Name: תא ההדמיה ממברנה פגיעה ותהליכי subcellular המעורבים בתיקון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-24T20:45:00.000+00:00
Duration: 16 min 44 s
Description: חקור מנגנוני תיקון תאים פגועים באמצעות צביעה פלואורסצנטית ודימות חי. למד כיצת ליזוזומים משתתפים בתהליכי החלמה של ממברנות תאיות פגועות ואת קינטיקת התגובה לפציעה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות המענקים AR055686 וAR060836 ומלגה הבתר לספירה על ידי צרפתים ניוון שרירים אגודה (AFM). מתקן ההדמיה הסלולרית מנוצל במחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקי HD040677.

1. תיקון קרום תא הדמיה באמצעות גורף (חרוז זכוכית) פציעה פרוטוקול זה מאפשר בנפרד סימון התאים נפצעו ואלה שלא מצליחים לרפא. כימות אוכלוסיות של תאים אלה מחייב שימוש בשלושה תנאים: 1. מבחן (C1) - תאים רשאים לתקן בנוכחות של Ca 2 +, 2. בקרת 1 (אין C2 פציעה) - תאים מודגרת בנוכחות של Ca 2 +, אך לא נפגעו, ו 3. בקרה 2 (אין C3 תיקון) - תאים רשאים לתקן בהעדר Ca 2 +. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים ל&gt; מפגש 50% בשלושה coverslips סטרילית ולשטוף C1 ו-C2 פעמיים עם CIM על 37 מעלות צלזיוס וC3 עם PBS על 37 מעלות צלזיוס וcoverslips העברה על O-טבעות סיליקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של פתרון prewarmed FITC dextran בCIM על C1 ו-C2 או ב-PBS על C3 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפגוע בקרום פלזמה על C1 ו-C3 על ידי בעדינות מגלגל 40 חרוזי זכוכית מ&quot;ג על coverslip בטמפרטורת חדר על ידי coverslips הטיה באופן ידני חזרה ושוב 6-8 פעמים בזווית של ° 30. הערה: לפציעה קלה, להבטיח את חרוזי הזכוכית מפוזרים באופן אחיד, ובכך למזער את הפציעות חוזרות. כדי לשפר את שחזור של פגיעה בין דגימות, בו זמנית לבצע את פציעת חרוז זכוכית של דגימות השונות כדי להשוות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הימנעות גלגול נוסף של חרוזים, להעביר את כל coverslips לחממת 37 ° C ב-CO 2 הסביבה ולאפשר תיקון כדי להמשיך למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלי לתת חרוזים להתגלגל, להסיר את חרוזי הזכוכית וdextran FITC על ידי שטיפה עם CIM (C1 ו-C2) או PBS (C3) ב37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום coverslips חזרה על טבעת O ולהוסיף לפתרון prewarmed יזין ניתן לתקן dextran TRITC בCIM 100 μl על C1 ו-C2 או ב-PBS על C3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות בסביבת CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף coverslips פעמיים עם CIM prewarmed ולתקן עם PFA 4% ל10 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמיים עם PBS ו דגירה למשך 2 דקות ב RT בצבע Hoechst. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף samples פעמיים עם PBS, הר בשקופית באמצעות תקשורת הרכבה ותאי תמונה באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בתאים מC2 כדי לקבוע את עוצמת כתמים האדומה וירוקה ברקע ולהשתמש בערך הזה לסף הערוצים האדומים וירוקים לכל הדגימות (C1-C3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציון מספר כולל של תאים ש) ירוק (נפצע ומתוקן) ו ב) אדומים או שניהם אדומים וירוק (נפצע, אך לא הצליחו לתקן) בדגימות C1 ו-C3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי ספירה&gt; 100 הירוקים לכל מצב ולהביע את החלק היחסי של תאים שלא הצליחו לתקן כאחוז מכל נפגעו התאים (הירוק ואדום). </li></ol> 2. הדמיה חיה של קינטיקה של תיקון קרום תא בעקבות פגיעה הלייזר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים עם CIM prewarmed ולאחר מכן לשים את coverslip בCIM עם צבע FM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום coverslip בבעל בחממה העליונה שלב נשמרה על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אזור 1-2 מ&quot;מ 2 של קרום התא, ולהקרין ל&lt;; 10 אלפיות שני עם לייזר הפעם. להחליש את כוח הלייזר דרך התוכנה כדי 40-50% מהחשמל בשעתי השיא. כוח אופטימלי מאפשר פגיעה עקבית, אך לא קטלנית וזה צריך להיקבע על ידי ניסוי וטעייה עבור קו מכשיר והתא בודדים כל אחד בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לפקח על תיקון, תמונה כל 10 שניות בepifluorescence וbrightfield, החל לפני פציעה ולהמשיך ל3-5 דקות בעקבות פציעה. הערה: אין שליטת תיקון, חזור על שלבים 2.1-2.4 עם התאים נפצעו בPBS המכילים צבע FM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכמת את קינטיקה של תיקון, למדוד הקרינה לצבוע FM הסלולרי, ותתאר את השינוי בעוצמת (ΔF/F0) במהלך ההדמיה. נתונים אלו צריכים להיות בממוצע במשך 10 תאים בכל תנאי וזממו כממוצע או הערך של התא בודד, לפי צורך. </li></ol> 3. גורף הדמיה (חרוז זכוכית) פגיעה הנגרם על lysosomal exocytosis דוגמאות כוללות תאים הבאים גדלו&gt; 50%נקודת המפגש: 1. מבחן (C1) - תאים אפשרו לתקן בנוכחות של Ca 2 +, 2. בקרת 1 (C2; אין פגיעה) - תאים לא נפגעו ולא הודגרו עם נוגדן ראשוני, ו 3. בקרה 2 (C3; לא תיקון) - תאים אפשרו לתקן בהעדר Ca 2 +. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף coverslips C1 ו-C2 פעמיים עם CIM על 37 מעלות צלזיוס וC3 עם PBS על 37 מעלות צלזיוס ולהעביר אותם על O-טבעות סיליקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של דקסטראן prewarmed יזין ניתן לתקן TRITC בCIM על C1 ו-C2 ובPBS על C3 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפגוע בקרום פלזמה על C1 ו-C3 כמו בשלב 1.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הימנעות גלגול נוסף של חרוזים, להעביר את כל coverslips לחממת 37 ° C ב-CO 2 הסביבה ולאפשר תיקון כדי להמשיך למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חרוזי הזכוכית וdextran TRITC ידי שטיפת coverslips במדיום גידול קר, שוב הבטחה אין מתגלגל של חרוזי זכוכית על התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את coverslips פעמיים עם מדיום גידול קר ולהעביר לטבעות האטימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לC1 ו-C3, להוסיף נוגדן LAMP1 עכברוש אנטי עכבר 100 μl בתקשורת צמיחה מלאה קרה ולהוסיף את תקשורת הצמיחה הקרה, המלאה לC2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאפשר לנוגדנים מחייבים coverslips דגירה למשך 30 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את coverslips שלוש פעמים עם CIM הקר ולתקן את כל coverslips עם PFA 4% ל10 דקות ב RT ולאחר מכן לשטוף 3x עם CIM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כל coverslips בחסימת פתרון ל15 דקות ב RT 100 μl </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כל coverslips ב100 μl אלקסה פלואוריד 488 נוגדן אנטי עכברוש ל15 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמיים עם PBS ו דגירה למשך 2 דקות ב RT בHoechst. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים פעמיים עם PBS, הר בשקופית באמצעות תקשורת ותדמית הרכבה באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתמונות של תאי C2, לקבוע את מכתים ספציפי רקע באדום (dextran TRITC) וירוק ערוצים (נוגדן אלקסה פלואוריד 488) ולהשתמש בערכי מכתים רקע אלה לסף הערוצים האדומים וירוקים לכל הדגימות (C1-C3). &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ב&gt; 100 התאים האדומים שכותרתו מC1 ו-C3 כדי למדוד את עוצמת כתמי LAMP1 (ירוק) בתאים פגועים. לניסוי מוצלח מכתים LAMP1 בתאים מC3 יהיה נמוך יותר באופן משמעותי מאשר בתאים מC1. </li></ol> 4. הדמיה חיה של קרום תא פגיעה מופעלת על סחר subcellular <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Fluorescently לתייג תא של עניין על ידי transfecting כתב מתאים (למשל CD63-GFP לlysosomes 8) או על ידי שימוש בצבעי ניאון 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לlysosomes תיוג עם צבע פלואורסצנטי, דגירה תאים המבוגרים כדי מפגש 50% בתקשורת צמיחה המכילה FITC-dextran </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר dextran להיות endocytosed עבור שעה 2 (או יותר בהתאם לצורך תיוג מספיק endosomal עם dextran ידי שורת התאים של עניין) בחממת CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים עם תקשורת צמיחת prewarmed דגירה בזה במשך שעה 2 בחממה CO 2 כדי לאפשר לכלendocytosed dextran להצטבר בליזוזום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ההדמיה, יש לשטוף את coverslip בCIM prewarmed ולעלות בבעל coverslip על החממה העליונה שלב ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע widefield (לתנועה ברחבי התא) או TIRF (תנועה על פני התא וexocytosis) הדמיה - תאים שאין להם צפופים dextran FITC lysosomes שכותרתו הם אידיאליים עבור ההדמיה התנועה וexocytosis של lysosomes הבודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישור לייזרי TIRF למיקרוסקופ הדמיה: השימוש 60x או אובייקטיבי 100X עם&gt; 1.45 NA. להגדיר את הזווית לאירוע קרן לייזר TIRF שימוש בגישה של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפצוע את קרום התא על ידי הקרנת אזור קטן (1-2 מ&quot;מ 2) ל&lt; 100 אלפית שניים, עם לייזר הפעם בהנחתת 40-50%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לפקח על התגובה של הליזוזום לתא פציעה, תאי תמונה ב4-6 מסגרות / השני לפחות 2 דקות או יותר בהתאם לדינמיקה של exocytosis בתאים של עניין. </li></ol>

