Name: Glioblastoma עכבר דגם orthotopic שמירה על אילוצי המוח של רקמת ריאה, פיסיים ומתאים לשני פוטונים במיקרוסקופ Intravital (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-21T15:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: למד שיטה ליצירת דגם אורתוטופי של גליובלסטומה בעכברים המאפשרת הדמיה אופטית פנימית לאורך זמן באמצעות חלון גולגולתי ומיקרוסקופיית שני פוטונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים בחום מודים לד&quot;ר KK Fenrich, ד&quot;ר MC. Amoureux, פ וובר וא &#39;Jaouen לדיונים מועילים; מ &#39;Hocine, ג Meunier, מ&#39; Metwaly, ס &#39;Bensemmane, J. Bonnardel, צוות של מתקן בעלי החיים בIBDML וצוות של פלטפורמת ההדמיה PicSIL בIBDML לקבלת תמיכה טכנית. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי du הסרטן (האינקה-DGOS-INSERM6038) לGR, סוכנות הידיעות Nationale de la משוכלל ונדיר (ANR JCJC PathoVisu3Dyn), הפדרציה לשפוך la משוכלל ונדיר sur le Cerveau (FRC) לFD, על ידי מלגות מהפדרציה דה לה משוכלל ונדיר Médicale וCancéropole PACA לCR.

<ol><li>DeAngelis, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Brain tumors.</a> N Engl J Med. 344, 114-123 (2001).</li>
<li>Ricard, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+brain+tumours+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Primary brain tumours in adults.</a> Lancet. 379, 1984-1996 (2012).</li>
<li>Prados, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+III+randomized+study+of+radiotherapy+plus+procarbazine%2C+lomustine%2C+and+vincristine+with+or+without+BUdR+for+treatment+of+anaplastic+astrocytoma%3A+final+report+of+RTOG+9404%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Oncol+Biol+Phys%22%5BJournal%5D)">Phase III randomized study of radiotherapy plus procarbazine, lomustine, and vincristine with or without BUdR for treatment of anaplastic astrocytoma: final report of RTOG 9404.</a> Int J Radiat Oncol Biol Phys. 58, 1147-1152 (2004).</li>
<li>Piao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+resistance+to+anti-VEGF+therapy+is+associated+with+myeloid+cell+infiltration%2C+stem+cell+accumulation%2C+and+a+mesenchymal+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma resistance to anti-VEGF therapy is associated with myeloid cell infiltration, stem cell accumulation, and a mesenchymal phenotype.</a> Neuro Oncol. 14, 1379-1392 (2012).</li>
<li>Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%2Fmacrophages+promote+glioma+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia/macrophages promote glioma progression.</a> Glia. 59, 472-485 (2011).</li>
<li>Studwell, A. J., Kotton, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shift+from+cell+cultures+to+creatures%3A+in+vivo+imaging+of+small+animals+in+experimental+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">A shift from cell cultures to creatures: in vivo imaging of small animals in experimental regenerative medicine.</a> Mol Ther. 19, 1933-1941 (2011).</li>
<li>Ustione, A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+introduction+to+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">A simple introduction to multiphoton microscopy.</a> J Microsc. 243, 221-226 (2011).</li>
<li>Ricard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+effects+of+synchrotron+irradiation+on+vasculature+and+tissue+in+healthy+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Synchrotron+Radiat%22%5BJournal%5D)">Short-term effects of synchrotron irradiation on vasculature and tissue in healthy mouse brain.</a> J Synchrotron Radiat. 16, 477-483 (2009).</li>
<li>von Baumgarten, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bevacizumab+has+differential+and+dose-dependent+effects+on+glioma+blood+vessels+and+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Bevacizumab has differential and dose-dependent effects on glioma blood vessels and tumor cells.</a> Clin Cancer Res. 17, 6192-6205 (2011).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat Methods. 2, 932-940 (2005).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J Vis Exp. , 680(2008).</li>
<li>Lathia, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+in+vivo+evidence+for+tumor+propagation+by+glioblastoma+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Direct in vivo evidence for tumor propagation by glioblastoma cancer stem cells.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Madden, K. S., Zettel, M. L., Majewska, A. K., Brown, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumor+imaging%3A+live+imaging+of+glioma+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Brain tumor imaging: live imaging of glioma by two-photon microscopy.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).</li>
<li>Winkler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+glioma+cell+invasion+in+vivo+reveals+mechanisms+of+dissemination+and+peritumoral+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Imaging glioma cell invasion in vivo reveals mechanisms of dissemination and peritumoral angiogenesis.</a> Glia. 57, 1306-1315 (2009).</li>
<li>Van Meir, E. G. Ch. 12. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNewcomb%2C+E+%22CNS+Cancer%2C+Cancer+Drug+Discovery+and+Development%22">CNS Cancer, Cancer Drug Discovery and Development</a>. , Humana Press. 227-241 (2009).</li>
<li>Ulrich, T. A., de Juan Pardo, E. M., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+rigidity+of+the+extracellular+matrix+regulates+the+structure%2C+motility%2C+and+proliferation+of+glioma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The mechanical rigidity of the extracellular matrix regulates the structure, motility, and proliferation of glioma cells.</a> Cancer Res. 69, 4167-4174 (2009).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

