Name: בידוד ופיזיולוגי ניתוח של שריר לב העכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: למדו בידוד מיוצים לבביים מלב עכבר בוגר באמצעות פרפוזיה LOR לניתוח כיווציות ומתארי סידן. שיטה זו מאפשרת חקירת תפקוד תאי לב ותרומות גנטיות לפגיעה לבבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מארק ווזניאק לשימוש במחלקה לסלולרית וציוד צילום וידאו בביולוגיה התפתחותית. תא ההדמיה האוניברסיטה ונדרבילט משותף למשאב. עבודה זו נתמכת על ידי מענק AHA 12PRE10950005 לERP, מענק AHA 11GRNT7690040 לבנק דיסקונט למשכנתות, NIH מענק R01 HL037675 לבנק דיסקונט למשכנתות. בנק דיסקונט למשכנתאות הוא יו&quot;ר גלדיס פ Stahlman במחקר לב וכלי דם.

להבטיח שכל ההליכים כרוכים בבעלי חיים מאושרים על ידי השימוש בבעלי החיים המתאימים וטיפול גוף. .1 הכינו חוצצי המלאי מראש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מניית 2 L Ca 2 + של Tyrode החופשי (טבלת 1). התאם את רמת החומציות ל7.4 עם NaOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מניית 2 L 1.2 של מ&quot;מ Ca 2 + Tyrode (טבלת 2). התאם את רמת החומציות ל7.4 עם NaOH. </li></ol> .2 ביום של הניסוי, הכינו זלוף, העברה, ועיכול חוצצים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ זלוף 150 מ&quot;ל בCa 2 + של Tyrode החופשי (לוח 3) ולסנן דרך פילטר 0.2 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 35 מ&quot;ל Ca 2 + העברה חופשית &quot;חוצץ&quot; (לוח 4) ו25 מ&quot;ל Ca 2 + המכיל &quot;הצפת B&quot; (לוח 5). לסנן כל דרך מסנן 0.2 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות של 0.06, 0.24, 0.6, ו1.2 מ&quot;מ Ca 2 + על ידי הצפת ערבוב וB ללוח 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ עיכול 25 מ&quot;ל על ידי המסת אנזימי עיכול ב25 מ&quot;ל חיץ זלוף (לוח 7) המבוסס על משקל הגוף (BW) של העכבר. לסנן דרך פילטר 0.2 מיקרומטר לפני השימוש. </li></ol> .3 הגדרת ניסוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב מנגנון זרימת Langendorff קבוע, זמין באופן מסחרי או באמצעות משאבה, צינורות, וסליל מחליף חום peristaltic כדי לאפשר קצב זרימה של 3ml / דקה של perfusate המחומם ל37 מעלות צלזיוס. סכמטי פשוט מסופק בסקירת 2011 על ידי בל, et al 18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר טמפרטורת אמבט מים במחזור (~ 47 ° C) של מנגנון Langendorff כך יצוא שמהצינורית הוא על 37 מעלות צלזיוס בקצב זרימה של 3 מ&quot;ל / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל 70% אתנול באמצעות מערכת זלוף במשך 15 דקות, ואחריו מסוג ultrapure אני מים 100 מ&quot;ל. חיץ זלוף להפעיל באמצעות התוכנה למ &#39;במשך 5 דקות תוך ביטול בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את כל הכלים כירורגיים עם שיטה רצויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור צינורית על ידי הצמדת קטע קצר (מ&quot;מ על 3) PE-50 צינורות לקצה מתאם Luer-בדל 23 G. טיפ חום של צינורות כדי ליצור שפה אשר לאב העורקים יהיו ממוצבת. </li></ol> בידוד .4 Cardiomyocyte <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק עכבר עם 0.2 מ&quot;ל פתרון הפרין (1,000 IU / ml), באמצעות הזרקת intraperitoneal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 5 דקות, להרדים עכבר עם isofluorane. כשהרדים (אין תגובה לקמצוץ רגל חזקה) באופן מלא, לרסס חזה עם EtOH 70%. פתח את החזה, לכרות במהירות הלב, נזהר שלא לפגוע באב העורקים, ומקום ב4 ° C חיץ זלוף. השתמש במלקחיים מעוקלים לתפוס ולהרים תחת הלב. זה יוצר חלל לקצץ קבצים מצורפים מאחורי הלב עם מספריים עדינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cannulate הלב בעדינות על ידי אחיזה בקצה של אב העורקים עם שני זוגות מלקחיים בסדר ומושך openi בזהירותng של אב העורקים מעבר לשפה של הצינורית. ודא את הקצה של הצינורית הוא לא עבר שסתום אב העורקים ולתוך החדר, כמו זה יהיה לעכב זלוף של הלב באמצעות העורקים הכליליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבטח את אב העורקים לצינורית על ידי קשירת לולאה של 5-0 תפר משי סביב אב העורקים מייד מעל השפה של הצינורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: שלבי 4.2 דרך 4.4 אמורים להסתיים במהירות האפשרית לעיכול באיכות הטובה ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: הלב יכול להיות תלוי ישירות על גבי הצינורית כבר מחוברת למכשירי Langendorff עם זורם חיץ זלוף. עם זאת, תלוי הלב על צינורית שמחוברת למזרק קטן של חיץ זלוף תחת מיקרוסקופ לנתיחה כבר מצא להיות מוצלח ביותר. זה מאפשר כמות קטנה של חיץ זלוף כדי שתועבר, צופה לסליקת עורקים הכליליים והבטחת לב מחוברת היטב לצינורית. הצינורית לאחר מכן נתלתה על Langendorff עם הפעלת מאגר זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תנקבהלב עם חיץ זלוף החופשי Ca 2 + בזרימה של 3 מ&quot;ל / דקה במשך 2-3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור לאנזים חיץ עיכול ותנקב ל7-10 דקות, לב יהפוך רך יותר וקל יותר בצבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: זמן עיכול יכול להיות מותאם המבוסס על פעילות אנזים וגודל לב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהלב הוא מוחשי רפוי, להוציא את הלב מהצינורית ומניחים בצלחת P60 סטרילי עם הצפת (Ca 2 + חיץ העברה חופשית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר אטריה וכלי גדול. הסר חדר ממני אם תרצה בכך. עם מלקחיים, מפריד את החדר לחתיכות קטנות. כמה פעמים פיפטה עם טפטפת העברה 5 מ&quot;ל סטרילי כדי לפזר עוד תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את ההשעיה התא לתוך צינור חרוטי 50 מ&quot;ל דרך מסנן רשת ניילון 250 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר ההשעיה עד גלולה במשך כ 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הכדור לפתרון 0.06 מ&quot;מ Ca 2 +. לאפשר לתאי גלולה עבור 10 דקות. תאים בריאים גלולה, בעוד שרוב התאים מתים יצופו. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant, ולהעביר את הכדור לפתרון 2 + מ&quot;מ Ca 0.24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור 10 דגירה דקות, שאיפה, ולהעביר באמצעות שני 2 + פתרונות Ca שנותרו עד תאים בפתרון 1.2 מ&quot;מ. בשלב זה, רוב התאים צריכים להיות myocytes מוט בצורה. </li></ol> .5 ארעיים התכווצות וסידן מדידה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: שתי התכווצות וארעית סידן ניתן למדוד בו זמנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פורע-2 פתרון PM על ידי resuspending בDMSO נטול מים לריכוז של 1 מיקרוגרם / μl. פתרון הפורע-02:00 יכול להיות מאוחסן בתא ייבוש ב-20 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 טען מ&quot;ל של תאים תלויים עם μl 1 פורע-2 PM. לאפשר לתאים לשבת בחושך 10 דקות לאחר מכן supernatant לשאוב. שטוף פעמיים עם הפתרון של Ca 2 + Tyrode, מאפשר לתאי גלולה בחושך עבור 10 דקות בין שוטף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים coverslip זכוכית בהוספת שלב שמאפשרת PE המחומםrfusion / שאיפה ואלקטרודה צעדה עם ממריץ שדה myocyte. הוספת שלב מקום במיקרוסקופ ההפוכה להגדיר למדידת הקרינה, הוספת טיפה של שמן לעדשה אם באמצעות אובייקטיבי טבילת שמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת זלוף כובד המחומם עם פתרון 1.2 מ&quot;מ Ca 2 + של Tyrode כך פתרון על במה מגיע 37 מעלות צלזיוס. צרף שאיפה לואקום. חבר אלקטרודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מערכת מיקרוסקופ, ולפתוח את תוכנת הקרינה ורכישת נתונים מידות תא ratiometric. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף כמה טיפות של תאים עמוסים פורע-2 בבוקר ועד הוספת השלב, חסימת זלוף לרגע כדי לאפשר לתאים בריאים להתיישב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש אובייקטיבי 40X כדי לאתר תאים הרצויים. תא בריא צריך להיות מוט בצורה ולא באופן ספונטני להידבקות. צריך כאשר התא בקצב זה בעליל וחוזה אחיד ב5-20 V. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: ניתוח פיזיולוגי דורש עיכול באיכות גבוהה. זה אפשרי שיהיה לי תאים שנראים בריא, אבל לא pa<html> ce גם לניתוח פיסיולוגי. פרוטוקול עיכול עשוי לדרוש עידון כדי לקבל איכות גבוהה, myocytes הבריא. בנוסף, לבבות מוטציה או חולים עשויים לדרוש שינויים בפרוטוקול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאימו סיבוב עדשה ושינוי צמצם כך התא רצוי הוא בשורה בצורה אופקית על מסך ורקע אינה גלויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר ברים גילוי קצה לכל קצה של myocyte ולהתאים סף. יישר זיהוי sarcomere על חלק מתא עם sarcomeres האחיד. ככל שאתה יכול לעשות זה בר, המודל המתמטי מדויק יותר של אורך sarcomere יהיה, כל עוד זה לא על שתי אוכלוסיות של sarcomeres. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי קצב ב2 הרץ ו5-20 V של 10-15 שניות לפני ההקלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשומה מעקב. אור הסביבה צריך להיות ממוזער להקלטה ארעית סידן הטוב ביותר. </li></ol> .6 ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח עקבות באמצעות הקרינה ratiometric ותוכנת רכישת נתונים מידות תא. </li></ol>כותרת &quot;&gt; 7. מחקרים נוספים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטוקול זה מספק תאים עודפים שיכול לשמש למגוון רחב של ניסויים אחרים, כוללים: קיבעון וimmunostaining, הערכת השפעות ישירות סמים, תרבות טווח קצרה, ומיקרוסקופ כוח אטומי. </li></ol>

