איסוף וניתוח של
23 באוקטובר 2013
ידע של ההרכב של SAP השיפה כמו גם את המנגנון של התחבורה והטעינה למרחקים ארוכים שלה הוא חיוני להבנה של איתות למרחקים ארוכים בפיתוח ומתח / תגובת פתוגן צמח ולהטמיע תחבורה. כתב יד זה מתאר את האוסף של פליטות השיפה בשיטה EDTA-הקל.
המטרה הכללית של נוהל זה היא לאסוף הפרשה מהפלואם (phloem exudate) מ-Arabidopsis או מצמחים אחרים, כדי לנתח את תכניה או לאשש את נוכחותם של תרכובות בתוך זרם הפלואם. דבר זה מושג תחילה על ידי חיתוך והדגרה של הגבעול ב-potassium EDTA כדי למנוע את חסימת אלמנט הניצול (sieve element). השלב השני הוא שטיפה יסודית של הגבעול להסרת שאריות EDTA שעלולות להפריע לניתוח העוקב ואף לגרום לנזק לתאים במהלך חשיפה ממושכת.
בשלב הבא, נאספים הפרשות ה-EM הזורמות אל תוך מים. השלב הסופי הוא הכנת הדגימות לניתוח עוקב באמצעות ג'ל L-C-M-S-G-C-M-S, אלקטרופורזה וכרומטוגרפיה בשכבה דקה. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בהפרשת ה-phem המתווכת על ידי EDTA כדי לנתח ולאשר תכני phem כגון מטבוליטים וליפידים, חלבונים או RNAs.
צמחים אינם יכולים להימלט מתנאים עוינים. כתוצאה מכך, הם זקוקים למערכות יעילות ומהירות מאוד להעברת אותות סביבתיים לאורך הצמח ולתגובה באמצעות שינוי בפיתוח. אחד ממסלולי איתות אלו הוא זרימת הצמח, שהבנת הרכבו היא מורכבת למדי.
אנו משתמשים בשיטת ההרגעה בזרימה המסייעת על ידי EDTA לצורך איסוף וניתוח של תכני זרימה. שיטה זו פותחה במקור ב-Perilla על ידי king, אך ניתן להתאימה בקלות למינים אחרים. את הפרוצדורה ידגימו Elena ו-US, שניהם סטודנטים לתואר ראשון מהמעבדה שלי, טרם תחילת הפעולה.
גדלו צמחי Arabidopsis במשך ארבעה עד שישה שבועות בתאי גידול עם מחזור תאורה של 12 שעות עד ליום האיסוף. דללו תמיסת potassium EDTA 100 millimolar שהוכנה מראש בעזרת מים כדי להגיע לריכוז סופי של 20 millimolar. לאחר מכן, מלאו עד מחציתן שתי צלחות זכוכית בקוטר של 7 עד 15 סנטימטרים בתמיסת potassium EDTA 20 millimolar.
בסיום, מלאו מבחנות תגובה של 1.7 מיליליטר ב-1.4 מיליליטר של תמיסת potassium EDTA בריכוז 20 מילימולרית. לאחר מכן, מלאו מספר שווה של מבחנות תגובה ב-1.4 מיליליטר של מים מזוקקים (Millipore water). לאחר הוצאת הצמחים, בני גיל ארבעה עד שישה שבועות, מתאי הגידול, קצרו את עלי הרוזטה על ידי חיתוכם באמצעות להב תער בבסיס העלה קרוב למרכז הרוזטה.
הנח מיד את העלים בצלחות המכילות 20 millimolar potassium EDTA, כאשר הקצה החתוך של העלה טבול בתמיסה. לאחר איסוף של 15 עלים משלושה עד ארבעה צמחים, ערים אותם בעדינות זה על גבי זה כך שהעליכמות החתוכים יהיו מיושרים זה עם זה. חתוך שוב את בסיס העליכמות וגלגל את העלים בעדינות.