גישה זו מאפשרת השימוש בשיטות הדמיה אופטיות כדי לפקח על ימים ושבועות הצמיחה של גליומה המושתלת orthotopically. בעלי החיים זהים בהמשך יכולים להיות נתונה לכמעט כל שיטת הדמיה מוחית במהלך הפתולוגיה; עדיין ההכנה הספציפית במיקרוסקופ שני פוטונים מציעה הזדמנות הייחודית להשיג רזולוציה subcellular בתוך המוח של בעלי החיים חיים. הפרוטוקול שלנו מציג את היתרון לאכוף את צמיחת הגידול לparenchyma המוח ולא במיוחד durally כפי שזה קורה אם תאי גליומה יכולים לעזוב את מערכת העצבים המרכזית דרך הדורה הפגומה...

multiforme glioblastoma מופיע כצורה האגרסיבית ביותר של גידול במוח במבוגרים עם חציון הישרדות של 12 חודשים ושיעור הישרדות לאחר 5 שנים של 5%. ניהול קליני מסתמך על ניתוח, הקרנות וכימותרפיה משמשת לעתים קרובות בשילוב. עם זאת, ההשפעות של טיפולים אלה יישארו פליאטיבי 1-3. עד כה, רוב מחקרי נוירו אונקולוגיה מסתמכים על טכניקות כי הם רק מסוגלים לספק תצוגה סטטית ובוצעו על קבוצות גדולות של בעלי חיים הנושאים גידול הקריבו בזמן נקודות שונות (ראה, למשל, 4,5). הפיתוח האחרון של שיטות מעקב המבוססים על ההדמיה intravital מאפשר לימוד צמיחת גליומה ויחסי הגומלין בין תאים סרטניים והמיקרו pathophysiological על אותו בעלי החיים לאורך זמן. זו פותחת את הדרך ליצירה בלעדית של מידע שהייתה בלתי ניתן להשגה עד כה 6. בעלי חיים מהונדסים מבטא תגי ניאון בתאים של עניין עשויים להיות שימושד ללמוד אינטראקציות ספציפיות בין תאים סרטניים ותאי עצב לדוגמא במאמר זה. במהלך העשור האחרון, שני הפוטונים במיקרוסקופ intravital 7 הפך לסטנדרטי במחקרי נוירו אונקולוגיה בסיסיים וניסויים פרה 8,9 ביכולתה לבצע תצפית intravital עמוקה של מוח עכבר זהב (&gt; 500 מיקרומטר מתחת הדורה מאטר-) עם רזולוציה מרחבית micrometric 10. באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים intravital עם מודלים של בעלי החיים orthotopical המושתלים עם חלון גולגולתי כרוני 11, ניתן לעקוב אחר התקדמות גידול לאורך זמן באותו 9,12 עכבר. אחד החסרונות העיקריים של מודלים של בעלי החיים שפורסמו בעבר אלה הוא, עם זאת, הם לא מחקים את המגבלות פיזיות הקובעים את צמיחת גידול כדורה מאטר, אינו אטום לאחר ההזרקה של ההשעיה תא 9,13,14. תאי גליומה עלולים לדלוף בחלל extradural הפיכת מודל גליומה orthotopic לאחד heterotopic. מודל החיה המוצג כאן מורכב בהזרקה של אליפטית של תאי גליומה ניאון בקליפת המוח בעומק של 200 מיקרומטר ואחרי האיטום של הדורה מאטר, עם ג&#39;ל, חמי חרוז dextran צולבים ודבק histo התואם . צמיחת הגידול מכן הוגבלה לparenchyma המוח ששומר על מגבלות פיזיות pathophysiological. חלון זכוכית כרונית המושתל מעל לגידול מאפשר גישה אופטית קלה עבור שני הפוטונים במיקרוסקופ intravital. שימוש בבעלי חיים מהונדסים מבטא תגי ניאון בתאים של עניין זה ניתן לבצע מעקב של צמיחת גליומה לאורך זמן וללמוד את האינטראקציה שלה עם microenvironment (כאן עם נוירונים וכלי דם מודגשים עם dextrans ניאון).

