Name: Dissection של Laevis Xenopus העצבי קרסט עבור במבחנה Explant תרבות או In vivo השתלות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-04T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: למדו ניתוח של קרסט עצבי קרניאלי מ-Xenopus laevis לתרבות אקספלנטים או השתלות in vivo. שיטה זו מאפשרת מעקב אחרי נדידת תאים והתמיינות בביולוגיה התפתחותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים מודים אדלין דולי לתמונות של explant על פיברונקטין, אריק Theveneau לדיונים מועילים ומתקן בעלי החיים של מכון קירי. CM הוא בחור דוקטורט של אזור איל דה פראנס (Domaine d&#39;interet Majeur גזע פולני), אוניברסיטת פריז Sud (נספח ד &#39;הזמנית של Enseignement et de משוכלל ונדיר), וסוכנות ידיעות Nationale de la משוכלל ונדיר. עבודה זו מומנה על ידי האוניברסיטה לפריז Sud (Attractivite 2011), המרכז הלאומי de la משוכלל ונדיר Scientifique (תכנית הפעולה Thematique et sur Incitative), איגוד לשפוך la משוכלל ונדיר contre le הסרטן גרנט SFI20101201882, Ligue contre le הסרטן, וסוכנות הידיעות Nationale de la משוכלל ונדיר (סוכנות הידיעות Nationale de la משוכלל ונדיר התכנית בלאן).

