ג. אלגנס Chemotaxis Assay
Chemotaxis הוא תהליך שבו תאים או אורגניזמים נעים בתגובה לגירוי כימי. בטבע, chemotaxis חשוב עבור אורגניזמים לחוש ולהתקדם לעבר מקורות מזון ולהתרחק גירוי…
התנועה של תא או אורגניזם בתגובה לגירוי כימי היא התנהגות הנקראת chemotaxis. בסרטון זה, נלמד כיצד לבצע chemotaxis assay באמצעות נמטודה, C. elegans. כמו כן נדון באופן שבו מתבצעות בחינה כימוטקסית ב- C. elegans כדי ללמוד למידה וזיכרון, הסתגלות חוש הריח ומחלת אלצהיימר.
בואו נדבר תחילה על שני סוגים שונים של כימוטקסיס. תנועה לעבר גירוי כימי נקראת כימוטקסיס חיובי. לעומת זאת, תנועה הרחק מגירוי כימי נקראת כימוטקסיס שלילי, ומאפשרת לאורגניזמים להתרחק מכימיקלים מזיקים.
Chemotaxis יכול להתרחש ברמה האורגנית, כמו אורגניזמים לנוע לכיוון מקור מזון. Chemotaxis מתרחש גם ברמה התאית, בתוך אורגניזמים. לדוגמה, תאי מערכת החיסון נודדים לכיוון פתוגנים או אתרים של דלקת. בדוגמה אחרת, תאי זרע נעים לכיוון הביצית בתגובה למושך כימותרפיה ששוחרר על ידי הביצית. Chemotaxis הוא גם תהליך חשוב במהלך ההתפתחות, שבו תאים נודדים בתגובה לגירוי כימי, ויוצרים רקמות ואיברים באורגניזם המתפתח.
עבור C. elegans פראי, השוכן בקרקע, כימוטקסי חשוב לגילוי ותנועה כלפי חיידקים, מקור המזון העיקרי שלהם. לעומת זאת, C. elegans נדחים על ידי מתכות כבדות, חומרים עם pH נמוך, וחומרי ניקוי, אשר רעילים לאורגניזם.
Chemotaxis assays בדרך כלל להתחיל על ידי הכנת לוחות חמוטקס. בעזרת סרגל וסמן, מחלקים צלחת של 5 ס"מ עם בינוני צמיחה נמטודה לארבעה רבעים שווים. לאחר מכן, צייר עיגול ברדיוס של 0.5 ס"מ סביב מרכז הרביע. זו תהיה נקודת המוצא של התולעים. סמן וסמן נקודה בכל רבע, כך שכל נקודה שווה מהמרכז, ומן זה.
בעת הכנת תולעים לבדיקה, זה קריטי להשתמש תולעים צעירות מסונכרנות גיל, כך הבדלים chemotaxis אינם חפץ של השלב ההתפתחותי. לאחר תולעים מסונכרנות, לאסוף אותם על ידי צנרת ראשונה 2 מ"ל של חוצץ S-בזאלי על צלחת המכילה צעירים. מערבבים ומטה את הצלחת כדי לשטוף את התולעים מהצלחת.
לאחר מכן, pipette פתרון תולעת / S-basal לתוך צינור microcentrifuge. לשטוף את התולעים על ידי צנטריפוגה קצרה של פתרון התולעת / S-basal, הסרת supernatant, והוספת מיליליטר נוסף של פתרון S-basal לכדור התולעת. הפוך את הצינור ולחזור על לשטוף פעמיים נוספות. לאחר הכביסה, להסיר את כל אבל כ 100 μl של פתרון S-basal. לאחר מכן, מוסיפים 2 מיקרול של תערובת תולעת / S-בזאלי לצלחת NGM. באמצעות מיקרוסקופ, לספור את מספר התולעים הנוכחיות. באופן אידיאלי, יהיו בין 50-250 תולעים לכל 2 מיקרול של S-basal.