לאחר מכן, הכניסו בעדינות את העלים הגלגולים לאחד ממבחנות התגובה המכילות 20 millimolar potassium EDTA לצורך איסוף התסביב. בחושך, רפדו את תחתיתו של צלח רדוד וגדול בנייר סופג רטוב. מקמו את הסטנד עם מבחנות התגובה המלאות בעלים בתוך הצלח, והכניסו אותו לתוך שקית פלסטיק שחורה עם חריצים לאוורור.
לאחר מכן, הניחו את כל המערך בתוך ארון לאיסוף התססות (exudates). רפדו את תחתיתו של מכל פלקסיגלאס שקוף במגבונים נייר רטובים. הניחו את העמוד עם מבחנות התגובה המכילות את העלה בתוך המכל וסגרו אותו.
שעה לאחר הוצאת המעמד מהמיכל, הוצא את העלים מתוך מבחנות התגובה. שטוף את העלים היטב במים מזוקקים כדי להסיר את כל ה-EDTA. העבר מיד את העלים למבחנות תגובה המכילות מים מסונני Millipore והחזר אותם למכלי הלחות לצורך איסוף הפרשות (exudates), לאחר הוצאת המעמד מהמיכל הלח.
חמש עד שמונה שעות לאחר מכן, הוציאו את העלים מהמבחנות, הקפיאו את תפלילי הזרימה (flow exudates) בחנקן נוזלי ואחסנו אותם במקפיא של 80°C- . לצורך ניתוח נוסף ביום למחרת, הפשיתו את הדגימות כהכנה לניתוח ליפידים. לאחר מכן, קחו שתיים עד שלוש דגימות והוסיפו כמות שווה של כלורופורם ומתנול לתמיסה המשולבת.
ערבב את התערובת במכשיר vortex למשך מספר שניות. לאחר מכן, סבב את הדגימה בצנטריפוגה למשך ארבע דקות ב-400 gs. בסיום, אסוף את הפאזה האורגנית התחתונה לשפופרת זכוכית לאחר חזרה על תהליך החלוקה עם הפאזה העליונה שלוש פעמים נוספות; ייבש את הפאזות האורגניות המאוחדות תחת זרם חנקן והעבר אותן לבדיקת כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) ולניתוח LCMS.
שיטה זו מאפשרת איסוף של מספיק הפרשות פם (phem exudates) כדי לזהות חלבונים הממוקמים בפם ואת השינויים ברמותיהם בתגובה להתפתחות או למעמס. במקרים מסוימים, חוקרים עשויים לרצות להשתמש במעכבי פרוטאינאז כדי למנוע פירוק של חלבונים. כפי שמוצג כאן, החלבונים נמצאים בשכיחות נמוכה מאוד, אך רמותיהם גבוהות מספיק עבור ניסויי פרוטאומיקה המשכיים.
שימוש ב-LCMS או ממצאים מניתוח western blot בדלועיים מעלים כי חיתוך הגבעול מוביל להפרעה במאזן הפוטנציאל המים ולזרימה עוקבת של מים ומזהמים אפשריים מהסביבה. עם זאת, איסוף לאורך פרקי זמן הנעים בין שעה לשמונה שעות אינו משפיע על פרופיל החלבונים וההרכב שלהם ב-InOpSys. כמות החלבון שנאספה ודפוס החלבונים שנמצאו משתנים בין מינים וטיפולים שונים.
כתוצאה מכך, ניתן להדגים, לזהות ולעקוב אחר אותות של חלבונים. ניתן לזהות בשיטה זו גם mRNA ו-microRNAs בתסריחי הפלום (phloem exudates). עם זאת, טיפול במעכב RNA הכרחי כדי למנוע פירוק של ה-mRNA במהלך זמן ההפרשה הממושך.
מכיוון שאלמנטים מסוג C אינם מכילים כלורופלסטים תפקודיים, ניתן להשתמש ב-mRNAs של rubis, תת-יחידה קטנה או גדולה כביקורות שליליות, בעוד ש-mRNA מקומי של pH flu m ידוע, כגון ubiquitin conjugating enzyme, יכול לשמש כביקורת חיובית. באופן דומה, ניתן לנתח סוכרים או מטבוליטים קטנים באמצעות GCMS או LCMS. יש לציין כי הפרשות הפם (phem exudates) מכילות מספר רב של אנזימים תפקודיים, כולל כמעט את נתיב הגליקוליזה כולו.
