תא ההדמיה ממברנה פגיעה ותהליכי subcellular המעורבים בתיקון

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבחון את השפעת הטיפולים הרצויים על תיקון תאים פגועים ולחקור את התהליכים התת-תאיים המסייעים בתיקון תאים פגועים. זה מושג על ידי פגיעה בתאים בנוכחות צבעים פלואורסצנטיים שאינם יכולים לחצות ממברנות תאים שלמות כדי להעריך את הקינטיקה והיכולת של תאים פגועים למנוע כניסה של צבעים אלה. כצעד שני, אנו עוקבים אחר הופעתם של חלבונים תוך-תאיים בקרום התא הפגוע, המזהה את יכולתו של תא מעניין להשתתף בתיקון על ידי היתוך לקרום התא הפגוע.

לאחר מכן, אנו עוקבים אחר היתוך של תאים מעניינים עם קרום התא הפגוע על מנת לנטר את הקינטיקה של הפציעה. מתקבלות תוצאות איחוי מופעל של תא זה המראות שתיקון של פגיעה בקרום התא קשור לאקסוציטוזיס ליזוזומלי המבוסס על הופעה מוגברת של חלבון ממברנה הקשור לליזוזום, אחד על פני התא הפגוע והדמיה חיה של הפרשת תוכן ליזוזומלי על ידי תאים פגועים. שיטות אלה יכולות לעזור לענות על שאלות חשובות בפגיעה ותיקון תאים.

לדוגמה, ניתן להשתמש בהם כדי לקבוע אילו חלבונים ותאים תאיים מגיבים לפגיעות מוקדיות בקרום התא ולאחר מכן להעריך את הקינטיקה של התגובה שלהם. מי שידגים את ההליך יהיו Aurelia D 4 ו-hamma stra שניים מעמיתי הפוסט-דוקטורט מהמעבדה שלי. לסמן בנפרד את התאים הפגועים שמחלימים ואלה שלא מצליחים להחלים.

זרע את התאים על החלקות כיסוי סטריליות עבור שלושת תנאי הניסוי. תרבו את התאים עד שהם מגיעים למפגש של יותר מ-50%, ואז שטפו את C אחת ו-C פעמיים פעמיים עם CIM ב-37 מעלות צלזיוס. שטפו את C3 עם PBS ב-37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן העבירו את החלקות הכיסוי על טבעות O מסיליקון.טבעות. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת פיצי דקסטרן חמה מראש במאגר מתאים. פצע את קרום הפלזמה ב-C one ו-C3 על ידי הוספת 40 מיליגרם של חרוזי זכוכית מעל החלקת הכיסוי בטמפרטורת החדר והטיה ידנית של המכסה.

מחליק קדימה ואחורה שש עד שמונה פעמים בזווית של 30 מעלות לפציעה קלה. ודא שחרוזי הזכוכית מפוזרים בצורה אחידה, ובכך למזער פציעות חוזרות כדי לשפר את שחזור הפציעה בין הדגימות. בצע בו זמנית את פגיעת חרוזי הזכוכית של הדגימות השונות להשוואה, הימנע מגלגול נוסף של חרוזים.

העבירו את כל פתקי הכיסוי לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ב-CO2 הסביבה ואפשרו לתיקון להמשיך במשך חמש דקות מבלי לתת לחרוזים להתגלגל. הסר את חרוזי הזכוכית והדקסטרן הפיטזי על ידי כביסה עם מאגר או PBS. כעת הנח את החלקות הכיסוי בחזרה על טבעת ה- O והוסף 100 מיקרוליטר ליזין חם מראש.

תמיסת דקסטרן טריסי הניתנת לתיקון דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות ב-CO2 הסביבה. שטפו את הכיסוי מחליק פעמיים עם CIM חם מראש וקבעו עם 4% PFA למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לאחר שתי כביסות PBS. דגירה במשך שתי דקות בצבע הרש ולאחר שתי שטיפות PBS הרכיבו את הדגימה על שקופית באמצעות אמצעי הרכבה.

לאחר מכן, דמו את התאים באמצעות מיקרוסקופ אפי פלואורסצנטי מדגימת C שתיים. קבע את עוצמת הצביעה באדום וירוק ברקע. לאחר מכן השתמש בערך זה כדי לסף את הערוצים האדומים והירוקים עבור כל הדגימות.

ניקוד המספר הכולל של תאים ירוקים. כמו כן, ניקוד תאים אדומים או אדומים וירוקים בדגימות C one ו-C3. כעת ספרו למעלה מ-100 תאים פצועים ירוקים עבור כל מצב והביעו את חלק התאים שלא הצליחו לתקן כאחוז מכלל התאים שנפגעו.

שטפו את התאים שגדלו ליותר מ-50% מפגש עם CIM שהוזהר מראש והרכיבו את החלקת הכיסוי ב-CIM עם צבע FM. במחזיק בבמה האינקובטור העליון נשמר על 37 מעלות צלזיוס. בחר אזור בקרום התא באמצעות כוח אופטימלי המאפשר פגיעה עקבית אך לא קטלנית.