<ol><li>Babick, A. P., Dhalla, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Subcellular+Remodeling+in+Cardiac+Dysfunction+due+to+Congestive+Heart+Failure%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Principles+and+Practice%22%5BJournal%5D)">Role of Subcellular Remodeling in Cardiac Dysfunction due to Congestive Heart Failure.</a> Medical Principles and Practice. 16, 81-89 (2007).</li>
<li>Nogami, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purkinje-Related+Arrhythmias+Part+I%3A+Monomorphic+Ventricular+Tachycardias%5BTitle%5D)+AND+%22Pacing+and+Clinical+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">Purkinje-Related Arrhythmias Part I: Monomorphic Ventricular Tachycardias.</a> Pacing and Clinical Electrophysiology. 34, 624-650 (2011).</li>
<li>Clancy, R. M., Kapur, R. P., Molad, Y., Askanase, A. D., Buyon, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohitologic+Evidence+Supports+Apoptosis%2C+IgG+Deposition%2C+and+Novel+Macrophage%2FFibroblast+Crosstalk+in+the+Pathologic+Cascade+Leading+to+Congenital+Heart+Block%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">Immunohitologic Evidence Supports Apoptosis, IgG Deposition, and Novel Macrophage/Fibroblast Crosstalk in the Pathologic Cascade Leading to Congenital Heart Block.</a> Arthritis and Rheumatism. 50, 173-182 (2004).</li>
<li>Splawski, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaV1.2+Calcium+Channel+Dysfunction+Causes+a+Multisystem+Disorder+Including+Arrhythmia+and+Autism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CaV1.2 Calcium Channel Dysfunction Causes a Multisystem Disorder Including Arrhythmia and Autism.</a> Cell. 119, 19-31 (2004).</li>
<li>Berry, M. N., Friend, D. S., Scheuer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+Metabolism+of+Intact+Muscle+Cells+Isolated+from+Adult+Rat+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Morphology and Metabolism of Intact Muscle Cells Isolated from Adult Rat Heart.</a> Circulation Research. 26, 679-687 (1970).</li>
<li>Fang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luteolin+Inhibits+Apoptosis+and+Improves+Cardiomyocyte+Contractile+Function+through+the+PI3K%2FAkt+pathway+in+Simulated+Ischemia%2FReperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Luteolin Inhibits Apoptosis and Improves Cardiomyocyte Contractile Function through the PI3K/Akt pathway in Simulated Ischemia/Reperfusion.</a> Pharmacology. 88, 149-158 (2011).</li>
<li>Feng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+Regulation+of+Murin+Cardiomyocyte+Contractility+by+Nanomolar+%28-%29-Epigallocatechin-3-Gallate+the+Major+Green+Tea+Catechin%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Coordinated Regulation of Murin Cardiomyocyte Contractility by Nanomolar (-)-Epigallocatechin-3-Gallate the Major Green Tea Catechin.</a> Molecular Pharmacology. 82, 993-1000 (2012).</li>
<li>Claycomb, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HL-1+cells%3A+A+cardiac+muscle+cell+line+that+contracts+and+retains+phenotypic+characteristics+of+the+adult+cardiomyocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science%22%5BJournal%5D)">HL-1 cells: A cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 95, 2979-2984 (1998).</li>
<li>Kaestner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Genetic+Manipulation+of+Adult+Cardiac+Myocytes+for+Confocal+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging.</a> J Vis Exp. (31), e1433(2009).</li>
<li>Vainio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neronostatin%2C+a+Novel+Peptide+Encoded+by+Somatostatin+Gene%2C+Regulates+Cardiac+Contractile+Function+and+Cardiomyocytes+Survival%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Neronostatin, a Novel Peptide Encoded by Somatostatin Gene, Regulates Cardiac Contractile Function and Cardiomyocytes Survival.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287, 4572-4580 (2012).</li>
<li>Park, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+mechanisms+for+caspase+inhibition+protecting+cardiac+function+wth+chronic+pressure+overload%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Novel mechanisms for caspase inhibition protecting cardiac function wth chronic pressure overload.</a> Basic Research in Cardiology. , 108(2013).</li>
<li>Novaes, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Trypanosoma+cruzi+infection+on+myocardial+morphology%2C+single+cardiomyocyte+contractile+function+and+exercise+tolerance+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">Effects of Trypanosoma cruzi infection on myocardial morphology, single cardiomyocyte contractile function and exercise tolerance in rats.</a> International Journal of Experimental Pathology. 92, 299-307 (2011).</li>
<li>Weltman, N. Y., Wang, D., Redetzke, R. A., Gerdes, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longstanding+Hyperthyroidism+is+Associated+with+Normal+or+Enhanced+Intrinsic+Cardiomyocyte+Function+despite+Decline+in+Global+Cardiac+Function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Longstanding Hyperthyroidism is Associated with Normal or Enhanced Intrinsic Cardiomyocyte Function despite Decline in Global Cardiac Function.</a> PLoS One. 7, e46655(2012).</li>
<li>Papanicolaou, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserved+heart+function+and+maintained+response+to+cardiac+stresses+in+a+genetic+model+of+cardiomyocyte-targeted+deficiency+of+cyclooxygenase-2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Preserved heart function and maintained response to cardiac stresses in a genetic model of cardiomyocyte-targeted deficiency of cyclooxygenase-2.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49, 196-209 (2010).</li>
<li>Despa, S., Lingrel, J. B., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2B%2FK%2B-ATPase+a2-isoform+preferntially+modulates+Ca2%2B+transients+and+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+release+in+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Na+/K+-ATPase a2-isoform preferntially modulates Ca2+ transients and sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in cardiac myocytes.</a> Cardiovascular Research. 95, 480-486 (2012).</li>
<li>Touchberry, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF23+is+a+novel+regulator+of+intracellular+calcium+and+cardiac+contractility+in+addition+to+cardiac+hypertophy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">FGF23 is a novel regulator of intracellular calcium and cardiac contractility in addition to cardiac hypertophy.</a> American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. , (2013).</li>
<li>Helmes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titin+Determines+the+Frank-Starling+Relation+in+Early+Diastole%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Titin Determines the Frank-Starling Relation in Early Diastole.</a> The Journal of General Physiology. 121, 97-110 (2003).</li>
<li>Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+heart+perfusion%3A+The+Langendorff+technique+of+isolated+heart+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50, 940-950 (2011).</li>
<li>Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Cell+Transcriptional+Profiling+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> J Vis Exp. (58), e3302(2011).</li>
</ol>