<ol><li>Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-regulated+exocytosis+is+required+for+cell+membrane+resealing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing.</a> Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).</li>
<li>Togo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+plasma+membrane+stimulates+rearrangement+of+microtubules+and+lipid+traffic+toward+the+wound+site%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site.</a> Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).</li>
<li>Miyake, K., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+accumulation+and+exocytosis+at+sites+of+plasma+membrane+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption.</a> Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).</li>
<li>Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+repair+is+mediated+by+Ca2%2B-regulated+exocytosis+of+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes.</a> Cell. 106, 157-169 (2001).</li>
<li>Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Potez, S., Draeger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blebbing+confers+resistance+against+cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Blebbing confers resistance against cell lysis.</a> Death Differ. 18, 80-89 Forthcoming.</li>
<li>Bansal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423, 168-172 (2003).</li>
<li>Abreu-Blanco, M. T., Verboon, J. M., Parkhurst, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wound+repair+in+Drosophila+occurs+through+three+distinct+phases+of+membrane+and+cytoskeletal+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell wound repair in Drosophila occurs through three distinct phases of membrane and cytoskeletal remodeling.</a> Cell Biol. 193, 455-464 (2011).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Chakrabarti, S., Andrews, N. W., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptotagmin+VII+restricts+fusion+pore+expansion+during+lysosomal+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Synaptotagmin VII restricts fusion pore expansion during lysosomal exocytosis.</a> PLoS Biol. 2, 1224-1232 (2004).</li>
<li>McNeil, P. L., Clarke, M. F., Miyake, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wound+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell wound assays.</a> Protoc. Cell Biol. Chapter 12, (2001).</li>
<li>McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+introduction+of+molecules+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct introduction of molecules into cells.</a> Protoc. Cell Biol. Chapter 20, (2001).</li>
<li>Knight, M. M., Roberts, S. R., Lee, D. A., Bader, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+using+confocal+microscopy+induces+intracellular+calcium+transients+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death.</a> J. Physiol. Cell Physiol. 284, C1083-C1089 (2003).</li>
<li>McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endomembrane+requirement+for+cell+surface+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The endomembrane requirement for cell surface repair.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).</li>
<li>Benink, H. A., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentric+zones+of+active+RhoA+and+Cdc42+around+single+cell+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds.</a> Cell Biol. 168, 429-439 (2005).</li>
<li>Schmoranzer, J., Goulian, M., Axelrod, D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+constitutive+exocytosis+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging constitutive exocytosis with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Cell Biol. 149, 23-32 (2000).</li>
<li>Steyer, J. A., Horstmann, H., Transport Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((docking+and+exocytosis+of+single+secretory+granules+in+live+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells.</a> 388, 474-478 (1997).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proximal+lysosomes+are+the+major+vesicles+responsible+for+calcium-dependent+exocytosis+in+nonsecretory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells.</a> Cell Biol. 159, 625-635 (2002).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Simon, S. M. Ch. 4.12. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJaiswal%2C+JK+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22">Current Protocols in Cell Biology</a>. , Wiley and Sons Inc. 4.12.1-4.12.15 (2003).</li>
<li>Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+%28TIRF%29+microscopy+illuminator+for+improved+imaging+of+cell+surface+events%5BTitle%5D)+AND+%22Protoc.+Cytom%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events.</a> Protoc. Cytom. Chapter 12, (2012).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+single+events+at+the+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging single events at the cell membrane.</a> Chem. Biol. 3, 92-98 (2007).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