ניסויים לעמוד ברגולציה לאומית ואירופית בהגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות מדעיות ועם עקרונות שנקבעו בעולם של החלפה, הפחתה ועידון. 1. הכנת מאכלים מצופים פיברונקטין 14 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 500 מיליליטר של פיברונקטין 10 תרבות הכיתה מ&quot;ג / מיליליטר מדולל ב1x בופר פוספט (PBS) לתוך צלחת פטרי פלסטיק סטנדרטית (Ø 40 x 11 מ&quot;מ). לדגור על C ° 37 במשך שעה 1. הערה: אם משתמש בכלים מזכוכית או coverslips זכוכית להדמיה הבאה, להשתמש בפתרון פיברונקטין 100 מ&quot;ג / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים עם 1X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף PBS עם 500 מיליליטר של% PBS/0.1 1x הסרום אלבומין שור (BSA). לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים עם 1X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא עם 1x PBS ולשמור על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש (בדרך כלל ל24-48 hr). </li></ol> 2. Dissection של Explants NC &lt;ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו את 3/4 רגיל אמפיבי בינוני (NAM) (110 mM NaCl, 2 מ&quot;מ KCl, 1 מ&quot;מ Ca (NO 3) 2, 1 מ&quot;מ MgSO 4, 0.1 mM EDTA, 1 מ&quot;מ NaHCO 3, 0.2X PBS, 50 מ&quot;ג / מיליליטר gentamycin 10,15). אל תשמרו בשבוע יותר מ 1 לנתיחה, לאחסן ב 4 ° C. NAM המבוגר יותר יכול לשמש להכנת מאכלים לנתיחה מצופה agarose (להלן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 60 מ&quot;מ צלחות פטרי לנתיחה, מצופות ב10 מיליליטר של 2% agarose ב3 / 4 NAM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף כלים לנתיחה: טפטפות פסטר מפלסטיק, סיכת חרקים הטובה ביותר רכוב על בעל פינים (ראה טבלת חומרים לעיון), &quot;סכין גבה&quot; (שנעשה עם שיער גבה המוטבע פרפין בקצה של זכוכית פיפטה פסטר 16), שני בסדר מלקחיים לנתיחה, פיפטה P1000 וטיפים, stereoscope משקפת עם הגדלה 8-40X ל50, מקור אור בהיר עם מדריכי סיבים אופטיים. יש לשמור את כל הכלים לנתח נקיים; לאחר כל ניסוי, יש לשטוף אותם פעמיים עם מים מזוקקים, ברגע שwiה 100% אתנול ולתת להתייבש. לאחסן הרחק מאבק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את הצלחת לנתיחה עם NAM הטרי כמעט עד לפסגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג X. laevis עוברים על פי נהלים קבועים 10 וגילם עד שהם מגיעים neurula שלב 16 (על פי טבלה התפתחותית Nieuwkoop ופייבר 17). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שלב 16 עוברים לתוך הצלחת לנתיחה באמצעות פיפטה פסטר מפלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את כל השלבים הבאים בהיקף המשקפת. להסיר את קרום vitelline עם שני זוגות מלקחיים. היזהר שלא לגרום נזק לחלק הגבי של העוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה עד שהעוברים הגיעו שלב 17 להתחיל הנתיחה. שלב 17 מתאים מאז הרכס העצבי באופן ברור מוגדר מלבד הצינור העצבי, בניגוד לשלבים מוקדמים יותר. לאחר שלב 17, צפון קרוליינה מתחילה נודדת ומתערבב עם mesenchyme שמסביב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחפור חור קטן בagarose עם מלקחיים כדי להפוך את נישה לעוברים על מנת לשמור עלשלהם במהלך הניתוח. הנח בצד את גב עובר אחד. הערה: הפלסטלינה ניתן להשתמש כדי לשמור את העוברים במקום לחפור בור לagarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושה חתך בחלק הצדדי של הקפל העצבי הקדמי עם סכין הגבה וסיכת החרק. היזהר שלא ללכת יותר מדי עמוק לתוך העובר: מטרה לחתוך 2-3 שכבות תא (לעולם לא יגיע עמוק כמו archenteron!). במהלך תהליך הנתיחה השלם, לא לאפשר רקמות גזורים להיכנס במגע עם ממשק האוויר הנוזלי מאז X. רקמות עוברי laevis הן lysed על ידי מתח פנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך במקביל שני בחלק הגבי יותר מעצבי לקפל באמצעות אותם מכשירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת