הכנת Microtubules מקוטע לחקר תנועות מונעים על ידי מסתיים microtubule הפירוק
15 במרץ 2014
Microtubules מטבעם פולימרים לא יציבים, ומיתוגם בין הצמיחה וקיצור הוא אקראי וקשה לשליטה. כאן אנו מתארים פרוטוקולים באמצעות microtubules המפולח עם כובעי ייצוב photoablatable. Depolymerization של microtubules המפולח יכול להיות מופעל עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה, ובכך מסייע לניתוח של תנועות עם קצות microtubule פירוק.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לחקור את התנועות של מולקולות חלבון וחרוזים מצופים חלבון עם קצות של מיקרו-צינורות דה-פולימריזציה. זה מושג על ידי הרכבת תא זרימה רב פעמי עם החלקת כיסוי בגודל נקי. לאחר מכן מכינים זרעי מיקרו-צינורות המחוברים להחלקת הכיסוי ומשמשים לגרעין מיקרו-צינורות, אשר לאחר מכן מיוצבים באופן זמני עם מכסים הניתנים להרס צילום.
לאחר מכן חלבונים המסומנים ב-GFP או חרוזים מצופים חלבון מוכנסים לתא הזרימה ונקשרים למיקרו-צינורות מפולחים. לאחר מכן מופעלת דה-פולימריזציה של מיקרו אמבטיה על ידי הסרת הכובעים על ידי אבלציה של תמונות. התמונות מנותחות עם CH כדי לקבוע אם החלבונים המסומנים מציגים התנהגות מעקב אחר קצה, שהיא תנועה עם הקצוות של מיקרו-צינורות דה-פולימריזציה.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת הפעלת מיקרו-צינורות ברזולוציה זמנית ומיוחדת גבוהה. ההדגמה החזותית של שיטה זו היא קריטית. הפרוטוקול מתחיל בהכנה והרכבה של תא זרימה באמצעות כרסום קולי.
שנה שקופיות מיקרוסקופ רגילות כך שיהיו להן שני חריצים. הפוך את החריצים למרחק של 14 מילימטרים זה מזה. תן או קח מילימטר אחד, וזה אופטימלי לתאים המורכבים באמצעות החלקות כיסוי מרובעות של 22 מילימטר.
לאחר מכן הניחו צינור פוליאתילן באורך 100 מילימטר בכל חריץ בשקופית, והשאירו כחמישה מילימטרים תלויים בקצוות הפנימיים של החריצים. תקן את הצינורות בתוך החריצים בעזרת דבק ציאנואקרילט, והטביע את הצינורות לחלוטין בתוך החריצים. מלאו בזהירות את החריצים בדבק אפוקסי מבלי לשפוך אותם.
הניחו לו להתייבש למשך יום. למחרת. השתמש בסכין גילוח חד כדי לחתוך את הדבק המוצק, שלושה עד ארבעה מילימטרים מהקצה הדיסטלי של כל אתר התקשרות.
הסרת החלקים הקרובים למרכז השקופית. הצינורות צריכים להישאר בחריצים שלהם והחתכים צריכים ליצור משטחים שטוחים עם פתחי צינורות. לאחר מכן, מלאו מזרק במים ובדקו אם הצינורות פועלים כראוי.
אם הנוזל זורם בחופשיות, הניחו טיפת דבק אפוקסי בקוטר של כחמישה מילימטרים בקצוות החיצוניים של החריצים והניחו לו להתייבש כיממה. תאי הזרימה שהושלמו עמידים אפוא וניתן להשתמש בהם שוב ושוב במשך חודשים רבים. פרוטוקול זה של שלוש שעות מכין 12 פתקי כיסוי.
זה דורש מכסה אדים, מחזיק החלקה אחד לכיסוי קרמי, שלוש 15 מיליליטר, צנצנות מכתים וצנצנת זכוכית של 1 250 מיליליטר עם מכסה. צנצנות הצביעה חייבות להתאים לארבעה, מספר רגיל 1 22 מילימטר כיסוי מחליק בערימה. התחל עם ערימה של 12 פתקי כיסוי מנוקים ומיובשים מראש במחזיק הקרמיקה.