עכשיו, כאשר לוחות הכימוטקסי והתולעים מוכנים, אנחנו יכולים להתחיל על תפילת הכימוטקסי. ראשית, מערבבים נפחים שווים של פתרון הבדיקה שלך עם 0.5 M נתרן אזיד, חומר הרדמה שישתק תולעים ברגע שהם מגיעים ליעדם. עשה את אותו הדבר עם פתרון השליטה שלך. לאחר מכן, פיפטה 2 מיקרול של תערובת תולעת / S-בזאלי על מרכז צלחת chemotaxis שלך. לאחר מכן, pipette 2 μl של פתרון הבדיקה או הפקדה ומניחים על נקודות מתויגות כראוי על צלחת chemotaxis. לאחר שפתרונות הבדיקה והבקרה נספגו, הניחו את המכסה בחזרה, הפכו את הצלחת והגדירו טיימר לשעה.
לאחר שהתולעים קיבלו שעה אחת להגיב לגירויים הכימיים על הצלחת, ניתן לנתח את הנתונים. ספר באופן ידני את מספר התולעים בתוך כל רבע. אם התולעים נמשכות לכימיקל הבדיקה, יהיו יותר תולעים ברביעים האלה. אם הם ניטרליים כלפי הכימיקל הזה, התולעים יהיו נוכחות בכל רבע באופן שווה.
השתמש בנתונים אלה כדי לחשב את האינדקס הכימי, שהוא מספר התולעים ברביעי הבדיקה פחות מספר התולעים ברביע הבקרה, חלקי המספר הכולל של תולעים. אינדקס כימי קרוב +1 מרמז על משיכה, בעוד אינדקס כימי קרוב -1 מצביע על דחייה.
עכשיו שלמדנו איך להקים מבחן כימוטקסיס, בואו נסתכל על האופן שבו הניסויים האלה מיושמים כדי לענות על שאלות מדעיות.
אחת הדרכים שבהן יושמה בדיקת כימוטקסי ב- C. elegans היא ללימוד למידה וזיכרון. לדוגמה, תולעים יכולות להיות מותנות לקשר גירוי כימי למקור מזון. תולעים מאכילות היטב מורעבות במשך שעה אחת, ואז הן מותנות במזון, כמו גם בכימיקל כמו בוטנון.
לאחר מכן, התולעים מוחזקות על צלחת עם אוכל, אבל בלי בוטנון. הרצת כומוטסיס תקבע אם התולעים למדו לקשר את בוטאנון למזון. וריאציות רבות של ניסוי זה ניתן לבצע כדי לקבוע מידע אחר כגון אילו גנים או נוירונים חשובים ללמידה וזיכרון.
הסתגלות חוש הריח היא תופעה המתרחשת כאשר נוירונים חושיים להקטין את התגובה שלהם לגירוי לאורך זמן, ומאפשר את החיה להגיב לגירויים אחרים, אולי חשוב יותר. לדוגמה, אלגנים מסוג בר C. שנחשפו לריח במשך תקופה מסוימת, יתעלמו מהריח הזה במהלך בדיקת כימוטקסיס עקב הסתגלות חוש הריח, במקום להימשך אליו. לכן, מסכים גנטיים תפוקה גבוהה ניתן לבצע כדי לחשוף את הרגולטורים הגנטיים של הסתגלות חוש הריח, כגון egl-4. בנוסף, תולעים מהונדסות המבטאות חלבונים מתויגים פלואורסצנטית ניתן לראות לשינויים לוקליזציה במהלך הסתגלות חוש הריח.
לבסוף, ניתן להשתמש ב- C. elegans כדי לחקור מחלת אלצהיימר. מדענים יכולים לבטא פפטיד עמילואיד אנושי מתויג פלואורסצנטית - סימן היכר של מחלת אלצהיימר - בתאי העצב של C. elegans. מעניין, chemotaxis assays גילה כי תולעים המבטאות עמילואיד בטא באוכלוסייה של נוירונים להראות כימוטקסיה מופחתת כלפי מושך כימותרפיה בהשוואה לשליטה. וריאציות רבות של ניסוי זה יכול להתבצע, כולל הבעת עמילואיד בטא באוכלוסיות נוירונים אחרים או רקמות, או קביעת אם כל תרכובות יכול להקל על ההשפעות של ביטוי בטא עמילואיד, בסופו של דבר מוביל לטיפול פוטנציאלי.