<table><tbody><tr><td>מקדחה</td><td>דרמל (גרמניה)</td><td>398</td><td>כל מקדחת עצם כירורגית באיכות גבוהה תספיק</td></tr><tr><td>מקדחה בור (#1/4 קרביד עגול בר)</td><td>World Precision Instruments (ארה"ב)</td><td>501860 (#1/4)</td><td>נמכר גם על ידי Harvard Apparatus</td></tr><tr><td>Tissue Scissors</td><td>World Precision Instruments (ארה"ב)</td><td>14395</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה של Dumont M5S</td><td>World Precision Instruments (ארה"ב)501764</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צמנט דנטלי</td><td>GACD (ארה"ב)</td><td>12-565 & 12-568</td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylate</td><td>Eleco-EFD (צרפת)</td><td>Cyanolit 201</td><td></td></tr><tr><td>נימי זכוכית ללא נימה</td><td>Clark Electromedical Instruments (בריטניה)</td><td>GC100-15</td><td></td></tr><tr><td>מזרק מיקרוליטר (25 ומיקרו; l)</td><td>המילטון (ארה"ב)</td><td>702</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>World Precision Instruments (ארה"ב)</td><td>נגזרת Kite-R</td><td></td></tr><tr><td>T (פקק תלת-כיווני - Luer lock)</td><td>World Precision Instruments (ארה"ב)</td><td>14035-10</td><td></td></tr><tr><td>מסגרת סטריאוטקטית (מתאם עכבר)</td><td>World Precision Instruments (ארה"ב)</td><td>502063</td><td></td></tr><tr><td>כיסויי זכוכית</td><td>Warner Instruments (ארה"ב)</td><td>CS-5R (64-0700)</td><td></td></tr><tr><td>ג'ל דקסטרן צולב (Sephadex) G50 גס 100-300 ומיקרו; m חרוזים</td><td>זמינים מספקים שונים כולל סיגמא (גרמניה)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>משחת עיניים</td><td>TVM (צרפת)</td> <td>ג'ל</td><td></td>אוקרי</tr><tr><td>מקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>Leica MZFLIII (גרמניה)</td><td></td> <td>נמכר גם על ידי חברות אחרות</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דו-פוטוני</td><td>Zeiss LSM 7MP (גרמניה)</td><td></td> <td>נמכר גם על ידי חברות אחרות (Nikon, &hellip;)</td></tr><tr><td>לייזר פמטו-שנייה מתכוונן אינפרא אדום (Ma&iuml;-Ta&iuml;)</td><td>ספקטרה פיזיקה (ארה"ב)</td><td></td><td>נמכר גם על ידי חברות אחרות</td></tr></tbody></table>

glioblastoma עכבר דגם orthotopic שמירה על אילוצי המוח של רקמת ריאה, פיסיים ומתאים לשני פוטונים במיקרוסקופ intravital