ממלאים את הצנצנת בתמיסת סילן דוחה אחת ומורידים לאט את המגלשות פנימה. סוגרים את הצנצנת ומדגרים אותה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. הצעד הקריטי ביותר להבטחת ציוויליזציה אחידה של החלקת כיסוי הוא למנוע עקבות מים במהלך הדגירה של החלקות הכיסוי בתמיסת סלין.
שלב זה חיוני לחיבור הדוק של זרעי מיקרו צינורות. בהמשך הפרוטוקול, כאשר הכיסוי מחליק מוכן, הסר את מחזיק הקרמיקה מהצנצנת. לאחר מכן העבירו את פתקי הכיסוי בנפרד באמצעות פינצטה מצופה טפלון ממחזיק הקרמיקה לצנצנות מכתים עמוסות מתנול.
כעת טען את שלושת הצנצנות למאגר המים של אמבטיה קולית עם הדום מתכת או זכוכית בתוכו. מפלס המים צריך להיות בשני שליש מגובה הצנצנות, סוניקציה של הצנצנות ב-70 וואט למשך 20 דקות. במהלך הסוניקציה, החלף את תמיסת המתנול כל חמש דקות.
בסיום הסוניקציה, שטפו, הכיסוי מחליק 10 פעמים במים נטולי יונים. אם הסילויזציה עבדה כראוי, החלקות הכיסוי ייראו יבשות כאשר מוציאים אותן מהמים, ללא קשר למראה, הסר היטב את שאריות המים. באמצעות העברת גז חנקן, הכיסוי המיובש מחליק למיכל אטום מיובש בחנקן.
אינטרליי קים מנגבת בין פתקי הכיסוי. ניתן לאחסן אותם כך במשך מספר שבועות בטמפרטורת החדר. פרוטוקול זה דורש שעה עד שעתיים, תא זרימה אחד וזרעים מיקרו צינוריים מיוצבים G-M-P-C-P-P מוכנים.
ראשית, הרכיבו את תא הזרימה. חבר שתי חתיכות של סרט דו צדדי לאורך האזור המרכזי ברוחב חמישה מילימטרים של השקופית המוכנה, ולחץ בחוזקה על החלקת הכיסוי על הסרט. בעזרת מזרק מיליליטר אחד, מלאו את החדר ב -100 מיקרוליטר של תמיסת B rrb 80 דרך צינור.
לאחר מכן, סחטו טיפה קטנה של שני חומרי איטום יצוקים מהירים צבעוניים על גבי צלחת פטרי קטנה מפלסטיק. מערבבים אותו במהירות וביסודיות בעזרת קיסם. זה יהפוך לירוק.
מרחו את חומר האיטום מיד לאורך כל קצוות החלקת הכיסוי. בדוק אם חומר האיטום חודר עמוק מדי מתחת להחלקת הכיסוי. אם צינור חסום, נתק את המזרק מהחשמל והרם את הצינור כדי להפעיל לחץ עדין כדי למנוע דליפת חומר איטום פנימה לאחר 10 דקות, ודא שזרימת התמיסה אינה מוגבלת.
לאחר מכן העבירו את החדר לשלב מיקרוסקופ מחומם בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס. חבר את אחד הצינורות למשאבה להסרת תמיסה. טבלו את הקצה החופשי של צינור הכניסה בבקבוקון של 0.5 מילימטר עם מאגר BRB 80 חם.
הגדר את המשאבה ל-100 מיקרוליטר לדקה ולפי הצורך, השתמש בה כדי לדחוף בעדינות בועות אוויר. ניתן לעשות זאת גם באופן ידני. כעת השתמש במשאבה כדי להעמיס 30 מיקרוליטר של נוגדנים אנטיגנים חמים.
כבה את המשאבה והמתן חמש דקות. כבה את המשאבה במהלך כל הדגירות. לאחר מכן, שטפו את התאים בכ -100 מיקרוליטר חם b rrb 80.
