איסוף וניתוח של ארבידופסיס השיפה exudates שימוש בשיטת EDTA-הקלה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לאסוף הפרשות פלום מארבידופסיס או מצמחים אחרים כדי לנתח את תכולתו או לאשר נוכחות של תרכובות בתוך זרם הפלום. זה מושג על ידי חיתוך ודגירה ראשונית של עלי הכותרת באשלגן EDTA כדי למנוע איטום של יסוד הים. השלב השני הוא לשטוף היטב את עלי הכותרת כדי להסיר את כל ה-EDTA שנותר שעלול להפריע לניתוח שלאחר מכן וגם לפגוע בתאים במהלך חשיפה ארוכת טווח.

לאחר מכן, הפרשות הזרימה של EM נאספות למים. השלב האחרון שלה הוא הכנת דגימות לניתוח עוקב על ידי ג'ל L-C-M-S-G-C-M-S, אלקטרופורזה וכרומטוגרפיה של שכבה דקה. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בהפרשת ה-phem הקלה על ידי EDTA כדי לנתח ולאשר תכולת phem כמו מטבוליטים ושומנים, חלבונים או RNAs.

צמחים אינם יכולים להימלט מתנאים קשים. כתוצאה מכך, הם דורשים מערכות יעילות ומהירות מאוד להעברת אותות סביבתיים ברחבי הצמחים ולהגיב על ידי שינוי ההתפתחות. אחד ממסלולי האיתות הללו הוא זרימת הצמח, שהיא די מורכבת להבנת הרכבו.

אנו משתמשים בטשטוש הזרימה הקל של EDTA לאיסוף וניתוח של תכולת הזרימה. הוא פותח במקור בפרילה על ידי מלך אך ניתן בקלות לשינוי עבור מינים אחרים. ידגימו את ההליך אלנה וארה"ב, שניהם סטודנטים לתואר ראשון מהמעבדה שלי לפני תחילת הליך זה.

Grow Arabidopsis מתכננת ארבעה עד שישה שבועות בתאי גידול עם תקופת צילום של 12 שעות ביום האיסוף. מדולל הכין בעבר תמיסת אשלגן EDTA של 100 מילימולר עם מים כדי לתת ריכוז סופי של 20 מילימולר. לאחר מכן, מלאו שתי צלחות זכוכית בקוטר שבעה עד 15 ס"מ באמצע הדרך בתמיסת אשלגן EDTA בגודל 20 מילי-מולרי.

בסיום, מלאו צינורות תגובה של 1.7 מיליליטר ב-1.4 מיליליטר מתמיסת אשלגן EDTA בגודל 20 מילי-מולרי. לאחר מכן מלאו מספר שווה של צינורות תגובה ב -1.4 מיליליטר מים מיליפור. לאחר הוצאת צמחים בני ארבעה עד שישה שבועות מתאי הגידול, קצרו את עלי הרוזטה על ידי חיתוך בעזרת סכין גילוח בבסיס עלי הכותרת קרוב למרכז הרוזטה.

מניחים מיד את העלים בכלים המכילים 20 מילימולר אשלגן EDTA כשהקצה החתוך של הפאול שקוע בתמיסה. לאחר שנאספו 15 עלים משלושה עד ארבעה צמחים, ערמו אותם בעדינות זה על גבי זה כך שעלי הכותרת החתוכים מיושרים זה עם זה. חותכים מחדש את בסיס עלי הכותרת ומגלגלים בעדינות את העלים.

לאחר מכן, הכנס בעדינות את העלים המגולגלים לאחד מצינורות התגובה המכילים 20 מילי-מולרי אשלגן EDTA לאיסוף הפרשות. בחושך מרפדים את תחתית צלחת רדודה גדולה במגבות נייר רטובות. מקם את המתלה עם צינורות התגובה המלאים בעלים בכלי והניח אותו בשקית ניילון שחורה עם חריצים לאוורור.

לאחר מכן הנח את כל ההתקנה בארון לאיסוף אקסודאט. בקו האור תחתית מיכל פרספקס שקוף עם מגבות נייר רטובות. הניחו את המתלה עם צינורות התגובה המלאים בעלים במיכל וסגרו אותו.

לאחר הוצאת המתלה מהמיכל, כעבור שעה, הוציאו את העלים מצינורות התגובה. שוטפים היטב את העלים במים מזוקקים כדי להסיר את כל ה-EDTA. העבירו מיד את העלים לצינורות התגובה המכילים מיליפור מים והחזירו אותם למיכלים הלחים לאיסוף הפרשות לאחר הוצאת המתלה מהמיכל הלח.

חמש עד שמונה שעות לאחר מכן, הוציאו את העלים מהצינורות, ואז הקפיאו את הפרשות הזרימה בחנקן נוזלי ואחסנו אותם במקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס. להמשך ניתוח למחרת, יש להפשיר את הדגימות כהכנה לניתוח שומנים. לאחר מכן משוך שתיים עד שלוש דגימות והוסף כמות שווה של כלורופורם ומתנול לתמיסה המשולבת.

מערבלים את התערובת למספר שניות. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה למשך ארבע דקות ב -400 גרם. בסיום, אוספים את השלב האורגני התחתון בצינור זכוכית לאחר חזרה על המחיצה עם השלב העליון, שלוש פעמים נוספות, מייבשים את השלבים האורגניים המשולבים תחת זרם חנקן ומגישים לכרומטוגרפיה של שכבה דקה וניתוח LCMS.