לפיכך, שימוש במספר נקודות זמן עשוי לחשוף תהליכים מטבוליים במהלך איסוף ההפרשה. בכל ההפרשות, סוכרוז הוא המטבוליט השכיח ביותר. הדבר בולט ביותר לאחר איסוף של שעה אחת.
עם זאת, לאחר חמש שעות, היחס בין הסוכרוז לפרוקטוז פוחת מעט. אם אוספים את אותה ההפרשה למשך שעה אחת ולאחר מכן מותירים אותה על השולחן למשך ארבע שעות נוספות, היחס בין הסוכרוז לפרוקטוז פוחת במידה רבה הרבה יותר. דבר זה מרמז כי אנזימים פעילים בהפרשות הפם מובילים לפירוק של סוכרוז בטמפרטורת החדר.
בנוסף, העובדה שאיסוף רציף במשך חמש שעות מראה רק ירידה קלה ביחס שבין סוכרוז לפרוקטוז עולה בקנה אחד עם ממצאים המצביעים על כך שטעינת פלואם והובלת מולקולות מתאי לוויה אל אלמנטים של נוריות עשויות להימשך במהלך ההפרשה עד שהמערכת מאבדת מחיוניותה. ליפידים בהפרשות הפלואם, ובשל כך סיגנלינג ליפידי למרחקים ארוכים, הם תחום עניין עדכני למדי במדעי הצמחים. בשל טבעם ההידרופובי, ליפידים נוכחים בריכוזים נמוכים בלבד ועשויים להיות קשורים למולקולות אחרות לצורך הומסולביליזציה.
עם זאת, ההחלשה שחוללה על ידי ה-EDTA מאפשרת איסוף של מספיק חומר כדי להדמיות ולזהות זרימה וליפידים ממספר מיני צמחים. כפי שמוצג כאן, ניתן להפריד מספר סוגי ליפידים באמצעות כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC). LCMS מאפשר לזהות סוגי ליפידים שונים ולנטר שינויים בפרופילי הליפידים של גנוטיפים או טיפולים שונים.
דבר זה מאפשר לחקור את תפקידם של הליפידים במהלך התפתחות הצמח והתגובה לעקה. ברגע שהטכניקה נלמדת, ניתן לבצע אותה תוך שלוש שעות בלבד אם היא מבוצעת כהלכה. עם זאת, עבור רוב הדגימות, אנו ממליצים על זמן איסוף של חמש עד שמונה שעות.
במקרה זה, מומלץ להתחיל את קציר העלים בשעות הבוקר המוקדמות. ניתן להתאים הליך זה לצמחים אחרים, והוא עשוי להוביל לגילוי או לאישור של תרכובות פריחה חדשות. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לעקוב בדקדוק אחרי ה-PDLs לאחר השעה הראשונה כדי להסיר את ה-EDTA, ולהימנע מלסחוט את העלים כדי למנוע זיהום של תכולת תאים אחרים.
בנוסף, חבישת כפפות מגנה גם על הדגימות שלך מפני מזהמים שעלולים לעבור מעורך. כדי למנוע זיהום, השתמש בביקורות המתאימות עבור דגימות של חלבון, RNA או מטבוליטים. הביקורות המומלצות מופיעות בפרוטוקול הטקסטואלי. שיטה זו אפשרה לנו להשיג תובנות חדשות לגבי הרכבו של זרם הצמח.
הצלחנו לזהות מספר ליפידים בתוך נזילת התבנית, שלא היו צפויים בסביבה המימית של הרצפה. הדבר הוביל אותנו ואחרים להציג את המושג של איתות ליפידי למרחקים ארוכים, שהתפתח כעת לתחום מחקר מרגש וחדש של שתלים.