לאחר מכן הזמינו 50 מיקרוליטר של 1% אוניק F1 27 ב-BRB 80. המתן 10 דקות עד שהוא יחסום את המשטח ההידרופובי של החלקת הכיסוי המבודדת. כעת שטפו את התאים עם 100 מיקרוליטר של מאגר תנועתיות.
לאחר מכן, הפחיתו את מהירות המשאבה ל-15 מיקרוליטר לדקה וחדרו את התא ב-30 עד 40 מיקרוליטר של זרעי מיקרו-צינוריות מדוללים מ-1 ל-200 עד 1 עד 600 במאגר תנועתיות. דגרו את הזרעים למשך 15 דקות, ולאחר מכן שטפו את החדר עם 400 מיקרוליטר של מאגר תנועתיות במהירות של 100 מיקרוליטר לדקה כדי להסיר כל חומר לא קשור. לאחר מכן, הפחיתו את מהירות המשאבה ל-30 מיקרוליטר לדקה וחדרו את החדר בתמיסת טובולין ללא תווית חמה מראש.
ההיבטים הקריטיים ביותר של פרוטוקול זה הם הימנעות מבועות אוויר. להשתמש בתמיסות טובולין טריות שהוכנו ולעקוב אחר התזמון המדויק של הפרוטוקול, במיוחד במהלך מכסה המיקרו צינורית. עקוב אחר הצמיחה המיקרו-צינורית באמצעות אופטיקה DIC במהלך הדגירה של חמש עד שבע דקות.
המיקרו-צינורות גדלים בדרך כלל כ-10 מיקרון, מחליפים במהירות את התמיסה עם תערובת רומין טובולין לפני המלחמה ומאפשרים שמונה עד 10 דקות נוספות זמן דגירה. שטפו היטב את החדר עם 100 מיקרוליטר של מאגר תנועתיות במהירות של 20 מיקרוליטר לדקה כדי להסיר מערבולות ונוקלאוטידים, כמו גם שברי מיקרו צינורות מסיסים. לאחר מכן, חדרו את החדר בתמיסה מחוממת של חלבון עם תווית GFP או חרוזים מצופים חלבון והמשיכו בהדמיה של רכיב קינטיקו שמרים DAM אחד המסומן ב-GFP טוהר מתאי חיידקים ושימש כבקרה חיובית לבדיקות מעקב אחר קצה.
חלבונים כאלה עוקבים אחר הקצה הדה-פולימרי של מיקרו-צינורית ונעים בהתמדה לעבר הזרע המחובר להחלקת הכיסוי. חלבונים אלה מופיעים כקו אלכסוני בגרף מתאים, אותו ניתן לנתח כדי לקבוע את מספר מולקולות החלבון בקומפלקס מעקב הקצה. ניתוח זה מפורט בפרוטוקול הטקסט.
לעומת זאת, חלבונים שאינם מצליחים להטות את המסלול אינם מראים העשרה באות הקרינה בקצה המיקרו המפורק. ניתן לראות זאת עם חלבון NDC 80 GFP האנושי. הקישור בין חרוזים מצופים חלבון למיקרו-צינורות הוא בדרך כלל חזק למדי, כך שכאשר נוספו חרוזים לתא המיקרוסקופיה, הם נקשרו בקלות למיקרו-צינורות המחוברים לכיסוי המפולח.
כאשר מעקב החרוזים הוא תהליכי, ניתן לבצע תצפיות רבות. חרוזים שמחוברים למיקרו-צינורית אחת הראו תנועה דמוית קשת כאשר מיקרו-צינורות מסתובבים מעט סביב אתר הצמיחה שלהם. כאשר המכסה המייצב מואר, אם ניתן לראות רק קטע אדום אחד מרוחק מהזרע והחרוז, אז החרוז מחובר למיקרו צינורית אחת.
לעתים קרובות ניתן לראות את הכובע עוקב אחר תנועת החרוזים באותה מידה עד להלבנת הכובע תנועת החרוזים זמן קצר לאחר ההלבנה נראית עקבית עם כיוון המיקרו-צינוריות. ככל שהמיקרו צינורי מתקצר והחרוז נע לכיוון הזרע, משרעת התנודות דמויות הקשת פוחתת. אם החרוזים לא מצליחים ליצור חיבורים מתמשכים למיקרו-צינורות היציבים.