יש לנו מה למסור.

בידוד של שריר לב באיכות דורש רמה מסוימת של תרגול ואופטימיזציה. פרוטוקול זה מכיל שלבים עיקריים שיכול להשפיע על התוצאה של העיכול באופן משמעותי. אלה יש לשקול בזהירות בעת ביצוע ופתרון הבעיות בפרוטוקול. הזמן מהסרת הלב לcannulation וזלוף צריך להיות ממוזער, באופן אידיאלי פחות מחמש דקות. שטיפת הלב מייד במאגר זלוף קר כקרח לאחר הסרת מהעכבר ולנתח וcannulating הלב במאגר קר כקרח גם תגדיל את הסיכויים של מערכת עיכול איכות. Cannulation עצמו הוא שלב קריטי. הקצה של הצינורית יש להציב מתחת לענפים הרא...

קרדיומיוציטים מספקים את כוח ההתכווצות ללב. כל מיוציט מכיל אלמנטים ציטוסקלטליים והתכווצות מאורגנים החיוניים להתכווצות. הלב מכיל לא רק קרדיומיוציטים אלא גם פיברובלסטים, רקמת חיבור ומיוציטים שעברו שינוי כגון סיבי פורקיניה. ניתן לראות שינויים בכל אחד מסוגי התאים הללו או בכולם, באי ספיקת לב, מה שמקשה על קביעת הגורם האולטימטיבי לתפקוד לקוי של הלב. לירידה בהתכווצות החדרים של לב כושל קדמו דרגות שונות של הצטברות רקמה סיבית והיפרטרופיה ותפקוד לקוי של הקרדיומיוציטים1. הפרעות קצב יכולות להיגרם על ידי תפקוד לקוי בתאים המוליכים2, פיברוזיס המפריע להולכת הלב3, או שינויים בביטוי תעלות יונים בקרדיומיוציטים1,4. ואכן, בעיות אלה מתקיימות לעתים קרובות במקביל בצורה מורכבת.
בידוד ולימוד קרדיומיוציטים מאפשר לבחון תפקוד לקוי של התכווצות ותפקוד חשמלי של מיוציטים בודדים בהקשר של תפקוד הלב הכללי. טכניקות לבידוד מיוציטים לבביים בודדים פותחו לפני למעלה מ-40 שנה במאמץ לחקור טוב יותר את הפיזיולוגיה של תא 'סוס העבודה' הזה של הלב. טכניקות הבידוד שופרו כדי להגדיל את התפוקה והאיכות של התאים, עם התפתחות חיונית של זלוף כלילי באמצעות קנולציה של אבי העורקים, שבוצעה לראשונה בשנת 19705. מאמר זה מתאר בידוד קרדיומיוציטים ואחריו מדידה של התכווצות וטרנזיינטי סידן באמצעות תוכנת רכישת נתונים פלואורסצנטיים רציומטריים וממדי תאים. במודלים גנטיים וסביבתיים של מחלות לב, שימוש בפרוטוקול זה מספק מידע מרכזי על התכווצות התאים, התכווצות והרפיה סרקומריות, מעברי סידן והפרעה לשלד הציטו. מערכת זו משמשת לעתים קרובות לבדיקת השפעת תרופות על קרדיומיוציטים מבודדים6,7. אנו משתמשים במערכת כדי להשוות התכווצות ומעברי סידן של קרדיומיוציטים בין עכברים ועכברים מסוג בר עם מוטציה המובילה לקרדיומיופתיה מורחבת.
לחקר מיוציטים לבביים בודדים יש יתרונות רבים על פני שיטות נפוצות אחרות לחקר אנטומיה ופיזיולוגיה של הלב. אקו לב ואלקטרוקרדיוגרפיה מספקים מידע על תפקוד ההתכווצות וההולכה החשמלית של הלב באופן כללי. אף אחת מהשיטות הללו לא מסבירה את הסיבה או את האופי של התפקוד הלקוי מתחת לרמה של האיבר כולו. מדידת התכווצות של קרדיומיוציטים בודדים באמצעות אלגוריתמים לזיהוי קצה ואורך סרקומר יכולה להוכיח ששינויים בתוך תא ההתכווצות של הלב קיימים בתפקוד לקוי של הלב הגלובלי. מדידת מעברי סידן מדגימה את ההשפעה של שינויים בשטף היונים ברמה התאית לתפקוד לקוי של התכווצות או הפרעות קצב.
בנוסף להשלמת מחקרי איברים שלמים, פרוטוקול זה מספק תאים שנצבעו בקלות עבור רכיבים תת-תאיים. ניתן לראות שינויים בשלד הציטו על ידי צביעת קטעי רקמה של הלב כולו; עם זאת, אדם מסוגל לדמיין רק חתך רוחב של תאים. קרדיומיוציט שלם עבה יותר מקטע הרקמה הטיפוסי, ובהתחשב בסידור ואורך הקרדיומיוציטים, קשה לראות תאים שלמים בקטע אחד. ניתן לתקן קרדיומיוציטים מבודדים באופן מיידי ולהכתים אותם עבור מגוון אלמנטים של שלד תא ותעלות יונים. ניתן להרכיב תמונות קונפוקליות לערימות z בעובי מלא של התא. בנוסף, צביעה של מיוציטים לבביים מבודדים מאפשרת צביעה של רכיבים שאי אפשר לדמיין בקטעים, כגון פלישות הממברנה הידועות בשם צינוריות T.
קיימים קווי תאים מתורבתים של מיוציטים לבביים, שלחלקם פרופילי שעתוק ומאפיינים פנוטיפיים דומים למיוציטים לבביים. חלקם, כמו קו התאים HL-1, אפילו שומרים על ארגון סרקומרי כלשהו ויכולת כיווץ בסיסית8. למרות תכונות אלה, תאים מתורבתים חסרים את צורת "קרון הקופסה" ואת מבנה צינוריות ה-T של קרדיומיוציטים ויש להם פחות ארגון סרקומרי. רכיבים אלה חיוניים לתפקודם של קרדיומיוציטים in vivo. בנוסף, שימוש בתאים מתורבתים מאפשר מניפולציה גנטית אך לא מניפולציה פיזיולוגית in vivo. קרדיומיוציטים מבודדים שומרים על הארגון התאי שלהם מספיק זמן כדי לחקור, אך עדיין ניתן לדמות אותם בקלות ואףלהפוך אותם 9. 