הקרין את הדגימה למשך פחות מ-10 אלפיות השנייה עם הלייזר הפועם כדי להשיג זאת. להחליש את עוצמת הלייזר באמצעות התוכנה ל-40 עד 50% מעוצמת השיא על מנת לנטר, לתקן, לרכוש תמונות כל 2 עד 10 שניות ב-epi, fluorescence ו-brightfield החל מלפני הפציעה וממשיך במשך שלוש עד חמש דקות לאחר הפציעה. כדי לכמת את הקינטיקה של התיקון, מדוד את הקרינה של צבע FM הסלולרי.

חשב את השינוי בעוצמה במהלך ההדמיה. ממוצע הנתונים עבור למעלה מ- 10 תאים בכל תנאי והתווה כערך ממוצע או כערך תאים בודדים. שטפו את החלקות הכיסוי של C one ו-C שתיים.

הכנות לתרבית עם CIM ב-37 מעלות צלזיוס ושטיפה C3 עם PBS ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן העבירו את הדגימות על טבעות O מסיליקון. הוסף 100 מיקרוליטר דקסטרן טריסי ליזין חם מראש.

לפגוע בקרום הפלזמה ב-C one ו-C3 כפי שהוצג קודם לכן. ואז נמנע מגלגול נוסף של חרוזים. העבירו את כל פתקי הכיסוי לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ב-CO2 הסביבה ואפשרו לתיקון להמשיך במשך חמש דקות.

כעת כדי להסיר את חרוזי הזכוכית ושטיפה של טריקסי דקסטרן, הכיסוי מחליק במדיום גידול קר, מה שמבטיח שלא יתגלגל חרוזי הזכוכית על התאים. שטפו את החלקות הכיסוי פעמיים עם מצע גידול קר והעבירו לטבעות ה-O ל-C one ו-C3. הוסף 100 מיקרוליטר של מנורת חולדה נגד ארה"ב נוגדן אחד במצע גידול שלם קר והוסף את מצע הגידול השלם הקר ל-C 2 כדי לאפשר קשירת נוגדנים. החלקות כיסוי הדגירה למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס לאחר שלוש כביסות עם CIM קר.

תקן את כל פתקי הכיסוי עם 4% PFA למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן יש לשטוף שלוש פעמים עם CIM. לאחר מכן, דגרו את כל החלקות הכיסוי ב-100 מיקרוליטר תמיסת חסימה למשך 15 דקות, ואחריה 100 מיקרוליטר ofor, 4 נוגדנים נגד חולדות למשך 15 דקות.

שטפו פעמיים עם PBS ודגרו בכתם שלה במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר לאחר שתי כביסות PBS. הרכיבו את הדגימות על שקופית, ולאחר מכן צלמו את הדגימות באמצעות מיקרוסקופ אפי פלואורסצנטי באמצעות תמונות של שני תאי C. קבעו את צביעת הרקע הלא ספציפית בערוצים האדומים והירוקים.

השתמש בערכי צביעת רקע אלה כדי לסף את הערוצים האדומים והירוקים עבור כל הדגימות. השתמש בלמעלה מ-100 התאים המסומנים באדום מ-C one ו-C3 כדי למדוד את עוצמת הצביעה של lamp one בתאים פגועים. בניסוי מוצלח, תאים מכתים מנורה אחת מ-C3 יהיו נמוכים משמעותית מאשר בתאים מ-C אחד לתיוג ליזוזומים בצבע פלואורסצנטי דוגרים על התאים הגדלים למפגש של 50% במצעי גידול המכילים דקסטרן פיצי.

אפשר לדקסטרן להיות אנדוציטוז במשך שעתיים בחממת תרבית התאים. שטפו את התאים במצע גידול חם מראש ודגרו בו במשך שעתיים באינקובטור CO2 כדי לאפשר לכל האנדוציטוז דקסטרן להצטבר בליזוזום לפני ההדמיה. שטפו את החלקת הכיסוי ב-Prewarm CIM והרכיבו ב-CIM על מחזיק החלקה לכיסוי על הבמה האינקובטור העליון ב-37 מעלות צלזיוס.

בחר עבור תאים שאין להם ליזוזומים צפופים של פיצי דקסטרן להדמיה. התנועה והאקסוציטוזיס של ליזוזומים בודדים. רכוש תמונות שדה רחב לתנועת ליזוזום ברחבי התא.

לסירוגין לרכוש תמונות דשא לתנועה על פני התא ולניטור האקסוציטוזיס שלהם. לפגוע בקרום התא על ידי הקרנה כפי שהוצג קודם לכן כדי לנטר את תגובת הליזוזום לתאי תמונה של פגיעה בתא בארבע עד שש פריימים לשנייה למשך שתי דקות לפחות או יותר, תלוי בדינמיקה של אקסוציטוזיס בתאים המעניינים. בבדיקה בתפזורת זו, כל התאים הפגועים מסומנים ואלה שלא הצליחו לתקן מזוהים בעוד התאים הלא פגועים נשארים ללא תווית.