פציעת קרום תא in vivo מתרחשת עקב מגוון של גורמי לחץ פיסיולוגיים וכמה גישות ניסיוניות פותחו לחקות אלה. אלה כוללים פצעו קרום תא של תאים חסיד על ידי גירוד אותם מהצלחת או על ידי passaging דרך 9,10 מזרק שעמם צר. בעקבות פציעות כגון התאים לרפא בהשעיה ולא פעל בהתאם למטריצה ​​תאית כפי שהם עושים בדרך כלל ברקמות. כגון שימוש ברעלים נקבוביות ויוצר, ואילו אחרים כימיים לשנות קרום תא על ידי שומני חילוץ כגון כולסטרול, ולכן לא מחקה בפגיעות מכאניות vivo 5.<...

קרום תא שומר על שלמותם של תאים על ידי מתן חיץ בין התא לבין סביבת החוץ תאית. גירוי כימי, חשמלי או מכאני שעולה על הסף הפיזיולוגי הנורמלי, כמו גם נוכחותם של פולשים גורמי מחלה יכול כל תוצאה בפגיעה בקרום התא ולגרום לתגובה תאית לאחר לתקן פגיעה זו. כדי לשרוד פציעות אלה לממברנת התא, תאים בעלי מנגנון יעיל לתיקון. מנגנון זה הוא סידן תלוי וכרוך בסחר תאית של חלבונים כגון annexins וMG53 בין יתר, כמו גם תאי subcellular כגון endosomes, lysosomes, שלפוחית ​​Golgi נגזרת ומיטוכונדריה לקרום התא נפגע 1-7. עם זאת, את פרטיו של הרצף של אירועים מולקולריים וsubcellular המעורבים בתיקון קרום תא פגוע נשאר הבינו היטב. התגובה לתיקון של התא יכולה להיות מופרדת לתוך אוזןly ותגובות מאוחרות. תגובות הראשונות, אשר מתרחשות תוך שניות לזמן בקנה מידה דקות, הן חשובות מאוד בקביעת מהותן של תגובות מאוחרות שהובילו לתיקון תאים מוצלח או מוות של תאים. מבחני נקודת סיום מבוססים על אנליזה ביוכימית והתאית בתפזורת סייעו להקים את מעורבותם של תהליכים מולקולריים ותאיים בתיקון. אבל, בשל ההטרוגניות והמהירות של תגובת תיקון הסלולרי, מבחני נקודת סיום אינם מספקים פרטים הקינטית ומרחבים של הרצף של אירועים שהובילו לתיקון. גישות המאפשרות לפציעה מבוקרת של קרום תא ומאפשרים ניטור ותיקון קרום תא ותגובות subcellular קשורים במרחב ובזמן ברזולוציה גבוהה מתאימות בצורה אידיאלית ללימודים כאלה. הנה, גישות כאלה כבר הוצגו. שניים מפרוטוקולי תיאור גישות לפקח קינטיקה בזמן אמת של תיקון קרום תא ותגובות subcellular הקשורים בתהליך התיקון בתאים חיים הבאות inj הלייזרלסר אורי. כהשלמה למבחנים מבוססי הדמיה תא החי אלה, מבחני נקודת סיום יש גם תוארו המספקים מדד המבוסס אוכלוסייה לתיקון ניטור של תאים בודדים ותגובות subcellular הקשורות. כדי להדגים השירות שלהם גישות אלה היו בשימוש כדי לפקח על סחר וexocytosis של lysosomes בתגובה לפציעת קרום תא.

