איסוף וניתוח של ארבידופסיס השיפה exudates שימוש בשיטת EDTA-הקלה
23 באוקטובר 2013
ידע של ההרכב של SAP השיפה כמו גם את המנגנון של התחבורה והטעינה למרחקים ארוכים שלה הוא חיוני להבנה של איתות למרחקים ארוכים בפיתוח ומתח / תגובת פתוגן צמח ולהטמיע תחבורה. כתב יד זה מתאר את האוסף של פליטות השיפה בשיטה EDTA-הקל.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לאסוף הפרשות פלום מארבידופסיס או מצמחים אחרים כדי לנתח את תכולתו או לאשר נוכחות של תרכובות בתוך זרם הפלום. זה מושג על ידי חיתוך ודגירה ראשונית של עלי הכותרת באשלגן EDTA כדי למנוע איטום של יסוד הים. השלב השני הוא לשטוף היטב את עלי הכותרת כדי להסיר את כל ה-EDTA שנותר שעלול להפריע לניתוח שלאחר מכן וגם לפגוע בתאים במהלך חשיפה ארוכת טווח.
לאחר מכן, הפרשות הזרימה של EM נאספות למים. השלב האחרון שלה הוא הכנת דגימות לניתוח עוקב על ידי ג'ל L-C-M-S-G-C-M-S, אלקטרופורזה וכרומטוגרפיה של שכבה דקה. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בהפרשת ה-phem הקלה על ידי EDTA כדי לנתח ולאשר תכולת phem כמו מטבוליטים ושומנים, חלבונים או RNAs.
צמחים אינם יכולים להימלט מתנאים קשים. כתוצאה מכך, הם דורשים מערכות יעילות ומהירות מאוד להעברת אותות סביבתיים ברחבי הצמחים ולהגיב על ידי שינוי ההתפתחות. אחד ממסלולי האיתות הללו הוא זרימת הצמח, שהיא די מורכבת להבנת הרכבו.
אנו משתמשים בטשטוש הזרימה הקל של EDTA לאיסוף וניתוח של תכולת הזרימה. הוא פותח במקור בפרילה על ידי מלך אך ניתן בקלות לשינוי עבור מינים אחרים. ידגימו את ההליך אלנה וארה"ב, שניהם סטודנטים לתואר ראשון מהמעבדה שלי לפני תחילת הליך זה.
Grow Arabidopsis מתכננת ארבעה עד שישה שבועות בתאי גידול עם תקופת צילום של 12 שעות ביום האיסוף. מדולל הכין בעבר תמיסת אשלגן EDTA של 100 מילימולר עם מים כדי לתת ריכוז סופי של 20 מילימולר. לאחר מכן, מלאו שתי צלחות זכוכית בקוטר שבעה עד 15 ס"מ באמצע הדרך בתמיסת אשלגן EDTA בגודל 20 מילי-מולרי.
בסיום, מלאו צינורות תגובה של 1.7 מיליליטר ב-1.4 מיליליטר מתמיסת אשלגן EDTA בגודל 20 מילי-מולרי. לאחר מכן מלאו מספר שווה של צינורות תגובה ב -1.4 מיליליטר מים מיליפור. לאחר הוצאת צמחים בני ארבעה עד שישה שבועות מתאי הגידול, קצרו את עלי הרוזטה על ידי חיתוך בעזרת סכין גילוח בבסיס עלי הכותרת קרוב למרכז הרוזטה.
מניחים מיד את העלים בכלים המכילים 20 מילימולר אשלגן EDTA כשהקצה החתוך של הפאול שקוע בתמיסה. לאחר שנאספו 15 עלים משלושה עד ארבעה צמחים, ערמו אותם בעדינות זה על גבי זה כך שעלי הכותרת החתוכים מיושרים זה עם זה. חותכים מחדש את בסיס עלי הכותרת ומגלגלים בעדינות את העלים.