שיטה זו מאפשרת לקצור מספיק הפרשות פם כדי לזהות חלבונים מקומיים של פם ואת השינויים ברמתם בתגובה להתפתחות או לחץ. במקרים מסוימים, חוקרים עשויים לרצות להשתמש במעכבי פרוטאינאז כדי למנוע פירוק של חלבונים. כפי שמוצג כאן, חלבונים נמצאים בשפע נמוך מאוד, אך רמתם גבוהה מספיק לניסויי פרוטאומיקה הבאים.

שימוש ב-LCMS או לניתוח כתמים מערביים ממצאים בקוקורביטים מצביעים על כך שכריתת ה-STEM מובילה לשיבוש באיזון פוטנציאל המים ולזרם מים ומזהמים אפשריים מהאלסט. עם זאת, איסוף לזמנים הנעים בין שעה לשמונה שעות אינו משפיע על פרופיל חלבון M הזרימה וההרכב InOpSys. כמות החלבון שנאספה ודפוס החלבונים שנמצאו משתנים בין מינים וטיפולים.

כתוצאה מכך, ניתן לדמיין, לזהות ולעקוב אחר אותות חלבון. ניתן לזהות mRNA ומיקרו-RNA גם בהפרשות פלום בשיטה זו. עם זאת, טיפול במעכב RNA נחוץ כדי למנוע פירוק של ה-MR. NA במהלך זמן ההפרשה הממושך.

מכיוון שיסודות C אינם מכילים כלורופלסטים פונקציונליים, רוביס, תת-יחידות mRNA קטנות או גדולות יכולים לשמש כבקרות שליליות בעוד ש-mRNA מקומי ידוע של שפעת שפעת כמו אנזים מצומד יוביקוויטין עשוי לשמש כבקרה חיובית. באופן דומה, ניתן לנתח סוכרים או מטבוליטים קטנים באמצעות GCMS או LCMS. יש להזכיר כי הפרשות הפם מכילות מספר רב של אנזימים פונקציונליים, כולל כמעט כל המסלול הגליקוליטי.

לפיכך, שימוש במספר נקודות זמן עשוי לחשוף תהליכים מטבוליים במהלך איסוף ההפרשות. בכל ההפרשות, סוכרוז הוא המטבוליט הנפוץ ביותר. זה ברור ביותר לאחר איסוף של שעה.

עם זאת, לאחר חמש שעות, יחס הסוכרוז לפרוקטוז מצטמצם מעט. אם אותה הפרשה נאספת למשך שעה אחת ואז משאירה אותה על הספסל למשך ארבע שעות נוספות, יחס הסוכרוז לפרוקטוז מצטמצם במידה גדולה בהרבה. מה שמצביע על כך שאנזימים פעילים בהפרשות ה-phem מובילים לפירוק הסוכרוז בטמפרטורת החדר.

בנוסף, העובדה שאיסוף רציף במשך חמש שעות מראה רק ירידה קלה ביחס סוכרוז לפרוקטוז עולה בקנה אחד עם הממצאים שהעמסת phem והובלה של מולקולות מתאים נלווים ליסודות הים עשויים להימשך במהלך ההפרשה עד שהמערכת מאבדת את חיוניותה. ליפידים בהפרשות הפם ובהרחבה איתות שומנים למרחקים ארוכים הם תחום עניין חדש למדי במדעי הצמח. בשל אופיים ההידרופובי, שומנים קיימים רק בריכוזים נמוכים ועשויים להיות קשורים למולקולות אחרות לצורך המסה.

עם זאת, ההפרשה הקלה על ה-EDTA מאפשרת איסוף של חומר מספיק כדי לדמיין ולזהות זרימה ושומנים מכמה מיני צמחים. כפי שמוצג כאן, ניתן להפריד מספר מיני ליפידים באמצעות כרומטוגרפיה של שכבה דקה. LCMS מאפשר לזהות מיני שומנים שונים ולעקוב אחר שינויים בפרופילי השומנים של גנוטיפים או טיפולים שונים.

זה מאפשר לחקור את תפקיד השומנים במהלך התפתחות הצמח ותגובת הלחץ. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו ועד שלוש שעות אם היא מבוצעת כראוי. עם זאת, עבור רוב הדגימות, היינו מציעים זמן איסוף של חמש עד שמונה שעות.

במקרה זה, מומלץ להתחיל מוקדם בבוקר של קציר העלים. ניתן לשנות הליך זה עבור צמחים אחרים ויכול להוביל לגילוי או אישור של תרכובות זרימה חדשות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעקוב אחר ה-PDLs ביסודיות לאחר השעה הראשונה כדי להסיר את ה-EDTA ולא לסחוט את העלים כדי למנוע זיהום בתוכן של תאים אחרים.

בנוסף, לבישת כפפות גם מגנה על הדגימות שלך מפני מזהמים שאתה עלול להכניס מהעור שלך כדי למנוע זיהום, השתמש בבקרות המתאימות לדגימות RNA או מטבוליט חלבון. בקרות מוצעות מפורטות בפרוטוקול הטקסט. שיטה זו אפשרה לנו לקבל תובנות חדשות לגבי הרכב זרימת הצמח.

הצלחנו לזהות מספר ליפידים בתוך הצורה אקסודאט, שלא היו צפויים בסביבה המימית של הרצפה. זה הוביל אותנו ואחרים להציג את הרעיון של איתות שומנים למרחקים ארוכים, שהתפתח כעת למחקר חדש ומרגש של שתלי שדה.