קרדיומיוציטים מבודדים הם מגוונים ביותר, ומספקים מצע לניתוח זהה של תאים מתנאי ניסוי מגוונים. בידוד וניתוח פיזיולוגי של מיוציטים שימשו אינספור מעבדות למגוון ניסויים, כולל חקר ההשפעה של תרופות6,7 או מולקולות קטנות10, גורמי לחץ סביבתיים11, זיהום12, מחלה13 או מוטציה גנטית14,15 על התכווצות ו/או מעברי סידן וחקר ויסות ההתכווצות ושחרור הסידן בתוך קרדיומיוציטים15-17. עם יישום כל אחד מגורמי הלחץ הללו, שינויים בתפקוד הלב יכולים לנבוע מכל שילוב של שינויים בקרדיומיוציטים עצמם ושינויים בסביבת הלב, כגון צלקות, שינויים במוליכות או שינויים במטריצה החוץ-תאית. זהו פרוטוקול אידיאלי למענה על שאלות מחקר הנוגעות למבנה ותפקוד מיוציטים בודדים בהקשר של אי ספיקת לב מכל סיבה שהיא.
למרות שיש לו אינספור יתרונות על פני טכניקות אחרות, ניתוח פיזיולוגי של קרדיומיוציטים מבודדים אינו אידיאלי לכל שאלת מחקר. בידוד הוא הליך סופני, ולכן ניתן להעריך קרדיומיוציטים רק בשלב אחד בחיי העכבר. ניתן להתגבר על כך באופן חלקי באמצעות קבוצות והקרבת עכברים בודדים לאורך התפתחות המחלה או על ידי ניטור העכבר כדי לקבוע אם יש לו אי ספיקת לב משמעותית מבחינה קלינית לפני הבידוד. למרות שפרוטוקול זה יכול לקבוע אם התרחשה הפרעה בתפקוד הקרדיומיוציטים, לא ניתן להסיק את המסקנה שתפקוד לקוי זה הוא הגורם השורש לאי ספיקת לב ללא מידע ניסיוני נוסף. ייתכן שתפקוד לקוי של קרדיומיוציטים עצמו הוא משני לשינויים אחרים בלב. למרות האתגרים הללו, חקר קרדיומיוציטים מציע מידע רב ערך בקביעת אופי התפקוד הלקוי של הלב, במיוחד בשילוב עם ניסויים אחרים. 
הפרוטוקול הבא מותאם מפרוטוקול שסופק על ידי ד"ר צ'י לים, אוניברסיטת ונדרבילט. למרות שנתוני התכווצות ושטף סידן ניתנים לשחזור ושימושיים מאוד בהשוואת לבבות עם מניפולציה גנטית או סביבתית, הבידוד עצמו נותר פרוטוקול תלוי טכניקה, הדורש אופטימיזציה. מזעור הזמן בין הוצאת הלב מהעכבר לבין החדרת הלב באמצעות צינורית אבי העורקים חיוני לעיכול איכותי. בנוסף, ניתן למטב את זמן העיכול וריכוז האנזימים עבור מיוציטים באיכות הגבוהה ביותר. שלבים שסביר להניח שדורשים מיטוב, יחד עם הצעות למיטוב, מצוינים להלן.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>RPI</td><td>S23020</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P-3911</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M-8266</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>EM Science</td><td>S320</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Fisher</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-גלוקוז</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>2,3-בוטנדיון-מונוקסים (BDM)</td><td>Sigma</td><td>B-0753</td><td></td></tr><tr><td>טאורין</td><td>Sigma</td><td>T-0625</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A-7030</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז B</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1-088-823</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז D</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1-088-882</td><td></td></tr><tr><td>פרוטאז XIV</td><td>Sigma</td><td>P-5147</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>APP Pharmaceuticals, LLC</td><td>401586D</td><td></td></tr><tr><td>איזופלואורן</td><td>באטלר שיין</td><td>11695-6776-2</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td>Teflabs</td><td>103</td><td></td></tr><tr><td>DMSO &ndash;</td><td>סיגמא</td> נטול מים <td>276855</td><td></td></tr><tr><td>מערכת קוצב תאים וניתוח פלואורסצנטי IonOptix</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 &mu; m מסנן רשת ניילון</td><td>Sefar America</td><td>Lab Pak 03-250/50</td><td></td></tr><tr><td>23 G מתאם Luer-stub</td><td>Becton Dickinson</td><td>1482619E</td><td></td></tr><tr><td>PE-50 צינורות</td><td>Becton Dickinson</td><td>427410</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד ופיזיולוגי ניתוח של שריר לב העכבר

