מיקרוסקופית Intravital הפסים תאורה נפתר מאוד של מרכזי ז'רמינל

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להכין מיקרוסקופ פוטונים כפולים סטנדרטי להדמיה תוך-חיה (intra vital) ברזולוציה גבוהה. דבר זה מושג תחילה על ידי כיול המיקרוסקופ, הכולל כוונון הלייזרים. לאחר מכן, המפלטר (multiplexer) של הקרן מכויל כדי להשיג צורת קרן וסידור תאורה אופטימליים.

במקרה של סריקה רב-קרן, התמונות הגולמיות נרכשות על ידי סריקת הדגימה באמצעות תבנית ההארה הפסית. לבסוף, מיושם אלגוריתם לחישוב התמונה הסופית ברזולוציה גבוהה. בסופו של דבר, מיקרוסקופיית הארה פסית משמשת להצגת פרטים של התנהגות מערכת החיסון בתוך מרכזי הנבטה בבלוטות הלימפה של עכברים, פרטים שהיו בלתי נגישים בעבר למיקרוסקופיה תוך-חיה (intra vital microscopy).

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תאורה מובנית (structured illumination) או מיקרוסקופיית לוקליזציה, הוא שניתן ליישמה בעומקים רבים של רקמה בדגימות חיות. היא אינה דורשת כל שינוי בצורת קרן הלייזר, ובכך שומרת על שיטה פשוטה מאוד וקלה ליישום בכל מיקרוסקופ רב-פוטוני. המערך המשמש למיקרוסקופיית תאורה מפסית דו-פוטונית רב-קרנית מוצג כאן כדי להשיג רזולוציה ואיכות ניגודיות אופטימליות עם הרמה הנמוכה ביותר של פוטו-בליצ'ינג (photo bleaching) והרכישה המהירה ביותר.

שקלו לבצע התאמות בהגדרות המערכת כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר ביצוע ההתאמות, ודאו שהקרן חוזרת למראה הממוקמת ישירות מעל מראת הכניסה בקצה דחס הפולסים המבוסס על מנסרה. לאחר קביעת נתיב האור משלב זה, הקרן מוחזרת אל מרוכז הקרניים (beam multiplexer).

בביצוע הארה רב-קרנית מפסית, מיקרוסקופיה רב-פוטונית כאשר הסורק כבוי. יישרו את המראות במפלטר הקרניים (beam multiplexer) על ידי הנחת דגימה בעלת פלואורסצנציה הומוגנית על הבמה, ומקדמו את קרן הלייזר בתוך הדגימה, אך קרוב למשטח העליון. בקרבת העדשה הקדמית של העדשה אובייקטיבית.

הגדירו את המיקרוסקופ למצב רב-אלומות (multi-beam) ובחרו את מספר האלומות ואת הקיטוב. לדוגמה, כדי למצוא את אלומת הלייזר P באמצעות דימוי של השקופית הפלואורסצנטית, פתחו את התריס של P והפעילו את מצלמת ה-CCD באופן רציף תוך כדי מיקוד האלומת, וודאו שהיא נמצאת במיקום מרכזי. בעת יישור אלומת P, העבירו את המפסק למצב של 64 אלומות ופתחו את התריס המתאים.

בדקו את מיקום הקרן. כווננו את מראות המולטיפלקסר של הקרן הראשונה עד החמישית, תוך הבטחה כי נקודות התאורה של הקרן נמצאות במרחקים שווים. מכיוון שאלגוריתמי תאורה מפסית מבוססים על הנחה זו, החליפו את הדגימה הפלורסצנטית האחידה בדגימה בעלת מבנה הטרוגני.

לדוגמה, בצעו דגימה של אזור השורש ב-Conval וסרקו תמונה רב-קרנית. ודאו שהתמונה נראית חדה, אחידה וישרה. החליפו את הדגימה ההטרוגנית בדגימה ההומוגנית.

הפעל את סורק ה-XY כדי לשלוט בתהליך הסריקה. כדי להפיק את תבנית העירור של תמונת הפסים לסריקה רב-קרנית, הזז את מראת סורק ה-Y בניצב לקו הקרן המואר.

חזור על התבנית שנוצרה, כפי שצוין כאן במספר הבלוקים, על ידי הזזת מראת הסורק X, המכונה כאן block shift, כדי ליצור תמונה מפסית מלבנית. החזר את הדגימה ההטרוגנית והשתמש בסורק כטריגר הראשי. סנכרן את המצלמה עם הסורק כדי לרכוש ולשמור באופן אוטומטי תמונה מפסית, לצורך רכישה חוזרת של תמונות מפסית.

הזז את מראת סורק ה-X לעמדות שונות על ידי בחירת מספיק שלבי חזרה כאן, מספר הזזות ואורך צעד מתאים כאן. הגדר את צעד ההזזה בין שתי תמונות מפסות עוקבות כך שיכסה את המרחק בין שני רוחבי קרן רצופים. הגדר את הזזת ה-X לערך הנמוך מגבול הרזולוציה הלטרלית באורך גל העירור הנתון.

לדוגמה, שימוש ב-10 שלבים של מראת סורק X לכל הזזה ו-12 או 13 הזזות מובילים לרזולוציה מרחבית מיטבית. השתמשו בתוצאות עם שקופית השורש של אזור ה-conval כדי למטב את שני הערכים הללו עד שתמונת אזור ה-conval תהיה החדה ביותר. השתמשו בכלי פרופיל הקו (line profile tool) על תמונות ה-CCD הקונבנציונליות ועל תמונות התאורה הפסיתה המחושבות.