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

multiforme glioblastoma (GBM) הוא הצורה האגרסיבית ביותר של גידולים במוח ללא טיפולים מרפאים זמינים עד כה. מודלים Murine של פתולוגיה זו מסתמכים על הזריקה של השעיה של תאי גליומה לתוך המוח parenchyma הבא חתך של הדורה-מאטר. ואילו התאים צריכים להיות מוזרקים באופן שטחי להיות נגיש לשני הפוטונים במיקרוסקופ intravital, זריקות שטחיות לא מצליחות לשחזר את תנאי physiopathological. ואכן, שנמלט דרך מערכת ההזרקה רוב התאים הסרטניים מגיעים לשטח הנוסף, שבו הם dural להרחיב מהירים באופן חריג בהעדר אילוצים מכאניים מparenchyma. השיפורים שלנו מורכבים לא רק בfocally השתלה אליפטית גליומה במקום הזרקת השעיה של תאי גליומה בשכבות השטחיות של קליפת המוח, אלא גם בסתימת אתר ההזרקה על ידי חמי חרוז ג&#39;ל dextran צולבים כי הוא דבוק לsurrounparenchyma דינג ואטום לדורה מאטר-עם cyanoacrylate. בסך הכל אמצעים אלה לאכוף את הרחבה וחדירה הפיזיולוגיות של התאים הסרטניים בתוך parenchyma המוח. Craniotomy סופו של דבר סגרה עם חלון זכוכית ביצרו לגולגולת כדי לאפשר הדמיה כרונית במשך שבועות בהעדר התפתחות רקמת צלקת. ניצול של בעלי חיים מהונדסים ניאון מורכב עם תאים סרטניים ניאון שהראינו שהדינמיקה של אינטראקציות המתרחשות בין תאי גליומה, תאי עצב (למשל עכברי Thy1-CFP) וכלי דם (מודגש על ידי הזרקה תוך ורידית של צבע פלואורסצנטי) ניתן דמיינו ידי intravital שני פוטונים במיקרוסקופ במהלך ההתקדמות של המחלה. האפשרות לתמונה ברזולוציה גידול מיקרוסקופית בסביבת מוחין בסכנה מינימאלית מהווה שיפור של מודלים של בעלי החיים GBM הנוכחיים שאמור להועיל לתחום נוירו אונקולוגיה ובדיקות סמים. </p&gt;

ברגע שהפרוטוקול הניתוחי מבוצע (איור 1), ניתן לראות בעלי חיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מעל שבועות עד הקרבה. תגובה דלקתית יכולה להיות שנצפתה לאחר הניתוח, הנעלם בתוך שבוע או שבועות. גידול יכול להיות שנצפה על ידי שיטות מיקרוסקופיה שונות, כולל macroscopy ניאון ושני פוטונים במיקרוסקופ (איור 2). תמונות דוגמא המתוארות כאן מומשו על macroscope הקרינה ומיקרוסקופ שני פוטונים מצמידים את לייזר femtosecond פעם אינפרא אדום מתכונן ובית שונה כדי לאפשר מיקום של...

הקמנו מודל גליובלסטומה orthotopic קליפת המוח בעכברים לשני הפוטונים במיקרוסקופ intravital שמשחזר אילוצי biophysical בדרך כלל במשחק במהלך הצמיחה של הגידול. חלון זכוכית כרוני החלפת הגולגולת מעל לגידול מאפשר המעקב של התקדמות הגידול לאורך זמן על ידי שני פוטונים במיקרוסקופ.

Glioblastoma עכבר דגם orthotopic שמירה על אילוצי המוח של רקמת ריאה, פיסיים ומתאים לשני פוטונים במיקרוסקופ Intravital