<table><tbody><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H1387</td><td>משמש להכנת CIM (HBSS/10 מ"מ Hepes/2 מ"מ Ca2+ pH 7.4)</td></tr> <tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP410</td><td>משמש להכנת CIM (HBSS/10 מ"מ Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)</td></tr><tr><td>FITC דקסטרן (ניתן לתיקון ליזין)</td><td>Invitrogen</td><td>D1820</td><td>2 מ"ג/מ"ל בחרוזי זכוכית CIM או PBS</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>TRITC דקסטרן (ליזין ניתן לתיקון)</td><td>Invitrogen</td><td>D1818</td><td>2 מ"ג/מ"ל ב-CIM או PBS</td></tr><tr><td>PFA 16%</td> <td>EMS</td><td>15710</td><td>4% ב-PBS</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>1/10 000 בצבע PBS</td></tr><tr><td>FM</td><td>Invitrogen</td><td>T3163</td><td>1 ומיקרו; g/&micro; l ב-CIM או PBS</td></tr><tr><td>FITC dextran</td><td>Sigma</td><td>FD40S</td><td>2 מ"ג/מ"ל במדיום גידול</td></tr><tr><td>LAMP1&nbsp;</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc-19992</td><td>1/300 במדיום גידול</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 עוף נגד חולדות IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A21470</td><td>1/500 בתמיסת חסימה</td></tr><tr><td>מדיה הרכבה</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher</td><td>12-545-86</td><td></td></tr><tr><td>תחתון זכוכית</td><td>תאגיד MatTek</td><td>P35G-1.0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>טבעת</td> <td>O סיליקוןBellco</td><td>1943-33315</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק כיסוי</td><td>Bellco</td><td>1943-11111</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen</td><td>A-7816</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>VWR</td><td>12001-566</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>VWR</td><td>MP1400-500H</td><td>משמש למדיום גידול: 10% FBS, 1% P/S ב-DMEM</td></tr><tr><td>פניצילין/סרפטומיצין</td><td>VWR</td><td>12001-350</td><td>משמש למדיום גידול: 10% FBS, 1% P/S ב-DMEM</td></tr><tr><td>סרום עוף</td><td>Sigma</td><td>C5405</td><td>סרום עוף 5% ב-CIM משמש לחסימת תמיסה במהלך צביעה חיסונית</td></tr><tr><td>PBS (ללא Ca2+ ו-Mg2+)</td> <td>VWR</td><td>12001-664</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי</td><td>אולימפוס אמריקה, PA</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>TIRF מאיר&nbsp;</td><td>אולימפוס אמריקה,</td><td>PA Cell^TIRF (IEC60825-1:2007)</td><td></td></tr><tr><td>מאיר אפיפלואורסצנטי</td><td>Sutter Instruments, Novato CA</td><td>Lambda DG-4 (DG-4 30)</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת CCD</td><td>פוטומטרית, טוסון, אריזונה</td><td>Evolve 512 EMCCD&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת רכישת תמונות ואנליזה</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO</td><td>Slidebook 5</td><td></td></tr><tr><td>Pulsed laser</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO</td><td>Ablate (3iL13)</td><td></td></tr><tr><td>חממה מובילה</td><td>במה Tokaihit, יפן</td><td>INUBG2ASFP-ZILCS</td><td></td></tr></tbody></table>

תא ההדמיה ממברנה פגיעה ותהליכי subcellular המעורבים בתיקון

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

היכולת של תאים נפצעו לרפא היא תהליך תאי בסיסי, אך מנגנונים תאיים ומולקולריים המעורבים בתאי ריפוי פצוע הם הבינו היטב. הנה מבחני מתוארים כדי לפקח על היכולת וקינטיקה של ריפוי של תאים בתרבית בעקבות פציעה מקומית. הפרוטוקול הראשון מתאר גישה מבוססת נקודת סיום כדי להעריך את יכולת תיקון קרום תא של מאות תאים בו זמנית. הפרוטוקול השני מתאר גישת הדמיה בזמן אמת כדי לפקח על קינטיקה של תיקון קרום תא בתאים בודדים בעקבות פציעה מקומית עם לייזר פעם. ככל שתאי ריפוי נפצע כרוך בסחר של חלבונים מסוימים ותאי subcellular לאתר של פציעה, הפרוטוקול השלישי מתאר את השימוש בגישה מבוססת נקודת סיום לעיל כדי להעריך אירוע אחד כזה סחר (exocytosis lysosomal) במאות תאים נפצעו בו זמנית והפרוטוקול האחרון מתאר את השימוש של פגיעת לייזר פעם יחד עם מיקרו TIRFעותק כדי לפקח על הדינמיקה של תאי subcellular בודדים בתאים שנפגעו ברזולוציה מרחבית ובזמן גבוה. בעוד הפרוטוקולים כאן מתארים את השימוש בגישות אלה כדי לחקור את הקשר בין תיקון קרום התא וexocytosis lysosomal בתאי שריר בתרבית, הם יכולים להיות מיושמים כאמורים לכל תא אחר חסיד תרבותי ותא subcellular של בחירה.

