רב שכבתי וההרכבה למיקרוסקופיה גיליון אור לטווח ארוך של דג הזברה

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא קיבוע של עובר דג זברה לצורך מיקרוסקופיית גילי אור (light sheet microscopy) ארוכת טווח in vivo. דבר זה מושג תחילה על ידי ניקוי של צינור פלואורין אתילן פרופילן (FEP) וציפויו ב-Methylcellulose. לאחר מכן, עובר דג זברה רלוונטי מצופה.

לאחר מכן, העובר מועבר תחילה לאגרוז מומס, ואז לשפופרת FEP מצופה. לבסוף, תחתית השפופרת נסגרת באמצעות פקק aros והאוריינטציה של העובר המותקן נבדקת בקפידה. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות התפתחות לא מופרעת של עוברי zebra fish לאורך מספר ימים, ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה, באמצעות מיקרוסקופיית light sheet in vivo.

היתרון העיקרי על פני טכניקות קיימות הוא שכעת ניתן לצפות בעוברים של דגי זברה במשך מספר ימים ולא רק למשך מספר שעות. שיטה זו יכולה לספק תובנות בעלות ערך לגבי האמבריוגנזה ארוכת הטווח של דג הזברה באמצעות מיקרוסקופיית light sheet. ניתן להחיל אותה גם על אורגניזמים קטנים אחרים, כגון אורגניזמים ימיים קטנים.

ניתן להשתמש בשיטה זו גם עם טכניקות מיקרוסקופיות אחרות, כגון טומוגרפיה של היטלה אופטית (optical projection tomography), מיקרוסקופיית שדה רחב (widefield microscopy) או מיקרוסקופיה קונפוקלית. אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו עלולים להיתקל בקשיים, כיוון שהפרוטוקול כולל מספר שלבים תלויי זמן, וקביעת המיקום הסופי של העובר דורשת מומחיות. להכנת צינור FEP, ראשית, יש לנקות אותו על ידי שטיפה חוזרת עם sodium hydroxide בריכוז 1 molar. לאחר מכן, העבירו את הצינור לתוך מבחנת צנטריפוגה של 50 milliliter המלאה ב-sodium hydroxide בריכוז 0.5 molar, ובצעו סוניקציה במשך 10 דקות.

העבירו את צינור הפולימר לאגן קטן המכיל מים מזוקקים דה-יוניים ושטפו אותו. לאחר מכן, בצעו שטיפה ב-70% ethanol לפני העברתו לצינור צנטריפוגה נקי. עם ethanol ultras.

בצע סוניקציה למבחנה למשך 10 דקות לפני העברתה לאגן קטן עם מים מזוקקים ומדה-יונים ושטיפתה. שוב. חתוך את מבחנת ה-FEB הנקייה לחתיכות באורך של שלושה סנטימטרים ויישר אותן במידת הצורך. אחסן את המבחנות המנוקות במבחנה חדשה של 50 מיליליטר המלאה במים מזוקקים ומדה-יונים.

הכן תמיסת סטוק של Trica. 3% Methylcellulose וכן 1.5% ו-0.1% Aros בהתאם לפרוטוקול הטקסט. המס 1.5% agarro ושפוך אותו לתוך צלחת פטרי כדי ליצור שכבה בעובי של כשני מילימטרים.

אספו עוברים של zebrafish בשלב הרצוי אשר ביטאו באופן חיובי את הגן הפלואורסצנטי הנבחר, והעבירו אותם לכלי חדש המכיל E three תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי. באמצעות שתי פינצטות חדות, קלפו בזהירות את העוברים על ידי שימוש בפינצטה אחת להחזקת ה-corion ובפינצטה השנייה כדי לקרוע אותו ולהסירו לצורך ביצוע הרכבה רב-שכבתית. בעזרת ידיים כפופות בכפפות, חברו קנולה בעלת קצה קהה למזרק.

הכנס בזהירות את הקנולה לעומק של כ-3 מילימטרים לאחד הקצוות של קטע נקי של צינור FEP. לאחר מכן, טבול את הקצה החופשי של צינור ה-FEP ב-3% Methylcellulose ומלא את הצינור בתמיסה. לאחר מכן, לחץ באיטיות על המזרק כדי לשחרר את ה-methylcellulose באמצעות תוך E three, וחזור על שלבי הטבילה והריקון.

בינתיים, בבלוק חימום, חממו אליקוט אחת של 0.1%aros ל-70 degrees Celsius. ערבבו את מבחנת התגובה בקצרה באמצעות וורטקס לפני העברתה לבלוק חימום המכוון ל-38 degrees Celsius. לאחר החימום, אפשרו למבחנה להתקרר קצרה והוסיפו trica לריכוז סופי של 133 עד 200 milligrams per liter וערבבו בוורטקס.

שוב, בעזרת פיפטת פסטור מזכוכית, העבירו עובר מצופה למבחנת התגובה עם ה-aros שחומם מראש, תוך העברה של כמות מזערית ככל הניתן של E three. בעזרת מבחנת ה-FEP והמזרק המחובר אליה, שאבו בעדינות כמות קטנה של aros לפני שאיבת העובר, ומלאו את המבחנה לחלוטין ב-aros.

יש למקם את העובר באחד מקצות המבחנה, כאשר הראש פונה לכיוון הפתח. כדי למנוע דליפה של התוכן, יש להחזיק את המבחנה במצב אופקי כדי לחסום אותה. השתמש להב תער כדי לחתוך אותו מהקנולה.

לאחר מכן, החזקו את המבחנה בניצב, הכניסו באיטיות את קצה המבחנה דרך כל שכבת ה-1.5%aros וסובבו אותה מעט. כדי למנוע התייבשות, השאירו את הדגימה המורכבת בתוך מבחנת תגובה של 1.5 milliliter מלאה בתווך E three לפני הדמיה. ודאו כי הדג בתוך מבחנת ה-FEP ממוקם בצורה ישרה, וכי ראשו מונח ישירות על הפקק לצורך ההדמיה.

הוסיפו trica למצע בתוך תא ההדמיה. מוצג כאן עובר דג זברה טרנסגני K-G-R-L-G-F-P, יום אחד לאחר ההפריה, אשר הודמיה לאורך יומיים כדי לצפות בהתפתחות של מערכת כלי הדם.

דגי הזברה אינם מוגבלים על ידי תוך הקיבוע ויכולים להתפתח באופן נורמלי. לדוגמה, ראשם מורם. הזנב נמתח והנבטות של כלי דם מופיעות ללא הפרעה.

ניתן לבצע טכניקה זו בתוך 10 דקות אם היא מבוצעת כראוי וכל החומרים זמינים. זכרו לבצע את כל השלבים העיקריים ללא עיכוב. שמרו על ניקיון כל התמיסות, כיוון שלכלוך עלול לפגוע באיכות התמונה הסופית.