הצורך, מכוון את צלחת לווין סביב 90 מעלות. לעשות חתך בניצב שלישי עם סכין הגבה וסיכת החרקים, בצד האחורי של שני החתכים הראשונים. צפון קרוליינה היא מסה עבה של תאים מתחת לשכבה החיצונית של פיגמנט האאקטודרם, לרוחבלצינור העצבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בקצה של סכין הגבה לנתק את שכבת האאקטודרם פיגמנט מNC הבסיסי, החל מקצה החתך השלישי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בצד השני של סכין הגבה כדי לנתק את רקמות NC החל מהחתך השלישי. רקמת NC היא די אפרפרה, בעוד המזודרם cephalic שבבסיס הוא לבן. להפריד את צפון קרוליינה בזהירות מן המזודרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את רקמת NC anteriorly מהשלפוחית ​​אופטית, ולחתוך ברמה זו כדי לשחרר את explant. כביקורת לניסויים הראשונים, בדיקת ביטוי snail2 (סמן NC הקנונים) בכמה explants ידי הכלאה באתר מומלץ. </li></ol> 3. Explants ציפוי על פיברונקטין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא את הצלחת מצופה פיברונקטין עם Danilchick בינוני שונה (MDM, NaCl 53 מ&quot;מ, Na2CO 3 5 מ&quot;מ, K גלוקונאט 4.5 מ&quot;מ, Na גלוקונאט 32 מ&quot;מ, MgSO 4 1 מ&quot;מ, 2 מ&quot;מ CaCl 1, BSA 0.1%, להתאים את ה-pH .8.3 עם 1 M Bicine <sup&gt; 18). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את explants לתוך הצלחת מצופה פיברונקטין באמצעות פיפטה P1000. לעולם אל תאפשר explants לגעת בממשק האוויר הנוזלי. ראשית, פיפטה כמה נוזל לתוך הקצה, אז explants, אז כמה נוזל שוב. אל תאפשר לאף אוויר לקצה בעת העברת explants לתוך הצלחת מצופה פיברונקטין. ברגע שהקצה נמצא בנוזל של המנה מצופה פיברונקטין, בואו explants לרדת באיטיות על ידי כוח הכבידה, או לדחוף בעדינות רבה. הימנעו להוציא explants מהר מדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 10-30 explants בצלחת באמצעות סכין הגבה. הימנע מהצדדים של המנה, שהם לא מתאימים להדמיה הבאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נסה לא להזיז את הצלחת עד explants צירפו בפיברונקטין (זה לוקח בערך 15-30 דק &#39;). במידת הצורך, להעביר את הצלחת בזהירות רבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת בחממה בקירור (בין 15-20 ° C, לתרשים טמפרטורה רואה 17). כאשר הניחו ב15 מעלות צלזיוס, תאי arדואר בדרך כלל נודד ביעילות ובפיזור לאחר 6 שעות של דגירה (תזמון עשוי להשתנות בין ניסויים). </li></ol> 4. השתלת Explants לעוברי מארח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים coverslip זכוכית עדין לחתיכות קטנות מאוד באמצעות מלקחיים גסים. הגודל של החתיכות צריך להיות כ 1.5 מ&quot;מ 2. לטבול את החתיכות לתוך צלחת פטרי המכילה 3/4 NAM או PBS באמצעות מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת עובר המארח: לנתח את המארח NC ב3 / 4 NAM כמתואר ב3) עם טיפול מיוחד שלא לפגוע בעובר המארח תוך הסרת קרום vitelline ולנתח את צפון קרוליינה. מתח הרקמות נוטה להגדיל את הגודל של אבלציה: בואו עובר המארח לרפא באופן חלקי בזמן לנתח את עובר התורם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצלחת מצופה agarose אחר או בחלק אחר של אותה המנה, לנתח את explant NC מעובר התורם כפי שתואר בפרוטוקול 3. העבר את שתל NC לתוך הצלחת המכילה את המארח בזהירות, כפי שתואר בפרוטוקול 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד למקום explant NC על אזור ablated המארח באמצעות מלקחיים. Explant צריך לצרף באופן חלקי. שים חתיכת הזכוכית coverslip על העובר מורכב כדי לשמור על השתל במקום. בחר חתיכת זכוכית גדולה יותר מהעובר, כדי למנוע פגיעה בו. העובר יהיה קצת שטוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחכות לפחות 15-20 דקות, ולאחר מכן להסיר בעדינות את coverslip. בואו העובר להתאושש עוד 10 דקות ו פיפטה בזהירות אותו לתוך צלחת נקייה מלאה 3/4 NAM, באמצעות פיפטה פסטר מפלסטיק. </li></ol>