הרגע צפית בהקדמה של ג'וב לכימוטקסי בסי אלגנס. ראשית, הגדרנו מהו כימוטקסיס ומדוע הוא חשוב בטבע לאורגניזמים ולתאים. ואז הדגמנו איך לבצע אסיפת כימוטקסיס עם C. elegans. לבסוף, דנו כיצד ניתן ליישם כימוטקסי כדי להבין למידה וזיכרון, הסתגלות חוש הריח ומחלת אלצהיימר. תודה שצפיתם!
התנועה של תא או אורגניזם בתגובה לגירוי כימי היא התנהגות הנקראת chemotaxis. בסרטון זה, נלמד כיצד לבצע chemotaxis assay באמצעות נמטודה, C. elegans. כמו כן נדון באופן שבו מתבצעות בחינה כימוטקסית ב- C. elegans כדי ללמוד למידה וזיכרון, הסתגלות חוש הריח ומחלת אלצהיימר.
בואו נדבר תחילה על שני סוגים שונים של כימוטקסיס. תנועה לעבר גירוי כימי נקראת כימוטקסיס חיובי. לעומת זאת, תנועה הרחק מגירוי כימי נקראת כימוטקסיס שלילי, ומאפשרת לאורגניזמים להתרחק מכימיקלים מזיקים.
Chemotaxis יכול להתרחש ברמה האורגנית, כמו אורגניזמים לנוע לכיוון מקור מזון. Chemotaxis מתרחש גם ברמה התאית, בתוך אורגניזמים. לדוגמה, תאי מערכת החיסון נודדים לכיוון פתוגנים או אתרים של דלקת. בדוגמה אחרת, תאי זרע נעים לכיוון הביצית בתגובה למושך כימותרפיה ששוחרר על ידי הביצית. Chemotaxis הוא גם תהליך חשוב במהלך ההתפתחות, שבו תאים נודדים בתגובה לגירוי כימי, ויוצרים רקמות ואיברים באורגניזם המתפתח.
עבור C. elegans פראי, השוכן בקרקע, כימוטקסי חשוב לגילוי ותנועה כלפי חיידקים, מקור המזון העיקרי שלהם. לעומת זאת, C. elegans נדחים על ידי מתכות כבדות, חומרים עם pH נמוך, וחומרי ניקוי, אשר רעילים לאורגניזם.
Chemotaxis assays בדרך כלל להתחיל על ידי הכנת לוחות חמוטקס. בעזרת סרגל וסמן, מחלקים צלחת של 5 ס"מ עם בינוני צמיחה נמטודה לארבעה רבעים שווים. לאחר מכן, צייר עיגול ברדיוס של 0.5 ס"מ סביב מרכז הרביע. זו תהיה נקודת המוצא של התולעים. סמן וסמן נקודה בכל רבע, כך שכל נקודה שווה מהמרכז, ומן זה.
בעת הכנת תולעים לבדיקה, זה קריטי להשתמש תולעים צעירות מסונכרנות גיל, כך הבדלים chemotaxis אינם חפץ של השלב ההתפתחותי. לאחר תולעים מסונכרנות, לאסוף אותם על ידי צנרת ראשונה 2 מ"ל של חוצץ S-בזאלי על צלחת המכילה צעירים. מערבבים ומטה את הצלחת כדי לשטוף את התולעים מהצלחת.