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא ליצור מודל אורתוטופי של גליובלסטומה המתאים לדימות אופטי אינטרה-ויטלי בקליפת המוח של עכבר. הדבר מושג תחילה על ידי יצירת חלון גולגולתי מעל הקליפה הפריאטלית. השלב הבא של הפרוצדורה הוא השתלת גידול מסוג spheroid של גליובלסטומה S לשכבות השטחיות של המוח.לאחר מכן, הפרנכימה אוטמת את הנתב וחוסמת את ההזרקה. מעקב אחר כוחות פיתוח גידול תוך-פרנכימטי ושמירה על אילוצים ביופיזיקליים. השלב הסופי הוא איטום חלון זכוכית במגע הדוק עם פני השטח של המוח כדי למנוע רקמת צלקת, ובכך להבטיח בהירות אופטימלית במהלך הדימיון.בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות התקדמות של גידול גליובלסטומה, עיצוב מחדש של כלי הדם ואת המיקרו-סביבה התאית ברזולוציית תא בודד באמצעות מיקרוסקופיית פוטונים כפולה תוך-חיה (intravital). הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר ניסינו להשתיל תרחיף עצמי של סטרואיד ללא מחסום פיזי כדי למנוע בריחה תאית, מה שהוביל בעיקר לצמיחה חיצונית לא פיזיולוגית, הדמויה לזו של in vitro. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום הנוירו-אונקולוגיה, כגון תפקידו של עיצוב מחדש של כלי הדם והשפעותיהם הרגולטוריות של אינטראקציות תאיות במהלך blato.כדי להשתיל את הסטרואיד, התחילו בהרגעה קלה של העכבר בתא גז, ולאחר מכן הרדימו את העכבר באופן מלא באמצעות הזרקה תוך-peritoneal של ketamine עם xylazine. בצעו את הניתוח בחדר חם בטמפרטורה של 26 °C ושמרו על חום גוף של העכבר באמצעות פד חימום נשלט. לאחר מריחת משחות עיניים וגילוח הקרקפת, מקמו את העכבר במסגרת סטריאוטקטית עם מוטות אוזניים ומגש פה כאשר בעל החיים נמצא במנח הנכון.נקה את העור בעזרת תמיסת סבון 3% ותמיסת יוד 10%. כעת בצע חתך אורכי באורך של סנטימטר אחד במרכז הקרקפת באמצעות מספריים. חתוך והסר את העור מעל עצמות הפריאטליות (עצמות הרקה) בעזרת להב סקלפל, והסר בעדינות את הפריאוסטאום (קליפת העצם) מעל הגולגולת.מרחו בנדיבות ציאנואקרילטים על גבי העצם כדי ליצור משטח מחוספס להצמדה עתידית של צמנט. כעת, תחת מיקרוסקופ כירורגי ובאמצעות להב סקלפל, תכננו את הקידוח בעצם הפריאטלית במרחק של לפחות מילימטר מתפרי הגולגולת כדי למנוע דימומים; לבסוף, הסירו את העצם הפריאטלית מעל המיספרה המוחית אחת. במהלך הקידוח, הוסיפו כמות רבה של PBS קר מאוד עם פניסילין וסטריפטומייסין כדי למנוע התחממות יתר. ניתן להסיר רסיסי עצם באמצעות פינצטה וגזה רטובה מדי דקה בערך, ולאחר מכן ניתן להסיר את כולם עם סיום הקידוח.לאחר מכן, יש לקדוח בעצם בשולי ה-craniotomy, במקום שבו ייסגר חלון הזכוכית. יש לקדוח עד שפיסת העצם תהיה מחוברת באופן חלש, ולבסוף, להסיר לאט את העצם בעזרת פינצטה. בסופו של דבר, החלון צריך להיות צמוד לכמה שיותר רקמת מוח.לאחר השלמת מסגרת החלון, יש לבחון אותה באמצעות כיסוי זכוכית עגול בקוטר חמישה מילימטרים שנוקה באלכוהול ויובש. המשיכו באיסקול אם הדבר נחוץ, עד שהמוח יידחס באופן שטוח תחת לחץ עדין אל כיסוי הזכוכית. לאחר מכן, נקו שוב את כיסוי הזכוכית והניחו אותו בצד כדי לפתוח את הקרומיים (dura mater).צרו חור באמצעות מחט בכילייב 26 במרכז הקרניאוטומיה, תוך הימנעות מכלי דם ראשיים. ודאו שאינכם פוגעים בפארנכימה של המוח. נקו בעדינות את ה-dura mater באמצעות PBS ולאחר מכן כסו אותה בנייר סופג לח בזמן הכנת הספרואיד.נוהל זה דורש הכנה מראש של מערכת הזרקת ה-S spheroid ושל צלחת פטרי. ראשית, שאבו מהצלחת הפטרי סטרואיד עגול המתאים לקוטר הפנימי של הקפילרה. הסטרואיד אמור להישא יחד עם כ-5 µL של מצע תרבית, ועליו לרדת לקצה הקפילרה תחת השפעת משקלו העצמי.הסיר את נייר הרקמה הרטוב ששימש לכיסוי הקרניוטומיה והצב את בעל החיים תחת מערכת ההזרקה. הורד את פיפטת ההזרקה עד שהיא נוגעת בחור שנוצר בקשרי הדורה (dura mater). לאחר מכן, הורד אותה ב-250 microns נוספים והמת 30 שניות.הזריקו את הסטרואיד באיטיות באמצעות בוכנת מזרק המיקרוליטר, שני עד שלושה µL, תוך ספיגת עודפי הנוזל עם פיסת נייר סופג דקה. המתינו 30 שניות ולאחר מכן הרימו בעדינות את פיפטת ההזרקה ב-50 microns. המתינו 30 שניות נוספות לפני הרמה של 50 microns נוספים.המשיכו לחזור על תבנית זו עד להבאת הפ pipette אל פני השטח. כעת, אששו את נוכחות הסטרואיד במוח באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה בצלחת פטרי. הכינו תמיסת חרוזים ספוגים צמיגים בעלת קוטר של 1 עד 300 micron.