<ol><li>Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+regulatory+network+orchestrates+neural+crest+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A gene regulatory network orchestrates neural crest formation.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (7), 557-568 (2008).</li>
<li>Theveneau, E., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+delamination+and+migration%3A+from+epithelium-to-mesenchyme+transition+to+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural crest delamination and migration: from epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration.</a> Dev. Biol. 366 (1), 34-54 (2012).</li>
<li>Stuhlmiller, T. J., García-Castro, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+perspectives+of+the+signaling+pathways+directing+neural+crest+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Current perspectives of the signaling pathways directing neural crest induction.</a> Cell. Mol. Life Sci. 69 (22), 3715-3737 (2012).</li>
<li>Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+induction+at+the+neural+plate+border+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural crest induction at the neural plate border in vertebrates.</a> Dev. Biol. 366 (1), 22-33 (2012).</li>
<li>Pegoraro, C., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+and+transcriptional+regulation+in+neural+crest+specification+and+migration%3A+lessons+from+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling and transcriptional regulation in neural crest specification and migration: lessons from Xenopus embryos.</a> Dev. Biol. 2 (2), 247-259 (2013).</li>
<li>Etchevers, H. C., Amiel, J., Lyonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Bases+of+Human+Neurocristopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Crest+Induct.+Different%22%5BJournal%5D)">Molecular Bases of Human Neurocristopathies.</a> Neural Crest Induct. Different. 589, 213-234 (2005).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+and+organization+of+the+central+nervous+system+in+amphibians.+Part+II.+Differentiation+and+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">Activation and organization of the central nervous system in amphibians. Part II. Differentiation and organization.</a> J. Exp. Zool. 120 (1), 33-81 (1952).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+and+organization+of+the+central+nervous+system+in+amphibians+Part+I.+Induction+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">Activation and organization of the central nervous system in amphibians Part I. Induction and activation.</a> J. Exp. Zool. 120 (1), 1-31 (1952).</li>
<li>Sharpe, C. R., Fritz, A., De Robertis, E. M., Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homeobox-containing+marker+of+posterior+neural+differentiation+shows+the+importance+of+predetermination+in+neural+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A homeobox-containing marker of posterior neural differentiation shows the importance of predetermination in neural induction.</a> Cell. 50 (5), 749-758 (1987).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+development+of+Xenopus+laevis%3A+a+laboratory+manual%22">Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2000).</li>
<li>Monsoro-Burq, A. -H., Fletcher, R. B., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+induction+by+paraxial+mesoderm+in+Xenopus+embryos+requires+FGF+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neural crest induction by paraxial mesoderm in Xenopus embryos requires FGF signals.</a> Development. 130 (14), 3111-3124 (2003).</li>
<li>Milet, C., Maczkowiak, F., Roche, D. D., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax3+and+Zic1+drive+induction+and+differentiation+of+multipotent%2C+migratory%2C+and+functional+neural+crest+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Pax3 and Zic1 drive induction and differentiation of multipotent, migratory, and functional neural crest in Xenopus embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (14), 5528-5533 (2013).</li>
<li>Sadaghiani, B., Thiébaud, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+development+in+the+Xenopus+laevis+embryo%2C+studied+by+interspecific+transplantation+and+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural crest development in the Xenopus laevis embryo, studied by interspecific transplantation and scanning electron microscopy.</a> Dev. Biol. 124 (1), 91-110 (1987).</li>
<li>Theveneau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+chemotaxis+requires+contact-dependent+cell+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Collective chemotaxis requires contact-dependent cell polarity.</a> Dev. Cell. 19 (1), 39-53 (2010).</li>
<li>Slack, J. M., Forman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+interaction+between+dorsal+and+ventral+regions+of+the+marginal+zone+in+early+amphibian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">An interaction between dorsal and ventral regions of the marginal zone in early amphibian embryos.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 56, 283-299 (1980).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+dissection+and+micromanipulation+tools%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Embryo dissection and micromanipulation tools.</a> CSH Protoc. , (2007).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%3A+a+systematical+and+chronological+survey+of+the+development+from+the+fertilized+egg+till+the+end+of+metamorphosis%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis.</a> , Garland Pub. New York. (1994).</li>
<li>Theveneau, E., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beads+on+the+run%3A+beads+as+alternative+tools+for+chemotaxis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Beads on the run: beads as alternative tools for chemotaxis assays.</a> Methods Mol. Biol. 769, 449-460 (2011).</li>
<li>Bronner, M. E., LeDouarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evolution+of+the+neural+crest%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development and evolution of the neural crest: An overview.</a> Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).</li>
<li>Alfandari, D., Cousin, H., Gaultier, A., Hoffstrom, B. G., DeSimone, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+%CE%B15%CE%B21+supports+the+migration+of+Xenopus+cranial+neural+crest+on+fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrin α5β1 supports the migration of Xenopus cranial neural crest on fibronectin.</a> Dev. Biol. 260 (2), 449-464 (2003).</li>
