FLAG התבטא transiently ב38-12 קו (35S: PTO), יחד עם וקטור ריק (EV), 35S: AvrPto או 35S: AvrPtoB. שלושה ימים לאחר חדירה-PRF היה immunoprecipitated באמצעות agarose נגד הדגל ונפרד ב- SDS. ג&#39;ל היה מוכתם בcolloidal הכחול Coomassie מבריק (cCBB) וPRF הגלוי, להקות חלבוני Pto וAvrPtoB היו נכרתה מן ג&#39;ל ונותחו על ידי ספקטרומטריית מסה. כיסוי פפטיד אחוז רצפי Pto וPRF זוהו על ידי ספקטרומטריית מסה מצויינים. C). מבני 35S: PRF-3xHA ו35S: PTO-FLAG באו לידי ביטוי transiently יחד עם 35S: AvrPtoB, 35S: AvrPto או וקטור ריק (EV) בנ benthamiana. שלושה ימים לאחר חדירת הסכום הכולל שלPTO-דגל immunoprecipitated באמצעות אנטי הדגל agarose ונפתר ב- SDS. Pto הגלוי ולהקות חלבון PTO-אינטראקציה שנכרתו מן ג&#39;ל ונותחו על ידי ספקטרומטריית מסה. PTO ולהקת חלבון 100 kDa PTO-האינטראקציה נראה בבירור בכחול colloidal Coomassie מבריק (cCBB) הצבעוני ג&#39;ל, ואילו PRF הוא מעט פחות גלוי לעין (כפי שצוין על ידי חיצים). IP: Immunoprecipitation; IB: immunoblot; CBB: מכתים הכחול מבריק Coomassie; cCBB: מכתים colloidal Coomassie מבריק הכחול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51095/51095fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> PRF </td></tr><tr><td></td><td rowspan="2"> EV </td><td rowspan="2"> AvrPto </td><td rowspan="2"> AvrPtoB </td></tr><tr><td> פפטיד PTO 188-202 </td></tr><tr><td> GTELDQ [ט עמ &#39;195] HLSTVVK </td><tד&gt; 1 </td><td> 1 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> GTELDQTHL [S p 198] TVVK </td><td> 10 </td><td> 7 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> GTELDQTHLS [ט עמ &#39;199] VVK </td><td> 8 </td><td> 3 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> G [T p 190] ELDQTHLS [ט עמ &#39;199] VVK </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> GTELDQTHL [S p 198] [ט עמ &#39;199] VVK </td><td> 0 </td><td> 8 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> GTELDQTHLSTVVK </td><td> 46 </td><td> 26 </td><td> 48 </td></tr><tr><td> פפטיד PTO 187-202 </td><td colspan="3"></td></tr><tr><td> KGTELDQ [ט עמ &#39;195] HLS TVVK </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHL [S p 198] TVVK </td><td> 17 </td><td> 17 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHLS [ט עמ &#39;199] VVK </tד&gt; <td> 4 </td><td> 2 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> KGTELDQ [ט עמ &#39;195] HLS [ט עמ&#39; 199] VVK </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHL [S p 198] [ט עמ &#39;199] VVK </td><td> 0 </td><td> 7 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHLSTVVK </td><td> 21 </td><td> 37 </td><td> 18 </td></tr><tr><td> פפטידים 187-202 ו188-202 </td><td> 83 </td><td> 88 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> אחוז של פפטידים עם שני אירועי זירחון </td><td> 0% </td><td> 26.9% </td><td> 11.2% </td></tr><tr><td> PTO רצף כיסוי </td><td> 78% </td><td> 79% </td><td> 82% </td></tr></tbody></table> טבלת 1 זירחון זוגי של פפטיד Pto עם הפעלה של איתות 35S:.. PRF-3xHA ו35S: PTO-FLAG בא לידי ביטוי transiently יחד עם אותםוקטור Pty (EV), 35S: AvrPtoB בנ: AvrPto או 35S benthamiana. שלושה ימים לאחר חדירה, הסכום הכולל חלבון PTO-הדגל היה immunoprecipitated באמצעות מטריצת זיקה נגד דגל והחליט על SDS-PAGE. הלהקות גלויות של Pto על הג&#39;ל colloidal Coomassie המבריק הכחול המוכתם היו נכרת וניתחו עם ספקטרומטריית מסה. מספר פפטידים Pto המזוהה עם 0, 1, ו -2 אירועי זירחון מצויינים. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> טבלה של חוצצים </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מדיום L </td><td> Tryptone </td><td> 10 g / L </td></tr><tr><td></td><td> תמצית שמרים </td><td> 5 גר &#39;/ ליטר </td></tr><tr><td></td><td> NaCl </td><td> 5 גר &#39;/ ליטר </td></tr><tr><td></td><td> D-גלוקוז </td><td> גרם 1 / L </td></tr><tr><td> חיץ Agro-הסתננות </td><td> MgCl 2 </td><td> 10 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> MES &lt;/ Td&gt; <td> 10 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> התאם לpH 5.5 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Acetosyringone (אופציונלי) </td><td> 150 מיקרומטר </td></tr><tr><td> חיץ </td><td> pH טריס-HCl 7.5 </td><td> 150 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> NaCl </td><td> 150 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> EDTA </td><td> 5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> EGTA </td><td> 2 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> גליצרול </td><td> 5% (v / v) </td></tr><tr><td> הצפת B </td><td> חיץ </td><td></td></tr><tr><td></td><td> PVPP </td><td> 2% (w / v) </td></tr><tr><td> החיץ C </td><td> הצפת B </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Dithiothreitol (DTT) </td><td> 10 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> קוקטייל צמחים מעכבי פרוטאז </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td></td><td> פלואוריד Phenylmethylsulfonyl (PMSF) </td><td> 0.5 מ&quot;מ </td&gt; </tr><tr><td></td><td> Calyculin </td><td> 50 ננומטר </td></tr><tr><td></td><td> פלואוריד הנתרן (NAF) </td><td> 50 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> molybdate נתרן (Na 2 Moo 4) </td><td> 10 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> נתרן orthovanadate </td><td> 1 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> חומצת Okadaic </td><td> 100 ננומטר </td></tr><tr><td> החיץ D </td><td> החיץ C ללא PVPP </td><td></td></tr><tr><td> חיץ טעינת 5x-SDS </td><td> pH טריס-HCl 6.8 </td><td> 60 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> SDS </td><td> 2% </td></tr><tr><td></td><td> גליצרול </td><td> 0.15% </td></tr><tr><td></td><td> Bromophenol כחול </td><td> 0.10% </td></tr><tr><td></td><td> DTT (להוסיף רק לפני השימוש) </td><td> 50 מ&quot;מ </td></tr></tbody></table> טבלה 2. חיץ ומתכונים תקשורת.