בצע קשירה צולבת של Dexter וחרוזי ג'ל ו-PBS. המתן דקה והעבר חלק מהחרוזים המהוללים לעצם הסמוכה לקרניוטומיה תחת בקרה מיקרוסקופית; בחר חרוז אחד שקוטרו דומה לגודל פתח הקרניוטומיה. חתוך את חרוז הג'ל של גדיל ה-DExT עם הקשירה הצולבת לשני חצאים.בעזרת פינצטה, הניחו בעדינות חצי-חרוז של ג'ל dextra מקושר בתוך חור ההזרקה, כאשר הפנים הקמור פונה לכיוון ה-S spheroid. תוך שמירה על מודעות לשבריריות השתל, לחצו בעדינות על החרוז עד שפניו השטוחים יתיישרו עם הקרומיים (dura mater). לאחר מכן, הניחו טיפה של דבק cyanoacrylate על תגית זכוכית, ובעזרת קיסם שיניים, צרו איטום בעזרת הדבק לאורך קצוות חרוז ה-DExT strand.החטבו את הדבק מסביב במהירות ובדיוק, אחרת החרוז עלול להידבק לקיסם. אין להשתמש בכמות גדולה מדי של דבק, אך יש להשתמש בכמות מספקת כדי להשרות שינוי בנקבוביות של החרוז. כפי שמוצג כאן על חרוזי דגימה, שלב עדין זה מורכב כולו מכך.אטום את החרוז אל ה-ter ואל הפרנכימה שסביבו עם כמות מספקת של דבק כדי למנוע היווצרות בליטה של דבק שעלולה להפריע להנחת חלון הזכוכית ולבהירות האופטית לטווח ארוך. המתן שתי דקות לייבוש הדבק ולאחר מכן נקה את הקרניוטומיה ואת העצם שסביבה באמצעות PBS רגיל. כעת מקם את כיסוי הזכוכית (cover slip) המוכן מעל הקרניוטומיה.קצות זכוכית הכיסוי חייבים להישען על היקף הגולגולת הדק, והקרומי הדורה (dura mater) שמתחתיה חייב להיות במגע עם הזכוכית, אחרת עלולה להתפתח רקמת צלקת שתפגע בבהירות האופטית של הרקמה. ספגו את ה-PBS לאורך קצות זכוכית הכיסוי כדי שהתמיסה לא תכסה את פתח הקרניוטומיה. הפעלת לחץ קל במרכז זכוכית הכיסוי תבטיח שהעצם, הזכוכית והמוח יהיו מודבקים זה לזה באזור העניין.הפעילו לחץ קל במרכז זכוכית הכיסוי באמצעות פינצטה תוך כדי מריחה עדינה של cyanoacrylate בגבול שבין העצם לזכוכית הכיסוי; הדבק יתפשט באופן ספונטני עד שיידחף על ידי תמיסת ה-PBS. תוך דקה ייווצר איטום יעיל, אך יש להיזהר מאוד שלא להזיז את זכוכית הכיסוי עד שהיא מקובעת, אחרת הניתוח ייכשל עקב דליפת דבק. אם דבק התפשט על גבי הזכוכית, הסירו אותו בעזרת להב מיקרו-סקלפל תוך הפעלת לחץ עדין ותנועות ספירליות כדי לשמור על צלילות אופטית.כעת, חזקו את קיבוע הזכוכית על ידי מריחת דבקים דנטליים על קצוות מכסה הזכוכית. החליקו את הדבק לכיוון הגולגולת הסמוכה. כסו את כל אזור הגולגולת החשוף עד לקרקפת באמצעות דבק נוסף.בנו דפנות מסביב לכיסוי הזכוכית (cover slip) כך שניתן יהיה ליצור בריכה של תמיסה מעל הזכוכית. עבור עדשת השקיעה (immersion objective), שימו לב שהצמנטים לדנטיים יתקשו תוך פחות מ-10 דקות. לאחר הוצאת העכבר מהמסגרת הסטריאוטקטית, הניחו אותו בכלוב עם קן של רקמה חמה והמשיכו במשטר טיפול פוסט-אופרטיבי.ניתן לעקוב אחר צמיחת הגידול מתחת לקרומי המוח (dura mater) במשך שבועות לאחר ההשתלה. התפתחות הגידול הוערכה לאורך זמן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה, תוך שילוב של תאורה אלכסונית לדימוי השתקפות בשדה בהיר (brightfield reflectance imaging) וסף פליטה של פלואורסצנציה אפיפלוורסצנטית (epi fluorescence emission thresholding); שיטה זו מאפשרת גישה קלה לאזור הגידול, בעוד שכלי דם שטחיים מופרדים כמבנים כהים על רקע לבן של תמונת האור הנראה. לחלופין, מיקרוסקופיה דו-פוטונית בתוך הגוף (intravital two photon microscopy) מאפשרת חיתוך Z ושחזורים אורתוגונליים של שדות ראייה רחבים ברזולוציה סוב-תאית, כגון דנדריטים.הצבע הירוק מראה ביטוי של חלבון פלואורסצנטי ציאני (cyan fluorescent protein), ונוירונים בעקבות צמיחת גידול באמצעות מיקרוסקופיית פוטונים כפולים מיום 16 עד יום 27. חלק מכלי הדם המסומנים בחצים היו יציבים לאורך 11 הימים, בעוד ששולי הגידול המסומנים הזזו 520 microns ומערכת כלי הדם של הגידול השתנתה בשולי הגידול. ניתן היה לראות תאי גליומה נפרדים מליבת הגידול, כפי שצפוי מגידול פולשני.תאים אלו פולטים בליטות ציטופלזמיות ומשתמשים בכלי דם כמטריקס להתקדמותם, כפי שסומן על ידי ראשי החצים בשילוב עם רפורטר פלואורסצנטי. שיטה זו מאפשרת לצפות באינטראקציות פיזיות כאלו בין תאי גידול לסביבתם כווסתים מרכזיים של התקדמות המחלה. בביצוע נכון של הפרוטוקול, ניתן להשלים שיטה זו בתוך 45 דקות עד שעה.ניתן לבצע שיטות דימוי פרה-קליניות אחרות, כגון טומוגרפיה פלורסצנטית, רנטגן, סורק CT ו-MRI, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון חדירת תאי נובלאסטומה לתוך המוח המבוגר.