סקירה כללית
מחקר זה מתאר שיטה לאיסוף הפרשות פלואם מצמחים, ובאופן ספציפי מ-Arabidopsis, תוך שימוש בגישה המסייעת EDTA. הבנת הרכב מיץ הפלואם היא חיונית להבנת תהליכי איתות בצמחים ותגובות למעקה סביבתי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של צמחים
- מנגנוני הובלה בפלואה
- ניתוח מטבוליטים
רקע
- מיציי הפלואם ממלאים תפקיד חיוני באיתות למרחקים ארוכים בצמחים.
- הסעה יעילה של רכיבי תזונה ואותות חיונית להתפתחות הצמח.
- השיטה המסייעת על ידי EDTA מאפשרת איסוף יעיל של הפרשות פלואם.
- הבנת הרכב הפלואום מסייעת בחקר תגובותי הצמח למעקה ולפתוגנים.
מטרת המחקר
- לאסוף ולנתח הפרשות מהפלוארה של Arabidopsis וצמחים אחרים.
- לאשש את נוכחותם של מטבוליטים, חלבונים ו-RNAs במי הפלוארה.
- לחקור את מסלולי השליחויות המעורבים בתגובות צמחים לתנאים סביבתיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דגירה של עלי כותרת של צמחים ב-potassium EDTA כדי למנוע את חסימת אלמנטי הנפה.
- איסוף הפרשות מהפלואם למבחנות תגובה לצורך אנליזה.
- שימוש ב-LC-MS, GC-MS וכרומטוגרפיית שכבה דקה לאנליזה של מטבוליטים.
- הקפאה והפשרה של דגימות להמשך אנליזה של חלבונים ו-RNAs.
תוצאות עיקריות
- איסוף מוצלח של הפרשות פלואה בכמות מספיקה למחקרי פרוטאומיקה ומטבוליזומיקה.
- זיהוי חלבונים ומטבוליטים, כולל סוכרוז כמטבוליט השכיח ביותר.
- הדגמת ישימותה של השיטה במגוון מיני צמחים.
- תובנות לגבי הדינמיקה של הרכב הפלואה בתגובה לתנאי התפתחות ומצבי עקה.
מסקנות
- השיטה המתווכת על ידי EDTA יעילה לחקר הפרשות מהפלואם.
- ניתוח של מיץ הפלואם יכול לחשוף מידע חשוב על אותיות ומטבוליזם בצמחים.
- ניתן להתאים גישה זו למינים שונים של צמחים כדי להגביר את ההבנה של תפקודי הפלואם.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הבנת הרכב הפלואם מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית בתהליכי תיקוף מטרות עבור יישומים ביו-פרמצבטיים מבוססי צמחים, ובמיוחד בניתוח מטבוליטים ומסלולי איתות. שיטת ההפרשה המתווכת על ידי EDTA תומכת בביטחון חיזוי על ידי מתן גישה הדירה לתכולת הפלואם במינים שונים, ובכך מסייעת לתהליכי עבודה בשלבי הגילוי המוקדמים. גישה זו משפרת את הרצף התרגומי משלב הגילוי ועד להערכה פרה-קלינית של תרכובות המופקות מצמחים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היпотеזות טיפוליות באמצעות ניתוח של מטבוליטים, חלבונים ו-RNAs הממוקמים בפלואה (phloem) ומעורבים במסלולי איתות של עקה.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות תיקוף תפקודי של מטרות, תוך שימוש בפרופילים של סוכרוז, ליפידים וחלבונים כסממנים ביולוגיים לשלמות הפלואה ולפעילותה.
- ערך ניבוי: מסייע במיון תיקי פיתוח על ידי קישור שינויים בהרכב הפלואה למצבי התפתחות או עקה, ובכך מספק מידע לקבלת החלטות לגבי המשך או הפסקת תהליכים (go/no-go) בסריקת תרכובות מבוססות צמחים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות מתוקפות לתהליכי עבודה המשכיים על ידי הפקת הפרשות המתאימות לניתוח מטבוליטים וליפידים בשיטות LC-MS, GC-MS וכרומטוגרפיה בשכבה דקה.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות של הבדיקה באמצעות זמני איסוף מבוקרים של ההפרשות ושלבי הסרה של EDTA, ובכך מפחית את השונות בתוצרי סריקת התרכובות.