אנו מתארים כאן פרוטוקול לטיהור והאפיון של קומפלקסי חלבוני צמח. אנו מראים כי על ידי immunoprecipitating חלבון יחיד בתוך מתחם, כדי שנוכל לזהות לאחר translational השינויים שלה והשותפים באינטראקציה שלה.

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לזהות מודיפיקציות פוסט-טרנסלציוניות של חלבונים המעורבים בקומפלקסים של חלבונים בצמחים, אשר הובעו תחילה באופן זמני או יציב ב-plana עם תגיות לחלבון המבוקש. לאחר מכן, יש לחלץ את סך החלבונים מרקמת הצמח, ולבצע שיקוע חיסוני (immunoprecipitation) של החלבון המבוקש. בשלב הבא, יש להפריד את החלבונים ששוקעו חיסונית על ג'ל אקרילמיד, ולאחר מכן לחלץ ולעכל את החלבונים מרצועת הג'ל הרלוונטית.כעת העבירו את דגימות החלבון לבדיקת ספקטרומטריית מסות. בסופו של דבר, תוצאות ספקטרומטריית המסות יכולות לזהות שינויים דינמיים במודיפיקציות פוסט-טרנסלציוניות כגון פוספורילציה. בניגוד לשיטות חלופיות, כגון דגירה in vitro של קינאז עם סובסטרט, שיטה זו מבטאת חלבונים בתוך הצמח.כך שאין צורך לדעת איזו קינאז אחראית על הפספורילציה. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הצמחים, כגון האופן שבו אותות מועברים בתגובה למעקה, שינויים סביבתיים או זיהוי פתוגנים. בנוסף לזיהוי אתרי פספורילציה של קומפלקסים מופעלים של חלבוני עמידות, ניתן להחיל שיטה זו באופן רחב על כל מודיפיקציה פוסט-טרנסלציונית של כל קומפלקס חלבונים בצמח.באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקשו בהתחלה, מכיוון שאינם רגילים לעבוד עם כמויות גדולות של תמצית ולבצע מספר רב של שלבי פרוטוקול ביום אחד. עבור ביטוי זמני, גדלו את זני ה-agrobacterium עד לשלב סטציונרי. קצרו את ה-agro bacteria באמצעות סנטריפוגציה ב-3000 Gs למשך חמש דקות.השביה את המשקעים בבופר אינפילטרציה (infiltration buffer). כעת בצע אינפילטרציה לצמחי NCOA hamana בני ארבעה שבועות עם אגרובקטריות באופן ידני באמצעות מזרק ללא מחט של 1 mL, או באמצעות ואקום עם 0.02% surfactant, שניים עד חמישה ימים לאחר האינפילטרציה.קצרו את העלים שהוחדרו, הקפיאו אותם בחנקן נוזלי ואחסנו בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. לאחר מכן, גרסו 20 גרם של רקמת צמחים וחנקן נוזלי באמצעות מכתש ועלי, והוסיפו 80 מיליליטר של בופר C קר ל-20 הגרמים. ערבבו היטב והמיסו על קרח.כעת בצעו הומוגניזציה בשלושה פולסים של 10 שניות כל אחד במהירות מלאה. סננו את ההומוגנאט ובצעו סנטריפוגה ב-30,000 Gs למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. במקביל, הוסיפו 100 µL של מטריצת זיקה מתאימה ל-500 µL של בופר חסימה D קר למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, ושטפו שלוש פעמים עם 1 mL של בופר D קר. לאחר מכן, הסירו את הסופרנאט של תמצית העלה והעבירו אותו דרך מזרק עם מסנן של 0.45 µm.