לאחר מכן, הכנס בעדינות את העלים המגולגלים לאחד מצינורות התגובה המכילים 20 מילי-מולרי אשלגן EDTA לאיסוף הפרשות. בחושך מרפדים את תחתית צלחת רדודה גדולה במגבות נייר רטובות. מקם את המתלה עם צינורות התגובה המלאים בעלים בכלי והניח אותו בשקית ניילון שחורה עם חריצים לאוורור.
לאחר מכן הנח את כל ההתקנה בארון לאיסוף אקסודאט. בקו האור תחתית מיכל פרספקס שקוף עם מגבות נייר רטובות. הניחו את המתלה עם צינורות התגובה המלאים בעלים במיכל וסגרו אותו.
לאחר הוצאת המתלה מהמיכל, כעבור שעה, הוציאו את העלים מצינורות התגובה. שוטפים היטב את העלים במים מזוקקים כדי להסיר את כל ה-EDTA. העבירו מיד את העלים לצינורות התגובה המכילים מיליפור מים והחזירו אותם למיכלים הלחים לאיסוף הפרשות לאחר הוצאת המתלה מהמיכל הלח.
חמש עד שמונה שעות לאחר מכן, הוציאו את העלים מהצינורות, ואז הקפיאו את הפרשות הזרימה בחנקן נוזלי ואחסנו אותם במקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס. להמשך ניתוח למחרת, יש להפשיר את הדגימות כהכנה לניתוח שומנים. לאחר מכן משוך שתיים עד שלוש דגימות והוסף כמות שווה של כלורופורם ומתנול לתמיסה המשולבת.
מערבלים את התערובת למספר שניות. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה למשך ארבע דקות ב -400 גרם. בסיום, אוספים את השלב האורגני התחתון בצינור זכוכית לאחר חזרה על המחיצה עם השלב העליון, שלוש פעמים נוספות, מייבשים את השלבים האורגניים המשולבים תחת זרם חנקן ומגישים לכרומטוגרפיה של שכבה דקה וניתוח LCMS.
שיטה זו מאפשרת לקצור מספיק הפרשות פם כדי לזהות חלבונים מקומיים של פם ואת השינויים ברמתם בתגובה להתפתחות או לחץ. במקרים מסוימים, חוקרים עשויים לרצות להשתמש במעכבי פרוטאינאז כדי למנוע פירוק של חלבונים. כפי שמוצג כאן, חלבונים נמצאים בשפע נמוך מאוד, אך רמתם גבוהה מספיק לניסויי פרוטאומיקה הבאים.
שימוש ב-LCMS או לניתוח כתמים מערביים ממצאים בקוקורביטים מצביעים על כך שכריתת ה-STEM מובילה לשיבוש באיזון פוטנציאל המים ולזרם מים ומזהמים אפשריים מהאלסט. עם זאת, איסוף לזמנים הנעים בין שעה לשמונה שעות אינו משפיע על פרופיל חלבון M הזרימה וההרכב InOpSys. כמות החלבון שנאספה ודפוס החלבונים שנמצאו משתנים בין מינים וטיפולים.
כתוצאה מכך, ניתן לדמיין, לזהות ולעקוב אחר אותות חלבון. ניתן לזהות mRNA ומיקרו-RNA גם בהפרשות פלום בשיטה זו. עם זאת, טיפול במעכב RNA נחוץ כדי למנוע פירוק של ה-MR. NA במהלך זמן ההפרשה הממושך.
מכיוון שיסודות C אינם מכילים כלורופלסטים פונקציונליים, רוביס, תת-יחידות mRNA קטנות או גדולות יכולים לשמש כבקרות שליליות בעוד ש-mRNA מקומי ידוע של שפעת שפעת כמו אנזים מצומד יוביקוויטין עשוי לשמש כבקרה חיובית. באופן דומה, ניתן לנתח סוכרים או מטבוליטים קטנים באמצעות GCMS או LCMS. יש להזכיר כי הפרשות הפם מכילות מספר רב של אנזימים פונקציונליים, כולל כמעט כל המסלול הגליקוליטי.