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

קרדיומיוציטים, תא סוס העבודה של הלב, מכילים אלמנטים ציטו-שלד והתכווצות מאורגנים להפליא המייצרים את כוח ההתכווצות המשמש לשאיבת דם. קרדיומיוציטים בודדים בודדו לראשונה לפני למעלה מ-40 שנה על מנת לחקור טוב יותר את הפיזיולוגיה והמבנה של שריר הלב. הטכניקות השתפרו במהירות וכוללות עיכול אנזימטי באמצעות זלוף כלילי. לאחרונה, ניתוח ההתכווצות ושטף הסידן של מיוציטים מבודדים סיפק כלי חיוני בניתוח תאי ותת-תאי של אי ספיקת לב. אקו לב וא.ק.ג מספקים מידע על הלב ברמת האיבר בלבד. קיימות מערכות תרבית תאים קרדיומיוציטים, אך לתאים חסרים מבנים חיוניים מבחינה פיזיולוגית כגון סרקומרים מאורגנים וצינוריות T הנדרשות לתפקוד מיוציטים בתוך הלב. בפרוטוקול המוצג כאן, קרדיומיוציטים מבודדים באמצעות זלוף לנגנדורף. הלב מוסר מהעכבר, מורכב דרך אבי העורקים לצינורית, מועשר באנזימי עיכול, והתאים מוכנסים לריכוזי סידן הולכים וגדלים. תוכנת זיהוי קצה וסרקומר משמשת לניתוח התכווצות, וצבע פלואורסצנטי קושר סידן משמש להמחשת מעברי סידן של קרדיומיוציטים בקצב חשמלי; הבנה הולכת וגוברת של התפקיד ששינויים תאיים ממלאים בתפקוד לקוי של הלב. באופן מסורתי משתמשים במערכת זו לבדיקת השפעות תרופות על קרדיומיוציטים, אנו משתמשים במערכת זו כדי להשוות מיוציטים מעכברי WT ועכברים עם מוטציה הגורמת לקרדיומיופתיה מורחבת. פרוטוקול זה ייחודי בהשוואה של תאים חיים מעכברים עם תפקוד לב ידוע וגנטיקה ידועה. מצבי ניסוי רבים משווים באופן מהימן, כולל מניפולציה גנטית או סביבתית, זיהום, טיפול תרופתי ועוד. מעבר לנתונים פיזיולוגיים, קרדיומיוציטים מבודדים מקובעים ונצבעים בקלות עבור אלמנטים ציטו-שלד. בידוד קרדיומיוציטים באמצעות זלוף הוא שיטה רב-תכליתית ביותר, שימושית בחקר שינויים תאיים הנלווים או מובילים לאי ספיקת לב במגוון מצבי ניסוי.