an-orthotopic-glioblastoma-mouse-model-maintaining-brain-parenchymal

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

מטרת מאמר זה היא לתאר את השימוש במודל גליובלסטומה orthotopic ללימודי chemoradiation. מאמר זה יהיה ללכת על פי עיבוד בתא, השתלה, והקרנות של העכבר באמצעות המודל תוך גולגולתי.

שילוב הקרנות של מודל העכבר Orthotopic המוח גידול

על ידי שילוב של-גולגולת דקה מלוטשת ומחוזקת (יציאות) גולגולתי חלון והזרקת גליובלסטומה (GBM) תא, אנו יכולים לצפות בייזום וצמיחה מתאים מוזרקים GBM במוח של עכבר חי longitudinally גליומה.

הדמית Glioma ייזום<em&gt; In Vivo</em&gt; דרך חלון גולגולתי מלוטש ומחוזק-גולגולת דקה

Source: Nishimura, C. et al. כימות של ארכיטקטורת כלי דם מוחיים באמצעות מיקרוסקופיה דו-פוטונית במודל עכבר של דלקת עצבית הנגרמת על ידי HIV. J. Vis. Exp. (2016). סרטון זה מדגים את ההדמיה in vivo של נימים בקליפת המוח במוח העכבר באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני. הוא מתאר את השלבים להזרקת צבע פלואורסצנטי לעכבר מורדם עם חלון קליפת המוח דק הגולגולת, הכנת ההתקנה להדמיה ורכישת תמונות מפורטות של מבנים מיקרו-וסקולריים במוח לניתוח.