<li>Fort, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+the+RhoU%2FWrch1+GTPase+is+critical+for+cranial+neural+crest+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Activity of the RhoU/Wrch1 GTPase is critical for cranial neural crest cell migration.</a> Dev. Biol. 350 (2), 451-463 (2011).</li>
<li>Matthews, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+migration+of+neural+crest+cells+in+vivo+is+regulated+by+Syndecan-4%2FRac1+and+non-canonical+Wnt+signaling%2FRhoA%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA.</a> Development. 135 (10), 1771-1780 (2008).</li>
<li>Kashef, J., Köhler, A., Kuriyama, S., Alfandari, D., Mayor, R., Wedlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadherin-11+regulates+protrusive+activity+in+Xenopus+cranial+neural+crest+cells+upstream+of+Trio+and+the+small+GTPases%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Cadherin-11 regulates protrusive activity in Xenopus cranial neural crest cells upstream of Trio and the small GTPases.</a> Genes Dev. 23 (12), 1393-1398 (2009).</li>
<li>Hwang, Y. -S., Luo, T., Xu, Y., Sargent, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin-X+is+required+for+cranial+neural+crest+cell+migration+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Myosin-X is required for cranial neural crest cell migration in Xenopus laevis.</a> Dev. Dyn. 238 (10), 2522-2529 (2009).</li>
<li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+pathogenesis+and+treatment+of+familial+dysautonomia+using+patient-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs.</a> Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).</li>
<li>Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Neural+Crest+Induction%2C+Melanocyte+Specification%2C+and+Disease-Related+Pigmentation+Defects+in+hESCs+and+Patient-Specific+iPSCs.%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Modeling Neural Crest Induction, Melanocyte Specification, and Disease-Related Pigmentation Defects in hESCs and Patient-Specific iPSCs.</a> Cell Reports. 3 (4), 1140-1152 (2013).</li>
<li>Shnitsar, I., Borchers, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTK7+recruits+dsh+to+regulate+neural+crest+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">PTK7 recruits dsh to regulate neural crest migration.</a> Development. 135 (24), 4015-4024 (2008).</li>
<li>Matthews, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+migration+of+neural+crest+cells+in+vivo+is+regulated+by+Syndecan-4%2FRac1+and+non-canonical+Wnt+signaling%2FRhoA%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA.</a> Development. 135 (10), 1771-1780 (2008).</li>
<li>Matthews, H. K., Broders-Bondon, F., Thiery, J. P., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt11r+is+required+for+cranial+neural+crest+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Wnt11r is required for cranial neural crest migration.</a> Dev. Dyn. 237 (11), 3404-3409 (2008).</li>
<li>Carmona-Fontaine, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact+inhibition+of+locomotion+in+vivo+controls+neural+crest+directional+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Contact inhibition of locomotion in vivo controls neural crest directional migration.</a> Nature. 456 (7224), 957-961 (2008).</li>
<li>Guiral, E. C., Faas, L., Pownall, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+migration+requires+the+activity+of+the+extracellular+sulphatases+XtSulf1+and+XtSulf2%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural crest migration requires the activity of the extracellular sulphatases XtSulf1 and XtSulf2.</a> Dev. Biol. 341 (2), 375-388 (2010).</li>
<li>Cousin, H., Abbruzzese, G., Kerdavid, E., Gaultier, A., Alfandari, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+the+Cytoplasmic+Domain+of+ADAM13+to+the+Nucleus+Is+Essential+for+Calpain8-a+Expression+and+Cranial+Neural+Crest+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Translocation of the Cytoplasmic Domain of ADAM13 to the Nucleus Is Essential for Calpain8-a Expression and Cranial Neural Crest Cell Migration.</a> Dev. Cell. 20 (2), 256-263 (2011).</li>
<li>Borchers, A., David, R., Wedlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+cadherin-11+restrains+cranial+neural+crest+migration+and+influences+neural+crest+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Xenopus cadherin-11 restrains cranial neural crest migration and influences neural crest specification.</a> Development. 128 (16), 3049-3060 (2001).</li>
<li>Borchers, A., Epperlein, H. -H., Wedlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assay+system+to+study+migratory+behavior+of+cranial+neural+crest+cells+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">An assay system to study migratory behavior of cranial neural crest cells in Xenopus.</a> Dev. Genes Evol. 210 (4), 217-222 (2000).</li>
<li>Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Runx2+is+essential+for+larval+hyobranchial+cartilage+formation+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Runx2 is essential for larval hyobranchial cartilage formation in Xenopus laevis.</a> Dev. Dyn. 236 (6), 1650-1662 (2007).</li>
<li>Yan, C. Y. I., Skourides, P., Chang, C., Samba Brivanlou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Xenopus+hnRNP+expressed+in+neural+and+neural+crest+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">a Xenopus hnRNP expressed in neural and neural crest tissues.</a> Dev. Dyn. 238 (1), 204-209 (2009).</li>
<li>Acloque, H., Adams, M. S., Fishwick, K., Bronner-Fraser, M., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transitions%3A+the+importance+of+changing+cell+state+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transitions: the importance of changing cell state in development and disease.</a> J. Clin. Invest. 119 (6), 1438-1449 (2009).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה מתאר טכניקה קלה explant NC גולגולת premigratory בעוברי laevis X.. העוברים המשמשים לניסויים כאלה צריכים להיות חזקים ולרפא היטב. לבטל את כל אצווה של עוברים בריאים. בנוסף, לגדול עוברים בטמפרטורות שונות (מ -12 ל 18-20 ° C), על מנת לכרות רכס עצבי בשלב 17 ולא מאוחר יותר. לאחר שלב 17, רכס עצבי עשוי להיות מעורב עם המזודרם cephalic ולא ניתן להסיר לחלוטין. רקמות Xenopus לרפא במהירות ולאחר מכן משוחררת ההידבקות שלהם לרקמות אחרות. חשוב לעבוד במהירות ומקום explants...