פרוטוקולים שתוארו כאן להדמית תא בודדת הם לפקח על היכולת וקינטיקה של תיקון קרום תא (פרוטוקולי 1 ו -2) והסחר subcellular וההיתוך של lysosomes במהלך תיקון (פרוטוקולי 3 ו -4). פרוטוקול 1 מציג assay בתפזורת המאפשר סימון כל התאים נפגעו וזיהוי תאים אלה נפגעו שלא הצליחו לתקן. התוצאות בתכנית איור 1 שבזמן שהתאים ללא כל הפגע (איור 1 א) יישארו ללא תווית, התאים שנפגעו מחרוז זכוכית בנוכחות של ...

התהליך של ריפוי תאים נפצעו כרוך בסחר של חלבונים מסוימים ותאי subcellular לאתר של פציעת קרום תא. פרוטוקול זה מתאר מבחני כדי לפקח על תהליכים אלה.

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבחון את השפעת טיפולים רצויים על תיקון תאים פגועים ולחקור את התהליכים התת-תאיים המסייעים בתיקון תאים פגועים. דבר זה מושג על ידי פגיעה בתאים בנוכחות צבעים פלואורסצנטיים שאינם יכולים לחצות ממברנות תא שלמות, כדי להעריך את הקינטיקה ואת יכולתם של תאים פגועים למנוע את כניסתם של צבעים אלו. כשלב שני, אנו עוקבים אחר הופעתם של חלבונים תוך-תאיים בממברנת התא הפגועה, מה שמאפשר לזהות את יכולתו של מדור תאי מסוים להשתתף בתיקון באמצעות התמזגות עם ממברנת התא הפגועה.בשלב הבא, אנו עוקבים אחר היתוך של תאי אב (compartments) תאיים רלוונטיים עם ממבנה התא הפגוע, וזאת כדי לנטר את קינטיקת הפגיעה. תוצאות של היתוך מונחה של תאי אב אלו מראות כי תיקון של פגיעה בממברנת התא קשור לאקסוציטוזה ליזוזומלית, בהתבסס על הגבייה המוגברת של lysosome associated membrane protein, one על פני השטח של התא הפגוע, וכן על ידי דימוי חי של הפרשת תכולה ליזוזומלית על ידי תאים פגועים. שיטות אלו יכולות לסייע במתן מענה לשאלות חשובות בנושאי פגיעה ותיקון של תאים.לדוגמה, ניתן להשתמש באלו כדי לקבוע אילו חלבונים ומדורים תאיים מגיבים לפגיעות מוקדיות בממברנה של התא, ולאחר מכן להעריך את קינטיקת התגובה שלהם. את הפרוצדורה ידגימו Aurelia D four ו-hamma stra two, עמיתי פוסט-דוקטורט מהמעבדה שלי, אשר יסמנו בנפרד את התאים הפגועים שנרפאו ואלו שלא נרפאו.זריעה של התאים על לוחות כיסוי סטריליים עבור שלושת התנאים הניסיוניים. תרבות את התאים עד שיגיעו למעלה מ-50% confluence, ולאחר מכן שטוף את C one ואת C two פעמיים עם CIM בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. שטוף את C3 עם PBS בטמפרטורה של 37 degrees Celsius.לאחר מכן, העבירו את לביבות הכיסוי (cover slips) על טבעות O של סיליקון. הוסיפו 100 µL של תמיסת fitzy dextran מחוממת מראש בבופר מתאים. פגעו בממברנה של הפלזמה ב-C one וב-C3 על ידי הוספת 40 mg של חרוזי זכוכית מעל לביבת הכיסוי בטמפרטורת החדר והטיה ידנית של הכיסוי.מחליקים הלוך ושוב שש עד שמונה פעמים בזווית של 30 מעלות כדי לגרום לפציעה קלה. יש לוודא שפסייקי הגלס (glass beads) מפוזרים באופן אחיד, ובכך למזער פציעות חוזרות כדי לשפר את השחזוריות של הפציעה בין הדגימות. יש לבצע את הפציעה באמצעות פסייקי הגלס עבור הדגימות השונות להשוואה בו-זמנית, תוך הימנעות מגלגול נוסף של הפסייקים.העבירו את כל הזכוכיות למדגרה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius בריכוז CO2 סביבתי, והמתינו חמש דקות להשלמת התיקון מבלי לאפשר לחרוצים להתגלגל. הסירו את חרוצי הזכוכית ואת ה-fitzy dextran על ידי שטיפה עם בופר או PBS. כעת החזירו את הזכוכיות על ה-O-ring והוסיפו 100 microliters של ליזין שחומם מראש.דגומות בפתרון trissy dextran הניתן לקיבוע. דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך חמש דקות בריכוז CO2 סביבתי. שטפו את לביבות הזכוכית פעמיים ב-CIM שחומם מראש וקבעו באמצעות 4% PFA למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לאחר שתי שטיפות PBS. דגרו למשך שתי דקות בצבע hersch, ולאחר שתי שטיפות PBS, העבירו את הדגימה למשטח זכוכית באמצעות מדיום קיבוע.בשלב הבא, דמיינו את התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה אפי (epi fluorescence) מדגימת ה-C two. קבעו את עוצמת הצביעה של הרקע בערוצים האדום והירוק. לאחר מכן, השתמשו בערך זה כדי לבצע סף (threshold) לערוצים האדום והירוק בכל הדגימות.