סננו למבחנה חדשה על קרח. חלקו את התמצית הגולמית למנות. עבור אימונו-בלוט (immuno blot).הוסיפו חמישה µL של תחליל טעינה SDS, ערבבו במכשיר וורטקס ובשלו את הדגימות כדי לגרום לדנטורציה. הוסיפו לכל מבחנה 50 µL של מטריצת זיקה, התלויה בבופר D. דגרו עם סיבוב עדין למשך שעתיים בטמפרטורה של 4 °C, וסבבו בצנטריפוגה כדי לשקיע את מטריצת הזיקה.לאחר מכן, קחו מנה (aliquot) מהתמצית שאינה קשורה עבור אימונו-בלוט (immuno blot). השליכו את שאר הדגימה, כך שיישארו כ-500 microliters בתחתית המבחנה. השביו את תמיסת השעירה (slurry solution) באמצעות טיפ בעל פיה רחבה (wide bore tip).העבירו את תמיסת השרי (slurry) המעורב משני המבחנות למבחנה אחת בנפח 1.5 מיליליטר. בצעו סבב של שלוש פעימות של חמש שניות באמצעות צנטריפוגת שולחנית כדי לשקיע את מטריצת האפיניות, והסירו את הנוזל העליון (supernatant) לאחר שלושה עד חמישה שטיפות עם 1 מיליליטר של בופר D קר. הסירו את עודפי בופר D באמצעות מחט של מזרק ובצעו אלוציה עם 200 מיקרוליטר של בופר האלוציה המתאים תחת ניעור קבוע. רכזו את שלושת ה-EITs למבחנה אחת.לאחר מכן, רכז את החלבונים באמצעות 30 µL של שרף ספיחה (absorption resin) תחת ערבוב בוורטקס. המתן חמש דקות להשקעת השרף, והסר את הנוזל העלון (supernat). הוסף 50 µL של תמיסת טעינה עבור SDS page בריכוז 1X למטריצת האפיניות המשקועה או לשרף הספיחה, ובשֵל למשך 10 דקות בטמפרטורה של 80 עד 100 °C בבלוק חימום של צנטריפוגה.הרתיחו את מטריצת האפיניות (resin) למשך שתי דקות ב-10,000. קחו אליקווט של 5 µL מהסופרנאט לצורך חסימה אימונולוגית (immuno block) והריצו יחד עם שאר הפראקציות על ג'ל SDS-PAGE באורך של 10 ס"מ, לצורך הפרדה וזיהוי של חלבונים זפוספורפוספטיים באמצעות ספקטרומטריית מסות.העמיסו את 45 µL הנותרים על ג'ל SDS page לצביעה. צבעו את ג'ל ה-SDS page באמצעות colloidal Coomassie brilliant blue. לאחר מכן, הסירו את הצבע מהג'ל באמצעות שטיפות מרובות במים, רצוי למשך לילה.כעת, בעזרת סקלפל נקי, חלצו את הפס הרלוונטי מהג'ל, חתכו את פרוסת הג'ל לקוביות של שני עד ארבעה מילימטרים והעבירו את הדגימה למבחנה. שטפו את חלקי הג'ל ב-50% acetonitrile וב-50 millimolar ammonium bicarbonate עד להסרת הצבע. לאחר מכן, שאבו את התמיסה בעזרת פיפטה.יש להקפיד לא להסיר חלקי ג'ל. יש להוסיף 100% acetonitrile להוצאת המים מהדגימה למשך חמש דקות, ולאחר מכן להסיר את הנוזל העודף. לאחר מכן, להפחתת קשרי הדיסולפיד בחלבון, יש להוסיף 10 millimolar DTT ולהדגיר למשך 30 עד 45 דקות ב-56 °C תוך כדי ניעור; יש להסיר את הנוזל העודף כדי לבצע אלקילציה של שאריות ציסטאין.