לאחר מכן, pipette פתרון תולעת / S-basal לתוך צינור microcentrifuge. לשטוף את התולעים על ידי צנטריפוגה קצרה של פתרון התולעת / S-basal, הסרת supernatant, והוספת מיליליטר נוסף של פתרון S-basal לכדור התולעת. הפוך את הצינור ולחזור על לשטוף פעמיים נוספות. לאחר הכביסה, להסיר את כל אבל כ 100 μl של פתרון S-basal. לאחר מכן, מוסיפים 2 מיקרול של תערובת תולעת / S-בזאלי לצלחת NGM. באמצעות מיקרוסקופ, לספור את מספר התולעים הנוכחיות. באופן אידיאלי, יהיו בין 50-250 תולעים לכל 2 מיקרול של S-basal.
עכשיו, כאשר לוחות הכימוטקסי והתולעים מוכנים, אנחנו יכולים להתחיל על תפילת הכימוטקסי. ראשית, מערבבים נפחים שווים של פתרון הבדיקה שלך עם 0.5 M נתרן אזיד, חומר הרדמה שישתק תולעים ברגע שהם מגיעים ליעדם. עשה את אותו הדבר עם פתרון השליטה שלך. לאחר מכן, פיפטה 2 מיקרול של תערובת תולעת / S-בזאלי על מרכז צלחת chemotaxis שלך. לאחר מכן, pipette 2 μl של פתרון הבדיקה או הפקדה ומניחים על נקודות מתויגות כראוי על צלחת chemotaxis. לאחר שפתרונות הבדיקה והבקרה נספגו, הניחו את המכסה בחזרה, הפכו את הצלחת והגדירו טיימר לשעה.
לאחר שהתולעים קיבלו שעה אחת להגיב לגירויים הכימיים על הצלחת, ניתן לנתח את הנתונים. ספר באופן ידני את מספר התולעים בתוך כל רבע. אם התולעים נמשכות לכימיקל הבדיקה, יהיו יותר תולעים ברביעים האלה. אם הם ניטרליים כלפי הכימיקל הזה, התולעים יהיו נוכחות בכל רבע באופן שווה.
השתמש בנתונים אלה כדי לחשב את האינדקס הכימי, שהוא מספר התולעים ברביעי הבדיקה פחות מספר התולעים ברביע הבקרה, חלקי המספר הכולל של תולעים. אינדקס כימי קרוב +1 מרמז על משיכה, בעוד אינדקס כימי קרוב -1 מצביע על דחייה.
עכשיו שלמדנו איך להקים מבחן כימוטקסיס, בואו נסתכל על האופן שבו הניסויים האלה מיושמים כדי לענות על שאלות מדעיות.
אחת הדרכים שבהן יושמה בדיקת כימוטקסי ב- C. elegans היא ללימוד למידה וזיכרון. לדוגמה, תולעים יכולות להיות מותנות לקשר גירוי כימי למקור מזון. תולעים מאכילות היטב מורעבות במשך שעה אחת, ואז הן מותנות במזון, כמו גם בכימיקל כמו בוטנון.
לאחר מכן, התולעים מוחזקות על צלחת עם אוכל, אבל בלי בוטנון. הרצת כומוטסיס תקבע אם התולעים למדו לקשר את בוטאנון למזון. וריאציות רבות של ניסוי זה ניתן לבצע כדי לקבוע מידע אחר כגון אילו גנים או נוירונים חשובים ללמידה וזיכרון.
הסתגלות חוש הריח היא תופעה המתרחשת כאשר נוירונים חושיים להקטין את התגובה שלהם לגירוי לאורך זמן, ומאפשר את החיה להגיב לגירויים אחרים, אולי חשוב יותר. לדוגמה, אלגנים מסוג בר C. שנחשפו לריח במשך תקופה מסוימת, יתעלמו מהריח הזה במהלך בדיקת כימוטקסיס עקב הסתגלות חוש הריח, במקום להימשך אליו. לכן, מסכים גנטיים תפוקה גבוהה ניתן לבצע כדי לחשוף את הרגולטורים הגנטיים של הסתגלות חוש הריח, כגון egl-4. בנוסף, תולעים מהונדסות המבטאות חלבונים מתויגים פלואורסצנטית ניתן לראות לשינויים לוקליזציה במהלך הסתגלות חוש הריח.