ברגע שההתכווצות והעתקים חולפים נאספות (איור 2), הנתונים מנותחים בקלות עם התוכנה המתאימה. המעקב כל, או החלקים מן יכול להיות בממוצע (איור 3). התכווצות יכולה להיות מנותחת במגוון של דרכים. לתפקוד הסיסטולי, אחד יכול להעריך את סדר הגודל של התכווצות עם קיצור חלקי, או במהירות של התכווצות עם זמן להגיע לשיא קיצור, ומהירות התכווצות. פונקציה הדיאסטולי ניתן לנתח באופן דומה עם זמן לקיצור 50% ומהירות הרפיה. עבור ארעיים סידן, ניתן להשוות נתונים דומים הכוללים בסיס...

ניתן לבודד קרדיומיוציטים בודדים מעכברים פראיים ועכברים מוטנטיים מהלב על מנת לחקור את ההתכווצות שלהם ואת מעברי הסידן שלהם. זה מאפשר לאפיין את התרומה של תפקוד לקוי של התאים לתפקוד לקוי של הלב מכל סיבה שהיא.

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

מטרות פרוטוקול זה הן להשתמש בפרפוזיה של LOR כדי לבודד מיוציטים קרדיאליים מלבבות של עכברים בוגרים בעלי רקע גנטי ידוע, ולנתח את יכולת ההתכווצות ואת מעברי הסידן (calcium transients) של המיוציטים. לאחר הזרקת הפרין, הלב מוסר מעכבר תחת הרדמה. הוא מורכב במהירות דרך האביס (aorta) לקנולה המחוברת למזרק של תמיפת פרפוזיה.האורטה מקובעת. תפר וסחליל (buffer) מופעלים באינפוזיה איטית כדי לנקות את העורקים הכליליים. לאחר מכן, הקנולה מורכבת על מכשיר LOR עם זרימה של סחליל פרפוזיה.מבצעים עיכול של הלב באמצעות תמיסת קולגנאז ופרוטאז נטולת סידן עד להגעה למרקם רך למגע. את החדר השמאלי מניחים בבפר נטול סידן ומפזרים באמצעות פינצטה ושאיבה עדינה עם פפטה. לאחר סינון התמיסה דרך רשת, מעבירים את התאים בהדרגה לריכוזי סידן גבוהים יותר כדי להסיר תאים מתים ולהבטיח שהמיוציטים עמידים לסידן.תאים בריאים הם בעלי צורה של מוט, בעוד שתאים מתים חסרים צורה זו. לאחר מכן, המיוציטים נטענים ב-RA two, צבע רדיומטרי לקשירת סידן, ומונחים עלבמת המיקרוסקופ. לצורך הניתוח, התאים מקבלים קצב חשמלי בעוד שהכיווץ נמדג באמצעות אורך הסרקומר וזיהוי קצוות (edge detection), ותנודות הסידן נמדדות על ידי ניתוח ההסחה הספקטרלית של התאים שנטענו ב-RA two.קרדיומיופתיה מורחבת נגרמת על ידי מגוון של מוטציות. עם זאת, הבנת המכניזם העומד מאחורי מחלה זו של הלב עלולה להיות קשה. בידוד של תאי שריר הלב (cardiomyocytes) מאפשר לנו לנתח את יכולת ההתכווצות ואת תנודות הסידן של תא הלב המכווץ, ללא סידן, ובריכוז של 1.2 millimolar.ניתן להכין מראש תמיסות Calcium tyro ביום הבידוד. הכינו את בופר הפרפוזיה נטול הסידן לעיכול אנזימטי, את הבופר ואת בופרי ההעברה A ו-B בהתאם לפרוטוקול הכתוב. סננו את כל התמיסות דרך מסנן של 0.2 micron לפני השימוש.הכינו את תמיסות ההעברה אחת עד ארבע עם ריכוזי סידן עולים, על ידי ערבוב תמיסות A ו-B בהתאם לפרוטוקול הכתוב. הגדירו את קצב הזרימה של מכשיר LOR לשלושה milliliters per minute והגדירו את טמפרטורת אמבט המים במערכת הסירקולציה כך שהזרימה מהקצה של הקנולה תהיה כ-37 °C. העבירו 70% ethanol דרך המערכת למשך 15 דקות, ולאחר מכן מאה milliliters של מים, תוך וידוא שכל בועות האוויר הוסרו מהמערכת.לפני הבידוד הראשון, הכינו קנולה על ידי חיבור קטע קצר של צינור PE 50 לקצה של מתאם lure stub 20 3G, וחממו את קצה הצינור כדי ליצור שפה קטנה. חברו את הקנולה למזרק lu lock קטן ממולא בבופר פרפוזיה. ודאו שהקנולה ממולאת בבופר.הזריק לעכבר 200 heparin באמצעות הזרקה IP. התחל להזרים תמיסת פרופוזיה דרך ה-L endorf כך שהיא תעבור במלואה במערכת לפני חיבור הלב. לאחר חמש דקות, הרדם את העכבר באמצעות isof fluorine.יש לוודא כי העכבר נמצא תחת הרדמה מלאה, עד לרמת תגובה חסרה לצביטה חזקה של בהונות בשני הצדדים. פתחו את בית החזה על ידי חיתוך מתחת לעצם החזה (sternum) ומעלה משני צדי כלוב הצלעות; הוציאו את הלב במהירות, תוך הקפדה להשאיר חלק נרחב ככל האפשר מהאורטה מחובר ללב. העבירו את הלב מיד לקרח.בתוך באפר פרפוזיה קר, תוך עבודה במהירות המרבית האפשרית תחת מיקרוסקופ דיסקציה, הסר כל רקמה עודפת. פעל בזהירות כדי להסיר שומן עודף מבלי לפגוע באורטה שמתחתיו. קצץ את האורטה עד לנקודה שמתחת לענפים הראשונים.באמצעות שני זוגות של פינצטות עדינות, תפסו בזהירות את שולי האורטה ומשכו אותם בעדינות מעל קצה הקנולה. ודאו שקצה הקנולה אינו עובר דרך המסתם האורטלי אל תוך החדר השמאלי. קבעו את האורטה באמצעות לולאה קטנה של תפר 5.0.