הרכס העצבי (NC) הוא אוכלוסיית תאים עוברית חולפת העולה מהצינור העצבי בסוף neurulation בעוברי החולייתנים. אירועי האיתות וגנטיים המפקחים על מפרט NC להתחיל מוקדם ככל gastrulation. NC זו שצוין בגבול בין עצבי והאאקטודרם אינו עצבי על ידי אותות מרקמות גב שמסביב. בסופו של neurulation, תאי NC לעבור מעבר אפיתל לmesenchyme (EMT) ולהעביר בהרחבה בעובר בעקבות מסלולים סטריאוטיפיים על ידי היענות לרמזים המקיפים מנחים. ברגע שהם הגיעו ליעד הסופי שלהם, הם להתמיין למגוון רחב של מכשירים פיננסיים נגזרים, למשל תאי עצב, גליה, עצם, סחוס, ותאי פיגמנט 1-5. בגלל תרומתם לסוגי תאים רבים וברקמות עובריים, פגמים בכל שלב בהתפתחות תאי NC, מאינדוקציה להתמיינות סופית, יכול לגרום לתסמונות מולדים בשם neurocristopathies 6. Eהמניפולציה xperimental של NC הפיתוח בשלבים שונים - מפרט, EMT, הגירה, ובידול - תשפר את ההבנה של neurocristopathies ולאפשר עיצוב של אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות. עובר laevis Xenopus הוא מודל של בחירה ללמוד פיתוח צפון קרוליינה. מספר גדול של עוברים הם קלים להשגה, והפריה חיצונית נותנת גישה לשלבים הראשונים של פיתוח. כלים רבים זמינים כדי לתפעל באופן ניסיוני X. laevis התפתחות עוברית. גן רווח של פונקציה ומציאה קל לביצוע על ידי microinjecting תאים בודדים של blastulas המוקדם. רקמות עוברי ניתן לחתוך לאיחוד מחדש במבחנה 7-11 או מבחני גב השתלת 12,13. בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד לנתח את NC גולגולת premigratory בX. laevis מאוחר neurulas, לפני ההגירה. יכול להיות מתורבת explants אלה על פיברונקטין-coateצלחות ד ללמוד הגירה והבחנה שבשליטה בתנאי ניסוי מבחנה. יכול גם להיות מורכב explants NC לעוברי מארח נורמלים או מניפולציה כדי ללמוד ההגירה והבידול שלהם in vivo.