לבסוף, ניתן להשתמש ב- C. elegans כדי לחקור מחלת אלצהיימר. מדענים יכולים לבטא פפטיד עמילואיד אנושי מתויג פלואורסצנטית - סימן היכר של מחלת אלצהיימר - בתאי העצב של C. elegans. מעניין, chemotaxis assays גילה כי תולעים המבטאות עמילואיד בטא באוכלוסייה של נוירונים להראות כימוטקסיה מופחתת כלפי מושך כימותרפיה בהשוואה לשליטה. וריאציות רבות של ניסוי זה יכול להתבצע, כולל הבעת עמילואיד בטא באוכלוסיות נוירונים אחרים או רקמות, או קביעת אם כל תרכובות יכול להקל על ההשפעות של ביטוי בטא עמילואיד, בסופו של דבר מוביל לטיפול פוטנציאלי.
הרגע צפית בהקדמה של ג'וב לכימוטקסי בסי אלגנס. ראשית, הגדרנו מהו כימוטקסיס ומדוע הוא חשוב בטבע לאורגניזמים ולתאים. ואז הדגמנו איך לבצע אסיפת כימוטקסיס עם C. elegans. לבסוף, דנו כיצד ניתן ליישם כימוטקסי כדי להבין למידה וזיכרון, הסתגלות חוש הריח ומחלת אלצהיימר. תודה שצפיתם!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the difference between positive and negative chemotaxis?
Positive chemotaxis is movement toward a chemical stimulus, while negative chemotaxis is movement away from it. Organisms use positive chemotaxis to move toward food sources or beneficial stimuli. Negative chemotaxis allows organisms to avoid harmful chemicals like heavy metals, acidic substances, or detergents that may be toxic.
Q2: Why is age synchronization important when preparing C. elegans for a chemotaxis assay?
Age synchronization ensures all worms are at the same developmental stage, preventing differences in chemotaxis behavior from being artifacts of development rather than true responses to chemical stimuli. Using young adult worms of uniform age provides consistent, reliable data for accurate experimental results and supports studies of development and reproduction caenorhabditis elegans.
Q3: How is the chemotactic index calculated and what do the values indicate?
The chemotactic index equals the number of worms in test quadrants minus worms in control quadrants, divided by total worms. A value close to +1 indicates strong attraction to the test chemical, while a value close to -1 indicates repulsion. Values near zero suggest the worms are neutral toward that chemical stimulus.
Q4: What role does sodium azide play in a C. elegans chemotaxis assay?
Sodium azide is an anesthetic mixed with test and control solutions at 0.5 M concentration. When worms reach their destination on the chemotaxis plate, sodium azide paralyzes them, allowing researchers to count their final positions accurately without worms continuing to move during data collection.
Q5: How can chemotaxis assays be used to study learning and memory in C. elegans?
Researchers condition starved worms by pairing a chemical stimulus like butanone with food. Worms are then placed on plates with food but without the chemical. A chemotaxis assay determines whether worms learned to associate the chemical with food, revealing genetic and neuronal mechanisms underlying learning and memory formation.
Q6: What is olfactory adaptation and how does it affect chemotaxis assay results?
Olfactory adaptation occurs when sensory neurons decrease their response to a stimulus over time, allowing animals to focus on other stimuli. Wild-type C. elegans exposed to an odor will ignore it during a chemotaxis assay due to olfactory adaptation rather than being attracted to it, enabling genetic screens to identify regulatory genes like egl-4.
Q7: How do chemotaxis assays help researchers study Alzheimer's disease using C. elegans?
Scientists express fluorescently tagged human amyloid beta peptide, a hallmark of Alzheimer's disease, in C. elegans neurons. Chemotaxis assays reveal that worms expressing amyloid beta show reduced chemotaxis toward chemo-attractants compared to controls, providing insights into how the disease affects neural function and potential therapeutic interventions.