דחפו בעדינות כמות קטנה של תמיסת פופוזיה דרך הקנולה, והמתינו עד שהעורקים הכליליים יתנקו מדם. הסירו את הקנולה מהמזרק וחברו אותה למכשיר L endorf עם זרימה של תמיסת פופוזיה. היזהרו לא להחדיר בועות אוויר.אפשרו לתמיסת הפרופוזיה לזרום דרך הלב במשך שתי עד שלוש דקות. יש לבצע פרופוזיה עד שהנוזל יעבור מצבע דמי לצבע שקוף, ואז להעביר את הזרימה לתמיסת העיכול (digestion buffer) למשך שבע עד 10 דקות. לאחר שהתמימה מילאה את מערכת ה-lang endorf, ניתן להעביר את הזרימה למחזור ברגע שהלב נראה במישוש.במצב רפוי, הוציאו מהקנולה והניחו בצלחת P 60 עם Buffer a. הסירו את העליות, כלי הדם הגדולים והחדר הימני והעבירו לצלחת שנייה של buffer a, באמצעות פינצטה.הפרידו בעדינות את החדר השמאלי לחתיכות קטנות. אם הלב עבר עיכול הולם, הרקמה אמורה להיפרד בקלות. השתמשו בפיפטת העברה סטרילית של 5 µL כדי לשאוב ולשחרר בעדינות מספר פעמים לצורך פיזור נוסף של התאים. השתמשו בפיפטה סטרילית כדי להעביר את התמיסה המכילה תאים ורקמה דרך מסנן רשת ניילון של 250 micron אל תוך מבחנה קונית של 50 mL.המתינו עד שהתאים ישקעו למשך כ-10 דקות. תאים חיים ישקעו לתחתית כמשקע ותאים מתים יצופו. העבירו את המשקע למסייד העברה של סידן בריכוז 0.06 millimolar.המתינו 10 דקות, שאבו את supernatant המכיל את התאים המתים, והעבירו את המשקע לתמיסת סידן בריכוז 0.24 millimolar. חזרו על פעולות השקיעה, השאיבה וההעברה דרך תמיסות סידן בריכוזים עולים עד שהתאים ישקעו במסיינ (transfer buffer) סידן בריכוז 1.2 millimolar. בנקודה זו, המשקע יכיל תאים בריאים רבים בעלי צורה מוטית, שאינם מתכווצים באופן ספונטני, כדי להטעין תאים עם כמות מופחתת של צבע או ללא צבע.העבר 1 mL של תאים שהושעו לשפופרת Eppendorf של 1 mL. הוסף 1 µL של fira two בריכוז 1 mM ב-DMSO אנहाइडר. ערבב על ידי היפוך עדין של השפופרת.המתינו 15 עד 20 דקות בחשיכה עד להשקעת התאים. לאחר השקיעה, שטפו את התאים על ידי שאיבת הנוזל העליון והוספת תמיסת calcium tyro בריכוז 1.2 millimolar. ערבבו והמתינו חמש עד 10 דקות נוספות עד שהתאים ישקעו. לאחר מכן, חזרו על פעולת השטיפה.הכינו את המיקרוסקופ ההפוך לאיסוף הנתונים. ראשית, הניחו כיסוי זכוכית על תבנית במה המיועדת לשאיבת פרפוזיה ולגירוי חשמלי של תאים. אם משתמשים בעדשה שמנית, הניחו טיפה של שמן על עדשת ה-40 x והניחו את תבנית הבמה על המיקרוסקופ.חברו את האלקטרודות. הגדירו מערכת של perfusion מחוממת המונעת על ידי כוח הכבידתו עבור תמיסת calcium tyro בריכוז 1.2 millimolar, וחברו את השאיבה לוואקום. הדליקו את המיקרוסקופ ואת מערכת ה-cell pacer.פתח את תוכנת ה-ion wizard. טען מספר טיפות של תאים טעונים בודדים או שניים על הבמה תוך חסימת זרימת הפרפוזיה. כדי לאפשר לתאים בריאים לשקוע, השב את הפרפוזיה; רבים מהתאים המתים שנותרו יישטפו החוצה.השתמשו בעין התצפית כדי לאתר תא בריא בעל צורה של מוט המתכווץ בעקבות גירוי חשמלי של 5 עד 20 וולט באופן ספונטני; יש להימנע מתאים מתכווצים בשל דליפה של הממברנה. העבירו את הפלט הוויזואלי למצלמה. כווננו את סיבוב העדשה כך שהתא יהיה גלוי בחלון התצוגה.כוון את הצמצם כך שרוב הרקע יוסר. מקם את סמן מדידת הסרקומר מעל אזור בתא בעל סרקומרים אחידים. שנה את גודל התיבה במידת הצורך כדי להבטיח שהסמן אינו מכסה אוכלוסיות שונות, אם חפץ בכך.יישרו גם את פסי זיהוי הקצוות (edge detection Bars). התחילו בגירוי החשמלי המחזורי (pacing) של התאים 10 עד 15 שניות לפני תחילת הניסוי. התחילו בהקלטה.נתחו את עקומות הקיצור של הסרקומר ואת יחסי ה-URA באמצעות תוכנת ion wizard. השוואות אפשריות בין קרדיומיוציטים מסוג בר (wild type) לבין קרדיומיוציטים עם נוק-אאוט (knockout) כוללות קיצור שברי, זמן לשיא הקיצור וזמן ל-50% מההשחרור לצורך ניתוח כושר התכווצות, וכן Baseline, שיא, זמן לשיא וזמן ל-50% מה-Baseline של יחסי ה-fura-2 להערכת שטף סידן. התאים שהופקו באמצעות פרוטוקול זה אידיאליים עבור ניסויים והליכים רבים אחרים, כולל צביעה של רכיבים תת-תאיים ותרבית לטווח קצר.כעת, לאחר שצפית בסרטון זה, אתה אמור להיות מסוגל לבודד תאי שריר לב (cardiomyocytes) מעכברים מסוג בר (wild type) ומעכברים עם נוק-אאוט (knockout), ולהנתח את יכולת ההתכווצות ואת תנודות הסידן (calcium transients) של תאים אלו. בהצלחה בניסוי שלך.