התאים שנפגעו מחרוזי זכוכית בנוכחות דקסטרן פיצי מסומנים בירוק כאשר נותנים לתאים לתקן בנוכחות סידן. רוב התאים הפגועים מצליחים לתקן ואינם מסומנים על ידי דקסטרן טריסי כאשר נותנים לתאים לתקן אותם. בהיעדר סידן, רוב התאים הפגועים מסומנים גם באדום על ידי דקסטרן טריסי.

ניסוי זה מעריך את הקינטיקה של תיקון קרום התא על ידי ניטור כניסת צבע FM לתא. כאשר מודגרים ב- FM, תאים שלמים מראים מעט או ללא צביעה תוך-תאית. בעקבות פגיעה מקומית בלייזר של קרום התא, FM D מתחיל להיכנס לתא ולקשור ממברנות אנדו, מה שגורם לעלייה פתאומית בפלואורסצנטיות צבע FM מכיוון שיכולת קרום התא לתקן לאחר פגיעה בלייזר תלויה בסידן.

תא שנפגע בנוכחות סידן מסוגל לתקן, מה שגורם לכניסת צבע FM להפסיק תוך דקה לאחר הפציעה. להיפך, תא שמותר לו לתקן בהיעדר סידן לא מצליח לתקן, מה שמביא לכניסה מתמשכת של צבע ומכאן לעלייה מתמשכת בפלואורסצנטיות FM d גם ארבע דקות לאחר הפציעה. לפיכך, תיקון קרום התא מוביל למישור של צביעת צבע FM.

בעוד שהיעדר תיקון קרום התא גורם לכניסת צבע מתמשכת שאינה מצליחה להתייצב. ניתן להשתמש בגישת הפגיעה בחרוזי זכוכית בתפזורת כדי לנטר טרנסלוקציה של פני התא של שלפוחיות וחלבונים בתגובה לפציעה. כאן, התאים נפגעים בנוכחות דקסטרן טריסי.

לכן, בעוד שהתאים הלא פגועים אינם מסומנים באדום, כל התאים הפגועים מסומנים באדום. שים לב שתאים לא פגועים שאינם מטופלים בנוגדנים ראשוניים מראים תיוג ברמת הרקע עבור מנורת משטח התא הראשונה. עם זאת, כאשר תאים נפגעים ומאפשרים להם להחלים בנוכחות סידן, הליזוזומים עוברים אקסוציטוזיס וכך יש רמה מוגברת של צביעת מנורה אחת על פני התאים הפגועים.

עלייה זו במנורת פני התא תיוג אחד נמוך בהרבה בתאים המורשים להחלים בהיעדר סידן. לפיכך, הן לכמת את מספר התאים עם מנורת משטח תא גבוהה לצביעה אחת, כמו גם למדוד את רמת מנורת פני התא. אחד. צביעה על תאים פגועים בודדים מספקת מדדים ליכולתו של התא לעבור אקסוציטוזיס ליזוזומלי המופעל על ידי פגיעה.

ניסוי זה עוקב ישירות אחר הקינטיקה, האופי והמיקום של היתוך הליזוזום הבודד. בתגובה לפגיעה בקרום התא, התאים נפגעים על ידי הלייזר הפועם וליזוזומים על פני התא מצולמים על ידי הדמיית דשא, המאפשרת ניטור פגיעה המופעלת על ידי אקסוציטוזיס של ליזוזומים בתאים בודדים. איור זה מציג תא המוצג על ידי הדמיית ניגודיות פאזה בפאנל השמאלי ועל ידי מיקרוסקופ דשא בפאנל האמצעי.

הפאנל הימני מציג את תמונת הדשא של אותו תא 105 שניות לאחר הפציעה. כאן, פציעה גרמה לגיוס של ליזוזום לקרום התא, ואחריו מוצגת אקסוציטוזיס. ליזוזום זה אינו נראה בתמונת הדשא לפני הפציעה, אך לאחר הפציעה, הליזוזום מגיע לקרום התא והופך לניתן לזיהוי.

ככל שהשלפוחית מתקרבת לקרום התא, היא נרגשת טוב יותר על ידי תאורת הדשא וגורמת לפלואורסצנציה של גדיל ה-dex הליזוזומלי להגיע לערך מקסימלי. כאשר מזיגת ההיתוך נפתחת, הדבר גורם לנטרול ה-pH הליזוזומלי ובכך לכיבוי הקרינה של גדיל ה-DExT הפיצי. לאחר מכן, גדיל ה-DExT מוזרם מהשלפוחית אל החלק החיצוני של התא, מה שגורם לפלואורסצנציה של ZI להתפשט לרוחב וניתן למדוד את הקרינה של השלפוחית כדי להפחית בהדרגה את התגובות המופעלות על ידי פציעות שונות של הליזוזומים.

אחרי הצפייה בסרטון הזה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לנטר את היכולת של תאים לתקן מפגיעות מוקד גדולות, ולנטר תאים תת-תאיים וחלבונים שמגיבים לתהליך התיקון ומסייעים בו. ניתן לבצע ניסוי נוסף באמצעות תיוג חיוני של תגים שונים, תאים או חלבון של על מנת לעקוב אחר התגובה לפציעה והמעורבות בתיקון תאי IND.