לפיכך, שימוש במספר נקודות זמן עשוי לחשוף תהליכים מטבוליים במהלך איסוף ההפרשות. בכל ההפרשות, סוכרוז הוא המטבוליט הנפוץ ביותר. זה ברור ביותר לאחר איסוף של שעה.
עם זאת, לאחר חמש שעות, יחס הסוכרוז לפרוקטוז מצטמצם מעט. אם אותה הפרשה נאספת למשך שעה אחת ואז משאירה אותה על הספסל למשך ארבע שעות נוספות, יחס הסוכרוז לפרוקטוז מצטמצם במידה גדולה בהרבה. מה שמצביע על כך שאנזימים פעילים בהפרשות ה-phem מובילים לפירוק הסוכרוז בטמפרטורת החדר.
בנוסף, העובדה שאיסוף רציף במשך חמש שעות מראה רק ירידה קלה ביחס סוכרוז לפרוקטוז עולה בקנה אחד עם הממצאים שהעמסת phem והובלה של מולקולות מתאים נלווים ליסודות הים עשויים להימשך במהלך ההפרשה עד שהמערכת מאבדת את חיוניותה. ליפידים בהפרשות הפם ובהרחבה איתות שומנים למרחקים ארוכים הם תחום עניין חדש למדי במדעי הצמח. בשל אופיים ההידרופובי, שומנים קיימים רק בריכוזים נמוכים ועשויים להיות קשורים למולקולות אחרות לצורך המסה.
עם זאת, ההפרשה הקלה על ה-EDTA מאפשרת איסוף של חומר מספיק כדי לדמיין ולזהות זרימה ושומנים מכמה מיני צמחים. כפי שמוצג כאן, ניתן להפריד מספר מיני ליפידים באמצעות כרומטוגרפיה של שכבה דקה. LCMS מאפשר לזהות מיני שומנים שונים ולעקוב אחר שינויים בפרופילי השומנים של גנוטיפים או טיפולים שונים.
זה מאפשר לחקור את תפקיד השומנים במהלך התפתחות הצמח ותגובת הלחץ. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו ועד שלוש שעות אם היא מבוצעת כראוי. עם זאת, עבור רוב הדגימות, היינו מציעים זמן איסוף של חמש עד שמונה שעות.
במקרה זה, מומלץ להתחיל מוקדם בבוקר של קציר העלים. ניתן לשנות הליך זה עבור צמחים אחרים ויכול להוביל לגילוי או אישור של תרכובות זרימה חדשות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעקוב אחר ה-PDLs ביסודיות לאחר השעה הראשונה כדי להסיר את ה-EDTA ולא לסחוט את העלים כדי למנוע זיהום בתוכן של תאים אחרים.
בנוסף, לבישת כפפות גם מגנה על הדגימות שלך מפני מזהמים שאתה עלול להכניס מהעור שלך כדי למנוע זיהום, השתמש בבקרות המתאימות לדגימות RNA או מטבוליט חלבון. בקרות מוצעות מפורטות בפרוטוקול הטקסט. שיטה זו אפשרה לנו לקבל תובנות חדשות לגבי הרכב זרימת הצמח.
הצלחנו לזהות מספר ליפידים בתוך הצורה אקסודאט, שלא היו צפויים בסביבה המימית של הרצפה. זה הוביל אותנו ואחרים להציג את הרעיון של איתות שומנים למרחקים ארוכים, שהתפתח כעת למחקר חדש ומרגש של שתלי שדה.
סקירה כללית
מחקר זה מתאר שיטה לאיסוף הפרשות פלואם מצמחים, ובאופן ספציפי מ-Arabidopsis, תוך שימוש בגישה המסייעת EDTA. הבנת הרכב מיץ הפלואם היא חיונית להבנת תהליכי איתות בצמחים ותגובות למעקה סביבתי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של צמחים
- מנגנוני הובלה בפלואה
- ניתוח מטבוליטים
רקע
- מיציי הפלואם ממלאים תפקיד חיוני באיתות למרחקים ארוכים בצמחים.