הוסיפו 55 millimolar chloro Acetamide למשך 20 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. הסירו את הנוזל העודף, ולאחר מכן שטפו את חתיכות הג'ל פעמיים עם 50%Aceto nitrile למשך 10 דקות. הסירו את הנוזל העודף.כעת יש להוסיף 100% acetonitrile כדי לייבש את חלקי הג'ל במשך חמש דקות, ולהסיר את הנוזל החופשי עבור ה-Triptych Digest. הוסף 40 µL של תמיסת עבודה של trypsin, ואפשר לחלקי הג'ל להתר hydrated במשך 10 דקות בכמות מספקת של digestion buffer שתכסה את חלקי הג'ל. דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה כדי להשלים את העיכול, וחלצו את הפפטידים מחלקי הג'ל באמצעות 5% formic acid תוך סוניקציה למשך חמש עד 10 דקות.לאחר מכן העבירו את הנוזל העליון (supernatant) למבחנה חדשה, ייבשו את הפפטידים באמצעות ליופיליזציה או מרכז Vacuum, ואחסנו את הדגימות בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. ניסוי זה מטהר את קומפלקס הקינאז P-R-F-P-T-O מ-nacoa hamana; NACOA hamana טרנסגני המבטא 35 SPTO עבר טרנספורמציה זמנית עם 35 SPRF flag, והקומפלקס הועשר באמצעות שיקוע חיסוני (immunoprecipitation) עם Anti-Flag M two aros. ה-immunoblots מדגימים שיקוע חיסוני יעיל של חלבון ה-PRF המטרה, כאשר הן PTO והן חלבון האפקטור המקישר טוהרו יחד עם PRF, כפי שמעידים זיהוי באמצעות נוגדנים ואנליזה של ספקטרומטריית מסות.במקרה זה, האסטרטגיה הייתה לכוון לחלבון PTO באמצעות Anti-Flag. האסטרטגיה שונתה כדי לזהות את אתרי הפספורילציה של PTO.הכמות הכוללת של חלבון PTO, הכוללת הן את קומפלקס ה-PRF והן את הצורה החופשית, הועשרה באמצעות שיקוע חיסוני (immunoprecipitation) עם נוגדני Anti-Flag M2, ועברה הפרדה ב-SDS page, עיכול טריפסין בתוך הג'ל ואנליזה באמצעות ספקטרומטריית מסות, מה שהוביל לזיהוי פפטידים של PTO המכסים כ-80% מרצפו. באופן מעניין, זוהה סט של אתרי פוספורילציה בודדים עבור פפטידי PTO. יש לציין כי אתרי פוספורילציה כפולים זוהו רק בנוכחות של אחד מחלבוני האפקטור.חשוב להשיג כמויות מספיקות של חלבון צמחי כדי לזהות רכיבים של קומפלקס חלבוני וכן כדי לזהות מודיפיקציות פוסט-טרנסלציוניות של חלבון מטרה. זכרו כי מיפוי של מודיפיקציות כגון פוספורילציה דורש כמות סבירה של חלבון עבור ספקטרומטריית מסות, ולכן לאחר ביצוע פרוצדורה זו, צריכה להיות גלויה על הג'ל לפחות פס חלש. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון זיהוי רכיבי קומפלקס, כדי לענות על שאלות נוספות, למשל כיצד הפעלת קומפלקס חיסוני מובילה לחסינות תפקודית.יש לזכור כי עבודה עם בופרים אורגניים, חיידקים ו-BBLs של תער עלולה להיות מסוכנת ביותר, לכן יש לנקוט באמצעי זהירות כגון חבישת כפפות ולבישת חלוקי מעבדה.