<table><tbody><tr><td>פיברונקטין מפלזמה בקר</td><td>סיגמא</td><td>F4759-1MG</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר, Fraction V</td><td>Euromedex</td><td>04-100-811-C</td><td>דרגה באיכות נמוכה יותר עשויה להתאים ליישום זה</td></tr><tr><td>סיכות חרקים מנירוסטה, גודל 000</td><td>FST</td><td>26001</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 מלקחיים 0.05 מ"מ x 0.02 מ"מ</td><td>FST</td><td>11252-20</td><td></td></tr></tbody></table>

dissection של<em&gt; laevis xenopus</em&gt; העצבי קרסט עבור<em&gt; במבחנה</em&gt; explant תרבות או<em&gt; in vivo</em&gt; השתלות

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

הרכס העצבי (NC) הוא אוכלוסיית תאים בצינור עצבי הגבי חולפת שעוברת מעבר אפיתל לmesenchyme (EMT) בסוף neurulation, נודד בהרחבה לאיברים שונים, ומבדיל בסוגים רבים של מכשירים נגזרים (נוירונים, גליה, סחוס ועצם, תאי פיגמנט ומערכת האנדוקרינית). בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד לנתח את NC גולגולת premigratory מעוברי Xenopus laevis, במטרה ללמוד פיתוח NC in vivo ו במבחנה. מודל הצפרדע מציע יתרונות רבים ללמוד פיתוח מוקדם; קבוצות בשפע זמינות, עובר לפתח במהירות, in vivo רווח והפסד של אסטרטגיות פונקציה לאפשר מניפולציה של ביטוי גנים לפני לנתיחה NC בתורם ו / או עוברי מארח. יכול להיות מצופה explants NC בפיברונקטין ומשמש למחקרים במבחנה. הם יכולים להיות מתורבת במשך כמה ימים במדיום מוגדר חופשי בסרום. אנו גם מתארים כיצד להרכיב explants NC בחזרהלעוברי מארח לחקר נדידת NC ובידול in vivo.

כאשר מצופים על פיברונקטין, explants הרכס העצבי לצרף במהירות (15-30 דק &#39;) וexplant מתפשט שטוח בתוך שעה 2 (איור 1 א). אחרי 3-6 תאי שעות יתחילו להתפזר. ב24 שעות ב15 מעלות צלזיוס, תאים רבים החלו להגר מן explant (איורים 1B ו 1C). חלמון גורם לתאים בהירים מאוד תחת בניגוד שלב (איור 1). בליטות תא (filopodes וlamellipodes) נראות בבירור לאחר phalloidin הכתמה של שלד התא אקטין (תרשים 1C). <p class="jov...

פרוטוקול זה מתאר כיצד לנתח פסגת premigratory גולגולת עצבית (NC) מneurulas laevis Xenopus. יכול להיות מצופה explants אלה בפיברונקטין ותרבית במבחנה, או מורכב בחזרה לעוברי מארח. טכניקה זו מאפשרת חקר המנגנונים של מעבר NC האפיתל לmesenchyme, הגירה, ובידול.

Dissection של<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; העצבי קרסט עבור<em&gt; במבחנה</em&gt; Explant תרבות או<em&gt; In vivo</em&gt; השתלות

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

המטרה הכללית של הפרוצדורה הבאה היא לעקוב אחר נדידת תאי רב המגמות (neural crest) של opus Lavis. מטרה זו מושגת תחילה על ידי דיסקציה של רב המגמות מעוברים בשלב העצבי. בשלב השני, מושתלים הרקמות (explants) בצלחת מצופה בפיברונקטין כדי לחקור את נדידת התאים שלהם in vitro.לחלופין, לאחר הסרת הרבדי העצביים (neural crest) מעובר מאכסן, ניתן להשקיע מחדש את השתלים כדי לעקוב אחר נדידתם in vivo. באופן סופי, ניתן לחקור את תרומת נדידת תאי הרבדי העצביים העובריים להתפתחות של opus lavis. באופן כללי, אנשים שאינם מורגלים בשיטה זו עשויים למצוא אותה קשה, כיוון שעוברים בשלבים מוקדמים הם שבירים.הרב רב-קומי (neural crest) הוא אוכלוסיית תאים קטנה למדי, ועליכם להכין את כלי הניתוח בעצמכם. ההדגמה החזותית של פרוטוקול זה היא קריטית. כל שלב בתהליך הניתוח עבר אופטימיזציה כדי להבטיח הסרה נקייה של ה-neuro quest.ביום הניסוי, קחו צלחת ניתוח של 60 מילימטרים המצופה בכ-10 מיליליטרים של 2% agar, ומלאו אותה בשלושה רבעי נפחה בתוכ המדומה של דו-חיים (normal amphibian medium) או ב-NAM, עד כמעט למעלה. לאחר מכן, השתמשו בפיפטת פסטור מפלסטיק כדי להעביר עוברים של *Xenopus laevis* משלב 16 אל הצלחת, והניחו את הצלחת תחת מיקרוסקופ בינוקולרי באמצעות שתי מערכות של פינצטות. הסירו את קרום הוויטלין (vitelline membrane) מהעוברים, תוך הקפדה שלא לפ

dissection-xenopus-laevis-neural-crest-for-vitro-explant-culture-or

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

תרבויות Explant עצביות מן<em&gt; Xenopus laevis</em

Mesenchyme הגולגולת עובר תנועות morphogenic דרמטיות שעשויים מספקת כוח מניע לגובה של הקפלים...