ספרו את המספר הכולל של התאים הירוקים. כמו כן, ספרו תאים שהם אדומים או גם אדומים וירוקים בדגימות C ו-C3. כעת ספרו מעל 100 תאים פגועים ירוקים עבור כל תנאי, והביעו את חלקם של התאים שנכשלו בתיקון כאחוז מכלל התאים הפגועים.שטפו את התאים שגדלו עד למעלה מ-50% Confluence באמצעות CIM שחומם מראש, והניחו את לביבת הזכוכית (cover slip) ב-CIM עם צבע FM. השתמשו במחזיק בתוך אינקובטור שולחני השומר על טמפרטורה של 37 °C. בחרו אזור בממברנת התא תוך שימוש בהספק אופטימלי המאפשר פגיעה עקבית אך לא קטלנית.כדי להשיג זאת, הקרן את הדגימה באמצעות הלייזר הפולסי למשך פחות מ-10 milliseconds. הנמך את הספק הלייזר דרך התוכנה ל-40% עד 50% מהספק השיא כדי לנטר, לתקן ולרכוש תמונות כל שתיים עד 10 שניות ב-epi, פלואורסצנציה ושדה בהיר, החל מהזמן שקדם לפגיעה והמשך במשך שלוש עד חמש דקות לאחר הפגיעה. כדי לכמת את קינטיקת התיקון, מדוד את הפלואורסצנציה של צבע FM התאי.חשבו את השינוי בעוצמה במהלך הדמיה. בצעו ממוצע של הנתונים עבור למעלה מ-10 תאים בכל תנאי, והציגו אותם כערכי ממוצע או כערכים של תאים בודדים. שטפו את לביבות הזכוכית של C one ו-C two.הכינו תרביות עם CIM ב-37 degrees Celsius ושטפו את C3 עם PBS ב-37 degrees Celsius. לאחר מכן, העבירו את הדגימות לטבעות סיליקון (O-rings). הוסיפו 100 µL של trissy dextran מקבע ליזין שחומם מראש.פצעו את ממברנת הפלזמה ב-C1 וב-C3 כפי שהודגם קודם לכן. לאחר מכן, תוך מניעת גלגול נוסף של החרוצים, העבירו את כל לביבות הזכוכית (cover slips) לדגרה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius בריכוז CO2 סביבתי, והמתינו חמש דקות להשלמת תהליך התיקון.כעת, כדי להסיר את חרוזי הזכוכית ואת ה-Trixie dextran, שטפו את לביבות הכיסוי במצע גידול קר, תוך כדי וידוא שחרוזי הזכוכית אינם מתגלגלים על התאים. שטפו את לביבות הכיסוי פעמיים במצע גידול קר והעבירו אותן לטבעות ה-O-rings של C1 ו-C3. הוסיפו 100 µl של נוגדן rat anti-US lamp one במצע גידול מלא קר, והוסיפו את מצע הגידול המלא והקר ל-C2 כדי לאפשר קישור של הנוגדן. דגרו את לביבות הכיסוי למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 °C לאחר שלושה שטיפות עם CIM קר.קבע את כל הזכוכיות כיסוי ב-4% PFA למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטוף שלוש פעמים ב-CIM. בשלב הבא, דגרי את כל הזכוכיות כיסוי ב-100 microliters של תמיסת חסימה למשך 15 דקות, ולאחר מכן ב-100 microliters של נוגדן 4 88 anti rat למשך 15 דקות.שטוף פעמיים ב-PBS והדגש בצביעת her למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר לאחר שתי שטיפות ב-PBS. רכיב את הדגימות על סלייד, ולאחר מכן דמיין אותן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציית epi תוך שימוש בתמונות של תאי C two. קבע את רמת הצביעה הבלתי ספציפית של הרקע בערוצים האדום והירוק.השתמש בערכי צביעת הרקע הללו כדי לקבוע סף (threshold) לערוצים האדום והירוק עבור כל הדגימות. השתמש ביותר מ-100 תאים המסומנים באדום מ-C one ומ-C3 כדי למדוד את עוצמת הצביעה של lamp one בתאים פגועים. בניסוי מוצלח, הצביעה של lamp one בתאים מ-C3 תהיה נמוכה משמעותית מזו של תאים מ-C one. לצורך סימון ליזוזומים בצבע פלואורסצנטי, דגרו את התאים שגדלו עד ל-50% confluency במצע גידול המכיל fitzy dextran.יש לאפשר לדקסטראן לעבור אנדוציטוזה במשך שעתיים באינקובטור לתרביות תאים. יש לשטוף את התאים במצע גידול שחומם מראש ולהדגיר אותם בו למשך שעתיים באינקובטור CO2 כדי לאפשר לכל הדקסטראן שעבר אנדוציטוזה להצטבר בליזוזום לפני הדימוג. יש לשטוף את זכוכית הכיסוי ב-CIM שחומם מראש ולהרכיב אותו ב-CIM על מחזיק זכוכית כיסוי באינקובטור שעל במה המיקרוסקופ בטמפרטורה של 37 degrees Celsius.בחרו תאים שאינם בעלי ליזוזומים מסומנים ב-fitzy dextran בצפיפות לצורך הדימוי. תנועה ואקזוציטוזה של ליזוזומים בודדים. רכשו תמונות בשדה רחב (wide field) של תנועת ליזוזומים ברחבי התא.