- הסעה יעילה של רכיבי תזונה ואותות חיונית להתפתחות הצמח.
- השיטה המסייעת על ידי EDTA מאפשרת איסוף יעיל של הפרשות פלואם.
- הבנת הרכב הפלואום מסייעת בחקר תגובותי הצמח למעקה ולפתוגנים.
מטרת המחקר
- לאסוף ולנתח הפרשות מהפלוארה של Arabidopsis וצמחים אחרים.
- לאשש את נוכחותם של מטבוליטים, חלבונים ו-RNAs במי הפלוארה.
- לחקור את מסלולי השליחויות המעורבים בתגובות צמחים לתנאים סביבתיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דגירה של עלי כותרת של צמחים ב-potassium EDTA כדי למנוע את חסימת אלמנטי הנפה.
- איסוף הפרשות מהפלואם למבחנות תגובה לצורך אנליזה.
- שימוש ב-LC-MS, GC-MS וכרומטוגרפיית שכבה דקה לאנליזה של מטבוליטים.
- הקפאה והפשרה של דגימות להמשך אנליזה של חלבונים ו-RNAs.
תוצאות עיקריות
- איסוף מוצלח של הפרשות פלואה בכמות מספיקה למחקרי פרוטאומיקה ומטבוליזומיקה.
- זיהוי חלבונים ומטבוליטים, כולל סוכרוז כמטבוליט השכיח ביותר.
- הדגמת ישימותה של השיטה במגוון מיני צמחים.
- תובנות לגבי הדינמיקה של הרכב הפלואה בתגובה לתנאי התפתחות ומצבי עקה.
מסקנות
- השיטה המתווכת על ידי EDTA יעילה לחקר הפרשות מהפלואם.
- ניתוח של מיץ הפלואם יכול לחשוף מידע חשוב על אותיות ומטבוליזם בצמחים.
- ניתן להתאים גישה זו למינים שונים של צמחים כדי להגביר את ההבנה של תפקודי הפלואם.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הבנת הרכב הפלואם מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית בתהליכי תיקוף מטרות עבור יישומים ביו-פרמצבטיים מבוססי צמחים, ובמיוחד בניתוח מטבוליטים ומסלולי איתות. שיטת ההפרשה המתווכת על ידי EDTA תומכת בביטחון חיזוי על ידי מתן גישה הדירה לתכולת הפלואם במינים שונים, ובכך מסייעת לתהליכי עבודה בשלבי הגילוי המוקדמים. גישה זו משפרת את הרצף התרגומי משלב הגילוי ועד להערכה פרה-קלינית של תרכובות המופקות מצמחים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היпотеזות טיפוליות באמצעות ניתוח של מטבוליטים, חלבונים ו-RNAs הממוקמים בפלואה (phloem) ומעורבים במסלולי איתות של עקה.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות תיקוף תפקודי של מטרות, תוך שימוש בפרופילים של סוכרוז, ליפידים וחלבונים כסממנים ביולוגיים לשלמות הפלואה ולפעילותה.
- ערך ניבוי: מסייע במיון תיקי פיתוח על ידי קישור שינויים בהרכב הפלואה למצבי התפתחות או עקה, ובכך מספק מידע לקבלת החלטות לגבי המשך או הפסקת תהליכים (go/no-go) בסריקת תרכובות מבוססות צמחים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות מתוקפות לתהליכי עבודה המשכיים על ידי הפקת הפרשות המתאימות לניתוח מטבוליטים וליפידים בשיטות LC-MS, GC-MS וכרומטוגרפיה בשכבה דקה.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות של הבדיקה באמצעות זמני איסוף מבוקרים של ההפרשות ושלבי הסרה של EDTA, ובכך מפחית את השונות בתוצרי סריקת התרכובות.