 מיקרוסקופיה דו-פוטונית להדמיה In Vivo של מיקרו-כלי דם במוח העכבר 

רומן ברזולוציה גבוהה<em&gt; בvivo</em&gt; טכניקת הדמיה כדי לחקור את התגובה דינמית של מבנים תוך גולגולתי לצמיחה גידול וTherapeutics

כאן אנו מתארים שיטה עבור ברזולוציה גבוהה בזמן הדמיה multiphoton של תאים סרטניים במוח לפני ואחרי התערבות כירורגית פולשנית (למשל, ביופסיה) בתוך חיה חיה אותו. שיטה זו מאפשרת ללמוד את ההשפעה של אלה הליכים כירורגי פולשנית על תאים סרטניים ' נדידה, פולשנית, והתנהגות מתרבים ברמת תא בודד.

האורך הדמיה של התנהגות המוח תאים סרטניים בתגובה ביופסיה פולשנית כירורגית

פרוטוקול זה מתאר טכניקת השרשה כרונית חלון הגולגולת שניתן להשתמש בהם עבור הדמיה האורך של מבנים נוירווליו-כלי דם, אינטראקציות, ותפקוד בתנאים בריאים ונגועים. היא משמשת כחלופה משלימה לגישת הדימות הtranscranial, שבזמן הרצוי לעתים קרובות, יש כמה מגבלות קריטיות.

מיפוי המוח מדויק לבצע חוזרות ונשנות של הדמיה Vivo של נוירודינמיקה החיסונית בעכברים

במאמר זה אנו מתארים מודל עכבר אורתוטופי פרה-קליני עבור GBM, שהוקם על ידי הזרקה תוך-גולגולתית של תאים שמקורם בגידולי מודל עכבר מהונדסים גנטית. מודל זה מציג את סימני ההיכר של המחלה של GBM אנושי. עבור מחקרים תרגומיים, הגידול במוח העכבר נמצא במעקב על ידי MRI in vivo והיסטופתולוגיה.

מודלים אורתוטופיים תרגומיים של גליובלסטומה מולטיפורמה

מחקר זה מדגים העברה של פגיעה מוחית טראומטית חוזרת ונשנית לעכברים והשתלה סימולטנית של חלון גולגולתי לצורך הדמיה תוך-חיונית עוקבת של EGFP המתבטא בנוירונים באמצעות מיקרוסקופ של שני פוטונים.

הדמיה תוך חיונית של ביטוי חלבון פלואורסצנטי בעכברים עם פגיעה מוחית טראומטית בגולגולת סגורה וחלון גולגולת באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני

אנו מציגים גישה חדשנית למיקרוסקופ דו-פוטוני של העברת הגידול של ננו-חלקיקי תחמוצת ברזל עם תווית פלואורסצנטית לגליובלסטומה במודל עכבר.

מיקרוסקופיה תוך-חיונית דו-פוטונית של גליובלסטומה במודל מורין

גליובלסטומה היא צורה הרסנית של סרטן מוח ראשוני, וטיפול תרמי אינטרסטיציאלי בלייזר מתגלה כחלופה מבטיחה לכריתה כירורגית קונבנציונלית לגליובלסטומה שאינה ניתנת לניתוח. פרוטוקול זה מתאר מודל עכבר פרה-קליני אופטימלי שניתן להשתמש בו כדי לחקור את השפעות הטיפול או טיפולים משלימים וקומבינטוריים.

מודל עכברי בעל יכולת חיסונית לטיפול תרמי אינטרסטיציאלי בלייזר בגליובלסטומה

למד שיטה ליצירת דגם אורתוטופי של גליובלסטומה בעכברים המאפשרת הדמיה אופטית פנימית לאורך זמן באמצעות חלון גולגולתי ומיקרוסקופיית שני פוטונים.

Glioblastoma עכבר דגם orthotopic שמירה על אילוצי המוח של רקמת ריאה, פיסיים ומתאים לשני פוטונים במיקרוסקופ Intravital

גלה סרטונים נוספים