- יכולת הרחבה: מאפשר הערכה אמינה של תרכובות במיני צמחים עשביים ועציים במינימום ציוד, דבר התומך בשימוש חוזר בפלטפורמה במסלולי גילוי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: דן ברלוונטיות למחלה באמצעות ניתוח של סיגנל lipid ואנזימים גליקוליטיים בתמציות פלוэм, בקו התואם לגילוי ביומרקרים תרגומיים בתגובות למעיקה בצמחים.
- ערך תפעולי: מתאר רציפות משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני על ידי מתן אפשרות לאפיון אורכי של מטאבוליטים וחלבונים בפלו噉 לאורך נקודות זמן וטיפולים שונים.
- קידום מותאם סיכון: תומך בהחלטות לגבי קידום תרכובים שמקורם בצמחים על ידי זיהוי ביומרקרים יציבים (למשל, יחסי sucrose) המשקפים את חיוניות הטעינה וההובלה בפלו噉.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזות ועד לזיהוי מובילים, ותומכת בניתוח של מטבוליטים, חלבונים וליפידים המופקים מהפלואם ב-Arabidopsis ובמינים אחרים.
- ביולוגיה של התגליות: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי מתן אפשרות לניתוח תרכובים הממוקמים בפילואם (phloem) המעורבים באיתותי דחק ובזרימה מטבולית.
- סריקה: מתארת מוכנות של הבדיקה באמצעות שלבים סטנדרטיים של איסוף וטיהור הפרשות, מה שמבטיח פלט כמותי הניתן לשחזור לסריקת מטבוליטים וליפידים.
- אנליטיקה: מדגישה את LC-MS, GC-MS וכרומטוגרפיה בשכבה דקה כטכניקות אנליטיות מרכזיות המייצרות מערכי נתונים ברי-השוואה להערכת השפעות של תרכובים על הרכב הפילואם.
- מחקר תרגומי: מקשרת את השיטה לרציפות פרה-קלינית על ידי מתן אפשרות למעקב אחר סממנים ביולוגיים של ליפידים וחלבונים לאורך תנאי התפתחות ודחק, ובכך תומכת בקידום מותאם סיכונים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציבה את השיטה המסייעת על ידי EDTA כיכולת הניתנת לשימוש חוזר במגוון מיני צמחים ובמעבדות שונות, ובכך מפחיתה את התלות בציוד מיוחד לניתוח פילואם.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: ביטחון חיזויי בתיקוף מטרות, צמצום העמימות המכניסטית במסלולי סיגנלציה של הפלואם וגילוי סמנים ביולוגיים לתגובת מאמץ.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, שחזוריות ויכולת הרחבה של איסוף הפרשות במגוון מינים ובסביבות מעבדה שונות.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות מושכלת יותר לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go), יעילות הון באמצעות הפחתת נשירה בשלבים מאוחרים של פיתוח תרכובים מבוססי צמחים, והפחתת סיכון ביולוגי בבחירת מטרות.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף והחלטות קידום מותאמות סיכון, המבוססות על פרופילים כמותיים של חלבונים ומטבוליטים בפלואם.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בפיזיולוגיה של צמחים ובניתוח מטבוליטים כדי להבחין בין הפרשות פלועם אמיתיות לבין מזהמים תאיים.
- תלוי בגישה למכשור LC-MS, GC-MS ואלקטרופורזה לצורך אפיון מקיף של ההפרשות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי שטיפת EDTA ותזמון האיסוף כדי להבטיח הדירות בין מעבדות.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום השיטה על מינים עציים לעומת מינים עשביים, בשל הבדלים בקינטיקה של איטום הפלועם.
- מגבלה מעשית: כימות יחסי בלבד, כיוון שהשיטה מתבססת על הפרשה ולא על איסוף ישיר של מי פלועם, דבר הדורש אסטרטגיות נורמליזציה להשוואות בין דגימות.