- יכולת הרחבה: מאפשר הערכה אמינה של תרכובות במיני צמחים עשביים ועציים במינימום ציוד, דבר התומך בשימוש חוזר בפלטפורמה במסלולי גילוי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: דן ברלוונטיות למחלה באמצעות ניתוח של סיגנל lipid ואנזימים גליקוליטיים בתמציות פלוэм, בקו התואם לגילוי ביומרקרים תרגומיים בתגובות למעיקה בצמחים.
- ערך תפעולי: מתאר רציפות משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני על ידי מתן אפשרות לאפיון אורכי של מטאבוליטים וחלבונים בפלו噉 לאורך נקודות זמן וטיפולים שונים.
- קידום מותאם סיכון: תומך בהחלטות לגבי קידום תרכובים שמקורם בצמחים על ידי זיהוי ביומרקרים יציבים (למשל, יחסי sucrose) המשקפים את חיוניות הטעינה וההובלה בפלו噉.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזות ועד לזיהוי מובילים, ותומכת בניתוח של מטבוליטים, חלבונים וליפידים המופקים מהפלואם ב-Arabidopsis ובמינים אחרים.
- ביולוגיה של התגליות: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי מתן אפשרות לניתוח תרכובים הממוקמים בפילואם (phloem) המעורבים באיתותי דחק ובזרימה מטבולית.
- סריקה: מתארת מוכנות של הבדיקה באמצעות שלבים סטנדרטיים של איסוף וטיהור הפרשות, מה שמבטיח פלט כמותי הניתן לשחזור לסריקת מטבוליטים וליפידים.
- אנליטיקה: מדגישה את LC-MS, GC-MS וכרומטוגרפיה בשכבה דקה כטכניקות אנליטיות מרכזיות המייצרות מערכי נתונים ברי-השוואה להערכת השפעות של תרכובים על הרכב הפילואם.
- מחקר תרגומי: מקשרת את השיטה לרציפות פרה-קלינית על ידי מתן אפשרות למעקב אחר סממנים ביולוגיים של ליפידים וחלבונים לאורך תנאי התפתחות ודחק, ובכך תומכת בקידום מותאם סיכונים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציבה את השיטה המסייעת על ידי EDTA כיכולת הניתנת לשימוש חוזר במגוון מיני צמחים ובמעבדות שונות, ובכך מפחיתה את התלות בציוד מיוחד לניתוח פילואם.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: ביטחון חיזויי בתיקוף מטרות, צמצום העמימות המכניסטית במסלולי סיגנלציה של הפלואם וגילוי סמנים ביולוגיים לתגובת מאמץ.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, שחזוריות ויכולת הרחבה של איסוף הפרשות במגוון מינים ובסביבות מעבדה שונות.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות מושכלת יותר לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go), יעילות הון באמצעות הפחתת נשירה בשלבים מאוחרים של פיתוח תרכובים מבוססי צמחים, והפחתת סיכון ביולוגי בבחירת מטרות.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף והחלטות קידום מותאמות סיכון, המבוססות על פרופילים כמותיים של חלבונים ומטבוליטים בפלואם.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בפיזיולוגיה של צמחים ובניתוח מטבוליטים כדי להבחין בין הפרשות פלועם אמיתיות לבין מזהמים תאיים.
- תלוי בגישה למכשור LC-MS, GC-MS ואלקטרופורזה לצורך אפיון מקיף של ההפרשות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי שטיפת EDTA ותזמון האיסוף כדי להבטיח הדירות בין מעבדות.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום השיטה על מינים עציים לעומת מינים עשביים, בשל הבדלים בקינטיקה של איטום הפלועם.
- מגבלה מעשית: כימות יחסי בלבד, כיוון שהשיטה מתבססת על הפרשה ולא על איסוף ישיר של מי פלועם, דבר הדורש אסטרטגיות נורמליזציה להשוואות בין דגימות.