identification-post-translational-modifications-plant-protein

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

גישה אמין ושימושי כדי לזהות שינויים היסטון על גנים ספציפיים צמח מתואר. הגישה משלבת הכרומטין immunoprecipitation (שבב) בזמן אמת PCR כמותי. היא מאפשרת זיהוי של שינויים היסטון על גנים ספציפיים עם תפקיד בתהליכים פיזיולוגיים שונים.

זיהוי של שינויים היסטון בעלים הצמח

אנו מציגים וריאציה של (immunoprecipitation כמותיים בשילוב עם מציאה) הגישה המהירה שהוצגה בעבר להבחין בין אמת ושקר אינטראקציות בין חלבונים. הגישה שלנו מבוססת...

פרוטוקול לזיהוי של אינטראקציות בין חלבונים על הסמך<sup&gt; 15</sup&gt; תיוג N מטבולית, immunoprecipitation, כמותית המונית ספקטרומטריית וזיקת ​​אפנון

פירוק חלבונים ממוקד מייצג מנגנון רגולציה עיקרי לתפקוד תא. היא מתרחשת באמצעות מסלול היוביקוויטין-proteasome נשמרים, אשר מייחס רשתות polyubiquitin לחלבון המטרה שלאחר מכן ישמש "תגים" מולקולריים להפרוטאזום 26S. כאן, אנו מתארים assay תא ללא פשוט ואמין לשפלת proteasomal של חלבונים.