Assay Explant להערכת התנהגות ניידת של mesenchyme הגולגולת

Xenopus laevis מספק מערכת מודל אידיאלית ללימוד מפרט גורל תא ותפקוד פיסיולוגי של תאי רשתית בודדים בתרבית תאים ראשוניות. כאן אנו מציגים טכניקה לביתור רקמות רשתית ויצירת תרביות תאים ראשוניות שהם צלמו לפעילות הסידן ונותחו על ידי כלאה באתר.

Dissection, תרבות וניתוח של<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; רקמת רשתית עוברית

כאן אנו מפתחים את הכלים הדרושים...

Ex vivo הדמיה חיה של חלוקות תא יחיד בNeuroepithelium מאוס

סרטון זה מדגים טכניקה לבידוד קפלים עצביים גולגולתיים מאזור המוח התיכון של עוברי אפרוחים. הוא מציג תהליך דיסקציה מפורט של הקפלים העצביים, מיקומם וחיבורם על כיסויים מצופים פיברונקטין ואחריו תצפית על נדידת תאי הפסגה העצבית מהקפלים העצביים.

בידוד קפלים עצביים גולגולתיים מעובר אפרוח לצורך תרבית תאי קרסט עצבית

פרוטוקול זה מתאר הליך explant משופר...

לשעבר הרחם electroporation וexplants חצי כדור שלם: שיטה ניסיונית פשוטה למחקרים בהתפתחות קליפת מוח הקדומה

טכניקה להשתלה "אקסטרים Anterior דומיין" רקמות פנים בין Xenopus laevis עובר כבר מפותחת. רקמה ניתן להעביר מהרקע ביטוי גנים אחת לאחרת, ומאפשרת הלימוד של דרישות מקומיות לפיתוח craniofacial ולאיתות אינטראקציות בין אזורי פנים.

השתלת פנים ב<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; עוברים

בעוברי קסנופוס, תאים מגג הבלסטוקואל הם פלוריפוטנטיים וניתן לתכנת אותם ליצירת רקמות שונות. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים לשימוש בצמחי גג בלסטוקואל דו-חיים כמערכת בדיקה לחקירת תכונות מפתח in vivo  ו-in vitro של התפתחות עצבית מוקדמת.

כמו תא גזע<em&gt; Xenopus</em&gt; Explants העובריים לחקר תכונות המוקדמות עצבי התפתחותית<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

מעבר אפיתל למזנכימלי (EMT) מאפשר לסרטן להפוך לפולשני. כדי לחקור EMT, מתואר מודל מבחנה מבוסס תאי גזע עצביים (NSC) נטול סרום ואנזימים. מערכת סטנדרטית זו מאפשרת הערכה כמותית ואיכותית של נדידת תאים, ביטוי גנים וחלבונים. המודל מתאים לגילוי תרופות.

Enzyme- ואת הסרום ללא דגם תרבית תאי גזע עצבי לחקירות EMT המתאימים גילוי תרופות

פרוטוקול זה מתאר את הניתוח והתרבות של תאי ציצה עצביים הגולגולת מדגמי העכבר, בעיקר למחקר של הגירה תא. אנו מתארים את טכניקות ההדמיה החי בשימוש וניתוח של מהירות וצורה תא שינויים.

חיתוך, תרבות וניתוח של הגולגולת הראשי ציצה עצביים תאים מעכבר לחקר של ציצה של תא העצבים העצבי והגירה

אנו מציגים פרוטוקול דו-חלקי המשלב הדמיה של סידן פלורסנט עם היברידיזציה באתרו, ומאפשר לניסויים לתאם דפוסים של פעילות הסידן עם פרופילי ביטוי גנים ברמה של תא אחד.

סידן פלואורסצנטי הדמיה ובעקבות היברידיזציה באתרו לאפיון עצבי בלתי מבשר בקספוס זריזה

למדו ניתוח של קרסט עצבי קרניאלי מ-Xenopus laevis לתרבות אקספלנטים או השתלות in vivo. שיטה זו מאפשרת מעקב אחרי נדידת תאים והתמיינות בביולוגיה התפתחותית.

Dissection של

גלה סרטונים נוספים