לחלופין, רכוש תמונות של turf כדי לבחון תנועה על פני השטח של התא ולנטר את האקסוציטוזה שלהם. פגע בקרום התא באמצעות הקרנה כפי שהודגם קודם לכן כדי לנטר את תגובת הליזוזום לפגיעה בתא; צלם את התאים בקצב של ארבעה עד שישה פריימים לשנייה למשך שתי דקות לפחות, או יותר, בהתאם לדינמיקה של האקסוציטוזה בתאים הנבדקים. במבחן מסוג bulk זה, כל התאים הפגועים מסומנים ואלו שלא עברו תיקון מזוהים, בעוד שהתאים שאינם פגועים נותרים ללא סימון.התאים שנפגעו על ידי חרוזי זכוכית בנוכחות fitzy dextran מסומנים בירוק כאשר התאים נחשפים לתנאי תיקון בנוכחות סידן. מרבית התאים הפגועים מצליחים להשתקם ואינם מסומנים על ידי trissy dextran כאשר התאים נחשפים לתנאי תיקון. בהיעדר סידן, מרבית התאים הפגועים מסומנים גם הם באדום על ידי ה-trissy dextran.ניסוי זה מעריך את קינטיקת תיקון ממברנת התא על ידי ניטור כניסתו של צבע FM לתא. בעת הדגרה בצבע FM, תאים שלמים מראים מעט מאוד או כלל לא צביעה תוך-תאית. בעקבות פגיעה מקומית של ממברנת התא באמצעות לייזר, צבע FM מתחיל להיכנס לתא ולהיקשר לממברנות פנימיות, דבר הגורם לעלייה פתאומית בفلורסצנציה של צבע FM, שכן יכולתה של ממברנת התא להשתקם לאחר פגיעת לייזר תלויה בסידן.תא שנפגע בנוכחות סידן מסוגל להחלים, דבר הגורם להפסקת חדירת צבע ה-FM תוך דקה לאחר הפגיעה. לעומת זאת, תא שניתן להחלים בהיעדר סידן אינו מצליח להחלים, מה שמוביל לחדירה רציפה של הצבע ולכן לעלייה מתמדת בفلואורסצנציית ה-FM אפילו ארבע דקות לאחר הפגיעה. לפיכך, תיקון ממברת התא מוביל להגעה לרמה קבועה (plateau) של צביעת צבע ה-FM.בעוד שחוסר בתיקון ממברנת התא גורם לכניסה רציפה של צבע שאינה מגיעה למישור (plateau), ניתן להשתמש בגישת הפגיעה באמצעות חרוזי זכוכית (bulk glass bead injury) כדי לנטר טרנסלוקציה של וזיקולות וחלבונים אל פני התא בתגובה לפגיעה. במקרה זה, התאים נפגעים בנוכחות של trissy dextran.לפיכך, בעוד שהתאים שלא נפגעו אינם מסומנים באדום, כל התאים הפגועים מסומנים באדום. שימו לב שתאים שלא נפגעו ולא טופלו בנוגדן ראשוני מראים רמת סימון של רקע עבור lamp one על פני השטח של התא. עם זאת, כאשר תאים נפגעים ומאפשרים להם להירפא בנוכחות סידן, ליזוזומים עוברים אקסוציטוזה, ולכן קיימת רמה מוגברת של צביעת lamp one על פני השטח של התאים הפגועים.עלייה זו בסימון של lamp one על פני השטח של התא נמוכה בהרבה בתאים שהותירו להחלים בהיעדרו של calcium. לפיכך, הן כימות מספר התאים בעלי צביעה גבוהה של lamp one על פני השטח של התא, והן מדידת רמת הצביעה של lamp one על פני השטח של תאים פגועים בודדים, מספקות מדדים ליכולתו של התא לעבור אקסוציטוזה ליזוזומלית המושגית על ידי פגיעה.ניסוי זה מנטר באופן ישיר את הקינטיקה, האופי והמיקום של איחוי ליזוזומים בודדים. בתגובה לפגיעה בממברנת התא, התאים נפגעים על ידי לייזר פולסי, וליזוזומים על פני השטח של התא מדויקים באמצעות דימוי turf, המאפשר ניטור של אקסוציטוזה של ליזוזומים המופעלת על ידי פגיעה בתאים בודדים. איור זה מציג תא המדומיין באמצעות דימוי בניגודיות פאזה בפאנל השמאלי ובמיקרוסקופיית turf בפאנל המרכזי.הפאנל הימני מציג את תמונת ה-turf של אותו תא 105 שניות לאחר הפגיעה. כאן מוצג מצב שבו הפגיעה עוררה גיוס של ליזוזום לממברנת התא, ואחריו התרחשה אקסוציטוזה. ליזוזום זה אינו נראה בתמונת ה-turf לפני הפגיעה, אך בעקבות הפגיעה, הליזוזום מגיע לממברנת התא והופך ניתן לגילוי.ככל שהשלפוחית נעה קרוב יותר לממברנת התא, היא מעוררת באופן יעיל יותר על ידי תאורת ה-turf, מה שגורם לפלואורסצנציית גדיל ה-fitsy dex הליזוזומלי להגיע לערך מקסימלי. כאשר נקבובית ההיתוך נפתחת, הדבר גורם לנטרול ה-pH הליזוזומלי ולכן לביטול כיבוי (de quenching) של פלואורסצנציית גדיל ה-fitzy DExT. לאחר מכן, גדיל ה-DExT נפרק מהשלפוחית אל מחוץ לתא, מה שגורם לפלואורסצנציית ZI להתפשט לצדדים ולפלואורסצנציית השלפוחית להפחית את עצימותה בהדרגה; ניתן למדוד תגובות שונות של הליזוזומים המופעלות על ידי פגיעה.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לנטר את יכולתן של תאים להשתקם מפגיעות מוקדיות גדולות, ולנטר תאים תת-תאיים וחלבונים המגיבים לתהליך השקום ומסייעים לו. ניתן לבצע ניסויים נוספים באמצעות סימון חיים בתגים שונים, תאים תת-תאיים או חלבונים, כדי לנטר את התגובה לפגיעה ואת המעורבות בשקום של תאי IND.