מנסה לאמוד השפלה proteasomal במערכת תא ללא בצמחים

היווצרות של קומפלקסי חלבוני in vivo ניתן דמיינו ידי שלמת הקרינה bimolecular. שותפי אינטראקציה הם התמזגו לחלקי משלימים של תגי ניאון והביעו transiently בי טבק, וכתוצאה מכך אות ניאון מחדש על סמיכות של שני חלבונים.

חלבונים אינטראקציות דמיינו ידי bimolecular הקרינה complementation בProtoplasts הטבק ועלים

הקמנו שיטה לטיהור של חלבונים אינטראקציה coregulatory באמצעות מערכת LC-MS / MS.

חלבון הכנת שיטה לזיהוי התפוקה הגבוהה של חלבוני אינטראקציה עם גורם-שותף גרעיני באמצעות LC-MS / MS ניתוח

כאן, אנו מציגים פרוטוקול האינטראקציה ללכוד להחיל על Arabopopsis thaliana עלה mesophyll protoplasts. שיטה זו מסתמכת באופן קריטי על vivo UV crosslinking ומאפשר בידוד וזיהוי של חלבונים mRNA מחייב הצמח מסביבה פיזיולוגית.

MRNA Interactome ללכוד מן Protoplasts הצמח

חוקרים רבים, שינויים post-translational אנדוגני על חלבון המטרה יכול להיות מאוד מאתגר. טכניקות המתוארים כאן לנצל את פירוק ממוטבת מאגר ומסנן מערכת שפותחה עם ספציפי PTM פילוח, מטריצות זיקה לזהות את השינויים זרחון acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3 וטירוזין עבור מטרה חלבון באמצעות מערכת יחיד, יעיל.

ניצול מערכת העשרה Immunoprecipitation מקיף כדי לזהות פרופיל אנדוגני שינוי Post-translational של חלבונים היעד

אנו כאן מציגים פרוטוקול מוכחת ונבדק ולטיהור כלורופלסט מתחמי ייבוא חלבון (TOC-טיק מרוכב) בעזרת הברז-התג. פרוטוקול זיקה-בידוד בשלב אחד פוטנציאלי ניתן להחיל על כל חלבון, ניתן להשתמש כדי לזהות אינטראקציה עם שותפים חדשים באמצעות ספקטרומטר מסה.

זיקה טיהור של מתחמי חלבון Translocon כלורופלסט בעזרת התג ברז

זרימת עבודה זו מתארת את ביצועי הזמן והעשרת העלויות היעילות של שינויים מרובים בחלבון שלאחר ההעברה (לפטין) בו זמנית עבור ניתוח פרוטמית גלובלי כמותי. הפרוטוקול מנצל את העשרה ברמת הפפטיד PTM עם נוגדנים מרובה מצוחים, ואחריו נתונים עצמאיים רכישה המסה ניתוח ספקטרומטר מאסה כדי לקבל תובנות ביולוגיות לתוך הוצלב PTM.

העשרת אהדה בו של שני שינויים שלאחר ההעברה לקוונפיקציה ולוקליזציה לאתר

כאן, אנו מציגים פרוטוקול שלב אחר שלב לביצוע ניסוי סימון קרבה (PL) במלפפון (Cucumis sativus L.) באמצעות חלבון AT4G18020 (APRR2)-AirID כמודל. השיטה מתארת בניית וקטור, טרנספורמציה של מבנה באמצעות חדירת אגרו-אין, חדירת ביוטין, מיצוי חלבונים וטיהור חלבונים המסומנים בביוטין באמצעות טכניקת טיהור זיקה.

תיוג קרבה מבוסס AirID לאינטראקציה חלבון-חלבון בצמחים

למד לזהות שינויים לאחר תרגום בקומפלקסי חלבוני צמח באמצעות ביטוי זמני בצמחים וספקטרומטריית מסה. שיטה זו מאפשרת לחקור אינטראקציות חלבוניות ותפקוד ביולוגי.

זיהוי לאחר translational השינויים של קומפלקסי חלבוני צמח

גלה סרטונים נוספים