isolation-and-physiological-analysis-of-mouse-cardiomyocytes

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

תרבויות cardiomyocyte העכבר ראשיים הן אחד הכלים המרכזיים לחקירה של ארגון ותפקוד myofibrillar. הפרוטוקול הבא מתאר את הבידוד והתרבות של שריר לב עיקרי מלב עכבר בילוד. תרבויות cardiomyocyte וכתוצאה מכך עשויות לשמש בהמשך עבור מגוון רחב של מבחני ביומכנית, ביוכימי ותא ביולוגי.

בידוד והתרבות של שריר לב עכבר בילוד

כאן אנו מתארים את הבידוד של cardiomyoctyes עכבר המבוגר באמצעות מערכת זלוף Langendorff. תאים וכתוצאה מכך הם Ca2 +, סובלניים, חשמלי שקט ויכולים להיות מתורבת וtransfected עם אדנו או lentiviruses כדי לתפעל ביטוי גנים. הפונקציונליות שלהם יכולה גם להיות מנותחת באמצעות מערכת MMSYS וטכניקות תיקון מהדק.

בידוד, תרבות ואפיון פונקציונלי של Cardiomyoctyes מאוס למבוגרים

אנו מתארים שיטה אמינה לבידוד של שריר לב עכבר בוגר. פרוטוקול זה מניב תוצאה עקבית לתרבות של שריר לב בוגר מתפקד ממגוון רחב של עכברים מהונדסים גנטי.

בידוד והתרבות של שריר לב מאוס למבוגרים לתא איתות ו<em&gt; במבחנה</em&gt; לב היפרטרופיה

פרוטוקול זה מתאר שיטה שלב אחר שלב לבידוד הניתן לשחזור ותרבית ארוכת טווח של קרדיומיוציטים של עכברים בוגרים עם תפוקה, טוהר וכדאיות גבוהים.

בידוד, תרבות התמרה של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

המטרה הכוללת של מאמר זה היא כדי לתקנן את הפרוטוקול עבור בידוד, אפיון, התמיינות של תאי גזע הלב (CSCs) מהלב העכבר למבוגרים. כאן, אנו מתארים שיטה צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות לבודד CSCs מאתר ושיטות הארוטיות תרבות CSC, התפשטות של בידול לתוך cardiomyocytes.

בידוד, אפיון, התמיינות של תאי גזע הלב מהלב העכבר למבוגרים

הפרוטוקול הזה משמש כדי לבודד פרפור לב בודד מהלב של העכבר המבוגר באמצעות הגישה העיכול קטע. גישה זו משמשת כדי לבודד את הפרפור הימני או השמאלי, שניתן להשתמש בו כדי לאפיין את פרפור מיציט אלקטרופיזיולוגיה במחקרים הדבקת מהדק.

בידוד של פרפור מיוציטים מעכברים למבוגרים

מוצג הוא פרוטוקול לבידוד של קרדיומיוציטים חדריים אנושיים ובעלי חיים מפרוסות שריר הלב לחתוך vibratome. תפוקות גבוהות של תאים סובלניים סידן (עד 200 תאים / מ"ג) ניתן להשיג כמויות קטנות של רקמה (&lt;50 מ"ג). הפרוטוקול ישים על שריר הלב החשוף לאישמיה קרה עד 36 שעות.

בידוד של קרדיומיוציטים חדריים אנושיים מפרוסות שריר הלב ויסטום-לחתוך

פיתחנו שיטה פישוטe לבידוד תאי לב בודדים באיכות גבוהה על ידי טכניקת זלוף antegrade. שיטה זו היא נטולת לנגנדורף ושימושית לבידוד מיוציטים חדריים ופרונליים או תאים ביניים, כגון פיברובלסטים לבביים או אבות.

שיטת זלוף Antegrade לבידוד קרדיומיוציטים מעכברים

מודלים עכבריים מאפשרים ללמוד מנגנוני מפתח של arrhythmogenesis. לשם כך, קרדיומיוציטים באיכות גבוהה נחוצים לביצוע מדידות מהדק תיקון. כאן מתוארת שיטה לבידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדרי מורין באמצעות זילוח לנגנדורף מבוסס אנזים מדרדר, המאפשר מדידות בו זמנית של סידן חולף וזרם סידן מסוג L.

בידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדריים באיכות גבוהה למדידות בו זמנית של Ca2+ Transients וזרם סידן מסוג L

תקן הזהב בקרדיולוגיה לניסויים פונקציונליים תאיים ומולקולריים הוא קרדיומיוציטים. מאמר זה מתאר התאמות לטכניקה שאינה לנגנדורף לבידוד קרדיומיוציטים של עכברים.

שיטה פשוטה ויעילה לבודד באופן עקבי קרדיומיוציטים עכבר

למדו בידוד מיוצים לבביים מלב עכבר בוגר באמצעות פרפוזיה LOR לניתוח כיווציות ומתארי סידן. שיטה זו מאפשרת חקירת תפקוד תאי לב ותרומות גנטיות לפגיעה לבבית.

בידוד ופיזיולוגי ניתוח של שריר לב העכבר

גלה סרטונים נוספים