הזרקת intracardiac מונחה ההדמיה אולטראסאונד לפתח מודל עכבר של שד גרורות סרטן מוח ואחריו האורכי MRI

המטרה הכללית של הליך זה היא להשתמש בהדמיית אולטרסאונד כדי להקים מודל עכברי של גרורות של סרטן השד במוח, שניתן יהיה לנטר לאחר מכן באמצעות MRI. הדבר משיג על ידי איסוף תאי סרטן שד בעלי טרופיזם למוח והזרקתם לחדר השמאלי. בעזרת הכוונה של אולטרסאונד, ניתן לנטר את התפתחות הגידול התוך-גולגולתית.

באמצעות MRI, ואישור של גרורות על ידי צביעת H&E. בסופו של דבר, הזרקה מדויקת בהנחיית דימות יכולה להגביר משמעותית את הצלחת הניטור, ההיווצרות וההתפתחות של גרורות לסרטן השד במוח. MRI אורךים מאפשר ניטור לא פולשני של ההיווצרות וההתפתחות של סרטן השד.

כל הפרוצדורות בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימושם (IACUC) של University of Texas Southwestern Medical Center. עבור פרוטוקול זה, הכינו תאי M-D-A-M-B 2 31 B-R-G-F-P שגודלו במצע DMEM המכיל 10% FBS, 1% glutamine ו-1% penicillin streptomycin. עקבו תמיד אחר מצב התאים והחליפו את המצע מדי יומיים עד שלושה ימים. כאשר הושגה 80% confluence, בצעו trypsinization ואספו את התאים.

ראשית, הסר לחלוטין את המצע הישן באמצעות פיפטת ואקום. לאחר מכן, הוסף 5 mL של PBS כדי לשטוף את התאים בעדינות עד שכל התאים מכוסים ב-PBS. לאחר מכן, הסר את תמיסת השטיפה.

בשלב הבא, הוסיפו 1.5 milliliters של trypsin לצלוחית. הטו את הצלוחית בעדינות כדי להבטיח שכל התאים מכוסים ב-trypsin. החזירו את הצלוחית לאינקובטור התאים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius.

המתינו דקה אחת ובחנו את התאים תחת מיקרוסקופ. אם הם עגולים וצפים, סימן שהם התנתקו. הוסיפו 3 mL של מצע גידול כדי להפסיק את העיכול והעבירו בעזרת פיפט את תערובת התאים לשפופרת צנטריפוגה.

סובב את התערובת בצנטריפוגה ב-1,160 G למשך חמש דקות. לאחר מכן, הסר את המצע בזהירות באמצעות פיפטה בוואקום. בשלב הבא, השהה בעדינות את התאים ב-5 milliliters של מצע ללא סרום באמצעות פיפטה עד שלא ניתן יהיה להבחין במשקע תאים, והתמיסה תיראה הומוגנית ב-50 microliters של תערובת התאים.

הוסף 50 µL של tripan blue לאחר ערבוב יסודי. העבר מנות של 10 µL למספר סליידים לספירת תאים. לאחר מכן, ספור את התאים בהתבסס על ערכי סופר התאים.

חשבו והשתמשו בממוצע של כל הספירות שהתקבלו. כעת הכינו תרחיף תאים מדויק יותר. סבבו אותם שוב בצנטריפוגה ותלהם מחדש בריכוז של 175,000 תאים ל-100 µl של מצע ללא סרום.

לאחר מכן, שמרו את התאים על קרח לצורך ההזרקה תוך-לבבית. עבור פרוטוקול זה, השתמשו בעכברי BC nude נקבות, בני שש עד שמונה שבועות. התחברו למערכת ההדמיה והפעילו את המתמר.

7 0 4 בתדר של 40 megahertz. התחילו מחקר חדש ומלאו את בקשות המידע בהתאם. לאחר מכן, הרדימו את העכבר והעבירו את חומר ההרדמה באמצעות קונוס לאף.

במהלך ההזרקה המודרכת, הגדירו את טמפרטורת שולחן הדימות ל-37 °C והדביקו את העכבר לשולחן במנח גב (supine). שמרו את ג'ל האולטרסאונד בטמפרטורה של 37 °C לפני הדימות ומרחו כמות קטנה על חזה העכבר. כעת, התקינו את המתמר במחזיק והורידו אותו לעומק הדימות הרצוי.

בשלב הבא, הזיזו את הבמה עד לזיהוי החדר השמאלי, כאשר האורטה העולה משמשת כנקודת ייחוס, ונעלו את הבמה בנקודה שבה התצפית היא הברורה ביותר. כעת, שאבו 100 µL מתערובת התאים המקוררת לתוך מזרק של 1 mL עם מחט בקוטר 22 gauge. קבעו את המזרק הטעון למעמד המזרקים.

לאחר מכן, העבירו את המזרק לכיוון החזה. ולפני ההחדרה לעכבר, הזיזו אותו בזהירות מצד לצד עד שקצה המחט נמצא בשדה הראייה של הדימיג. כווננו את גובה המחט ואת הזווית כדי להכווין את המטרה לחדר השמאלי, וכאשר היא נמצאת במיקום הנכון, החדירו במהירות את המחט דרך שכבות העור והשריר אל תוך החדר השמאלי.

בהנחיית דמות האולטרסאונד, סימן להחדרה מוצלחת לתוך החדר השמאלי הוא רפלקס של דם עורקי ורוד וטרי לתוך המזרק. לאחר מכן, הזרק את תערובת התאים באיטיות עד לסיום, שלוף את המחט, הרם את המתמר, ונקה את ג'ל האולטרסאונד בעזרת גזה לחה. לאחר מכן, שחרר את בעל החיים מהסרט והעבר אותו לכלוב נקי עם פד מחומם מראש.

עקוב אחר העכבר עד להחלמתו המלאה, ולאחר מכן בדוק את מצבו מדי יום למשך מספר ימים. באמצעות רזולוציה רגילה של 78 square micron, ניתן לזהות נגעים היפראינטנסיביים ב-MRI בקוטר של 310 microns. כיוון שהגרורות במחקר זה היו קטנות מאוד והנמק והבצקת היו מינימליים, הנגע ההיפראינטנסיבי בתמונות T two weighted ייצג נאמנה את הגידול.

מחקרי MRI אורךים המבוצעים על קבוצות גדולות מאפשרים הערכה לא פולשנית in vivo של גידול גידולים. ה-MRI ברזולוציה גבוהה הצליח לזהות מספר נגעים קטנים שלושה שבועות לאחר הזרקה תוך-לבבית; בשבוע הרביעי, כל הנגעים שנראו בסריקה הקודמת הפכו לגדולים יותר. נגעים חדשים נוספים הופיעו בדימויי T2.

צביעת H and e חשפה נגעים מטאסטטיים דיפוזיים או שצביעת h and e חשפה נגעים מטאסטטיים מסוג צברים. כלי דם מורחבים נראו לעיתים קרובות סביב הגידול, מה שמעיד על כך שהתרחש תהליך של non sprouting angiogenesis. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן ביצוע הזרקה באמצעות מחט בהנחיית הדמיית אולטרסאונד לתוך החדר השמאלי של לב עכבר.