השוו את רוחב פרופילי הקו, שבדוגמה זו הם האות הפלואורסצנטי מדפנות תאים של conval. רכשו כל תמונת פסים גולמית בסנכרון עם תנועת הסורק ושמרו אותה בנפרד, למשל כקבצי TIFF או קבצים בינאריים. כדי להפיק מטריצה דו-ממדית של תמונת הארה בפסים ברזולוציה גבוהה, פתחו סט מלא של תמונות פסים גולמיות כמטריצות בשגרת ההערכה.

השתמש באלגוריתם המינימום-מקסימום או באלגוריתם המבוסס על התמרת פורייה, כפי שתואר בעבר בפירוט, כדי לבצע מיקרוסקופיית פוטונים מרובים, רב-קרנית, עם הארה מפסית ברקמות עמוקות. באורגניזמים חיים, רכוש תמונות מפסית בעומקי רקמה שונים לאורך זמן והערך אותן כפי שתואר בעבר, כדי להפיק סרט בתלת-ממד ברזולוציה גבוהה של האינטראקציה הדינמית בין המרכז הנבטי, תאי B ותאי דנדריטים פוליקולריים. ממדי פונקציית פיזור הנקודה (point spread function) האפקטיבית תואמים לרזולוציה המרחבית של המיקרוסקופ.

מדדנו פונקציה תלת-ממדית זו על ידי רכישת אות של יצירת הרמוניות שנייה של סיבי קולגן או אות פלואורסצנציה של חלקיקי פוליסטירן בננומטר 100 הפולטים ב-515 nanometers בבלוטות לימפה של עכבר. השתמשנו ב-T-P-L-S-M עם הארה מפסית רב-קרנית בהשוואה לטכניקות מבוססות של מיקרוסקופיית סריקה לייזר דו-פוטוני, כגון T-P-L-S-M עם גילוי שדה באמצעות מצלמות CCD ו-T-P-L-S-M עם גילוי נקודתי. ממדידות אלו עולה בבירור כי על פני השטח של הדגימה, הן הרזולוציה הלטרלית והן הרזולוציה האקסיאלית תואמות לערכים הצפויים על פי תיאוריית הדיפרקציה.

עם זאת, עם הגברת עומק הדימוי, ובשל כך עם הארכת המסלול האופטי של קרינות העירור והפליטה דרך מדיום בעל מקדמי שבירה משתנים מאוד, הרזולוציה המרחבית מידרדרת באופן ניכר ללא קשר למערך שנעשה בו שימוש. באמצעות M-B-S-I-T-P-L-S-M, ללא תלות בעומק הדימוי, השגנו רזולוציה לטראלית טובה בכ-20% ורזולוציה אקסיאלית טובה בכ-220%, בהשוואה לגישות T-P-L-S-M הסטנדרטיות.

הסלקציה הקלונאלית של תאי B במהלך התגובה החיסונית בתוך איברים לימפואידיים משניים בעכברים בוגרים היא השלב הראשון בדרכם להתמיין לתאי B של זיכרון או לתאי פלזמה. בתהליך זה, האינטראקציה הדינמית מאוד בין תאים דנדריטיים פוליקולריים לבין תאי B ברמה של מבני קומפלקסים חיסוניים בתוך מרכזי נבטה נחשבת כבעלת תפקיד מרכזי. רק באמצעות טכנולוגיית מיקרוסקופיה תוך-חיה (intra vital) ברזולוציה גבוהה ניתן לנתח תקשורת תאית זו ואת השלכותיה על התגובה החיסונית, כפי שניתן לראות כאן כסימון של anti CD 2135 FAB ATO five 90 על תאים דנדריטיים פוליקולריים.

טכנולוגיית M-B-S-I-T-P-L-S-M מאפשרת לראשונה ויזואליזציה וכמות של ממדיהם של צבירי משקעי קומפלקסים חיסוניים בעומק של עד 120 micron בתוך מרכזים נבטיים של קשרי לימפה פופליים בחי an vivo. תמונות אלו מציגות השוואה ישירה בין תמונות פלואורסצנציה בתלת-ממד של משקעי קומפלקסים חיסוניים במרכז נבטי, כפי שהושגו באמצעות PMT קונבנציונלי לעומת M-B-S-I-T-P-L-S-M. יתרה מכך, ניתן להגיע לרזולוציה גבוהה של האינטראקציות בין משקעי הקומפלקסים החיסוניים לבין תאי B במרכז הנבטי, וכעת ניתן לחקור אותן בשילוב עם גששים פונקציונליים intra vital לבדיקת פרוליפרציה, דיפרנציאציה או אפופטוזיס.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור שבטכניקה המבוססת על זיהוי באמצעות מצלמה, מהירות הרכישה גבוהה פי שמונה בקירוב, בעוד שעומק ההדמיה המקסימלי נמוך בכ-25% מאלו ההשגים במיקרוסקופ מולטי-פוטון סטנדרטי המבוסס על פוטומולטיפליקטור (photomultiplier). לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הגדרת המיקרוסקופ המרובה-ערוצים (multifold microscope) לעבודה עם שיטת ההארה הפסית, כולל כיוון נתיב האור של המיקרוסקופ, יישור סלטי הקרן, חישוב פרמטרי הסריקה והדרכים לחישוב התמונה הסופית ברזולוציה גבוהה, עבור ניסויי רקמה עמוקה בחיים (intravital).