imaging-cell-membrane-injury-subcellular-processes-involved

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול מפורט מתואר הדמיה בזמן אמת היווצרות של קומפלקסים לתקן...

הדמיה תיקון Mismatch ותגובות נייד נזק לדנ&quot;א Bacillus subtilis</em

שתוארו כאן הם השתמשו בפרוטוקולים כדי להמחיש את התהליך הדינמי של תיקון MG53 בתיווך קרום התא בבעלי חיים שלם ברמה התאית. שיטות אלה ניתן ליישם כדי לחקור את הביולוגיה של התא פותחת הממברנה הפלסמטית ורפואה רגנרטיבית.

ויזואליזציה של תיקון MG53 בתיווך קרום התא באמצעות In vivo ו במבחנה מערכות

הדמיה חיה של תאים שנחשפו לצבע lipophilic FM1-43 מאפשרת קביעה מדויקת של קינטיקה שבו רעלים יוצרים נקבוביות יוסרו מקרום הפלזמה. זה assay רגיש שיכול לשמש כדי להעריך את הדרישות לCa 2 +, sphingomyelinase וגורמים אחרים על תיקון קרום פלזמה.

לחיות ההדמיה Assay להערכת התפקידים של Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; וSphingomyelinase בתיקון פצעי רעלן נקבובית יוצרי

הנה, הוא הוכיח כיצד באתרו Proximity Ligation Assay (PLA) ניתן להשתמש כדי לזהות ולחזות אינטראקציות חלבונים ישיר חלבון בין כספומט p53 בתרביות תאים ההשעיה חשופים ללחץ genotoxic.

איתור ויזואליזציה של DNA הנזק- Induced חלבון קומפלקסים ההשעיה תא תרבויות באמצעות Assay קשירת הקרבה

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את אופן השימוש בלייזר microirradiation לזירוז סוגים שונים של נזק לדנ א, לרבות מעברי חוט פשוטה יחסית, נזק מורכבות, ללמוד DNA נזק איתות ותיקון גורם מכלול אתרים של נזק ויוו .

לייזר Microirradiation ללמוד In Vivo הסלולר התגובות נזק לדנ א פשוטים ומורכבים

קרינה פלואורסצנטית קונאפוקלית מיקרוסקופ לייזר מיקרו-הקרנה הצעה וכלים גרימת נזק לדנ א וניטור התגובה של חלבונים תיקון ה-DNA באזורים נבחרים גרעיני תת. טכניקה זו התקדמה באופן משמעותי את הידע שלנו של גילוי הנזק, איתות, גיוס. כתב יד זה מדגים הטכנולוגיות הללו לבחון סטרנד ליחיד מעבר לתיקון.

היישום של לייזר מיקרו-הקרנה בחינת יחיד ותיקון כפול Strand Break בתאים בתרבית

קרום התא ופצעו באמצעות לייזר שני הפוטונים שיטה הנפוצה להערכת יכולת חתימה מחדש קרום, שניתן להחיל על סוגי תאים מרובים. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור במבחנה לחיות-הדמיה של קרום חתימת בתאי החולה dysferlinopathy בעקבות אבלציה לייזר שני הפוטונים.

Assay תיקון קרום התא באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים לייזר

תיקון של זוגיות-גדיל DNA מעברי הוא תהליך דינמי, הדורשים לא רק היווצרות תיקון מכלולי השברים, אבל גם הרזולוציה שלהן לאחר הנגע הוא ממוען. כאן, אנו משתמשים מיקרוסקופ immunofluorescence עבור ארעי לטווח ארוך כפול גדילי ומעברי ככלי לנתח מנגנון תחזוקה זה הגנום.

אפיון תהליכי תיקון DNA-ארעי ומעברי DNA ארוך כפול-strand על ידי מיקרוסקופ Immunofluorescence

כאן נתאר של תפוקה גבוהה המבוססת על ידי קרינה פלואורסצנטית assay המודד קרום פלזמה חתימת יעילה באמצעות ניתוחים fluorometric, הדמיה בתאים חיים. Assay הזה יכול לשמש לסינון סמים או היעד גנים המווסתים קרום פלזמה חתימת בתאי יונקים.

תפוקה גבוהה מדידה של קרום פלזמה חתימת יעילות בתאים בתרבית

מאמר זה מציג שלבים חיוניים של חיסונים ואימונופרציפיטציה של כרומטין. פרוטוקולים אלה משמשים בדרך כלל כדי לחקור תהליכים תאיים הקשורים נזק DNA כדי לדמיין ולכומת את הגיוס של חלבונים מעורבים בתיקון DNA.

הדמיה וכימות נזק DNA ספציפי לאתר מבוסס אנדונוקלאז

שיטת הניקור התרמופלסמוני משלבת מיקרוסקופ קונפוקלי, פינצטה אופטית וננו-חלקיקי זהב כדי לחקור תגובות חלבונים במהלך תיקון קרום פלזמה בתאים ובועיות חד-למלריות ענקיות. הטכניקה מאפשרת ניקוב מהיר ומקומי של הממברנה, ומאפשרת זיהוי חלבוני מפתח ותפקידם הפונקציונלי במנגנון המורכב לתיקון קרום הפלזמה.

גישה תרמופלסמונית לחקר תיקון קרום פלזמה בתאים חיים וקרומי מודל

חקור מנגנוני תיקון תאים פגועים באמצעות צביעה פלואורסצנטית ודימות חי. למד כיצת ליזוזומים משתתפים בתהליכי החלמה של ממברנות תאיות פגועות ואת קינטיקת התגובה לפציעה.

תא ההדמיה ממברנה פגיעה ותהליכי subcellular המעורבים בתיקון

גלה סרטונים נוספים