ניתן להשתמש בלכידת לייזר חרוזים עם מבני חלבון שונים של קינזין מכוון קצה פלוס SE E דרש טכניקה זו כדי לשגר את החרוזים על קירות המיקרו צינורות המפולחים בנוכחות TP. חרוזים אלה נעו במהירות לעבר קצוות הפלוס המיקרו-צינוריים המכוסים בגרף. תנועה זו גרמה לקו אלכסוני המכוון לכיוון הכובע לאחר שהכובע נהרס. החרוזים המצופים בחלבון ריגול קטום מנותקים מהמיקרו-צינורית כפי שמצביע החץ הירוק.
לעומת זאת, חרוזים עם חלבון B באורך מלא יכולים לקיים תנועה בכיוון ההפוך. זה נראה כתבנית זיגזג בגרף chm עקב תנועה בכיוונים מנוגדים לקצה הפלוס או המינוס של המיקרו-צינוריות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין תאי זרימה ולגדל מיקרו-צינורות מפולחים כדי לחקור תנועות המונעות על ידי פירוק מיקרו צינורות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את הדינמיקה של מולקולות חלבון וחרוזיים מצופים בחלבון המקיימים אינטראקציה עם מיקרוטובוליים בתהליך דפולימריזציה. באמצעות שימוש במיקרוטובוליים מקטעים בעלי מכסות מייצבות הניתנות להסרה פוטו-אבלטיבית, החוקרים יכולים לשלוט בתהליך הדפולימריזציה בדיוק גבוה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- ביופיזיקה
רקע
- מיקרוטובולים הם פולימרים לא יציבים העוברים צמיחה וקיצור סטוכסטיים.
- הבנת הדינמיקה של המיקרוטובולים חיונית להסקת מסקנות לגבי תהליכים תאיים.
- מכסיות הניתנות להסרה באמצעות פוטו-אבלציה (Photoablatable caps) מאפשרות דה-פולימריזציה מבוקרת של מיקרוטובולים.
- מעקב אחר תנועת חלבונים יכול לחשוף אינטראקציות עם קצות המיקרוטובולים.
מטרת המחקר
- לניתוח התנועות של חלבונים וחרוזי זכוכית בקצוות של מיקרוטובוליים בתהליך דפולימריזציה.
- לפיתוח שיטה להפעלת דפולימריזציה של מיקרוטובוליים ברזולוציה זמנית ומרחבית גבוהה.
- לחקירת התנהגות מעקב אחר הקצה (tip tracking) של חלבונים מסומנים.
שיטות שהשתמשו בהן
- הרכבת תא זרימה רב-פעמי עם זכוכית כיסוי נקייה.
- הכנת גרעיני מיקרוטובוליים המחוברים לזכוכית הכיסוי לצורך גרעין (nucleation).
- ייצוב זמני של מיקרוטובולים באמצעות מכסות הניתנות לפירוק פוטו-כימי.
- החדרה של חלבונים המסומנים ב-GFP או חרוזיים מצופים בחלבון אל תא הזרימה.
תוצאות עיקריות
- מעקב מוצלח אחר תנועות חלבונים עם קצות מיקרוטובוליים שעוברים דפולימריזציה.
- הדגמה של דפולימריזציה מבוקרת באמצעות פוטואבלציה.
- ניתוח של התנהגות מעקב לקצה של חלבונים מסומנים.
- תובנות לגבי הדינמיקה של אינטראקציות של מיקרוטובולים עם רכיבים תאיים.
מסקנות
- השיטה מאפשרת בקרה מדויקת על דינמיקת המיקרוטובולים.
- הממצאים משפרים את ההבנה של אינטראקציות של חלבונים עם מיקרוטובולים.
- ניתן ליישם גישה זו במחקרים נוספים בביולוגיה של התא.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
מחקר מבוקר של תנועת חלבונים ומטען בקצוות של מיקרוטובוליים המתפרקים נותן מענה לפער קריטי בהבנת ייצור כוח והובלה מולקולרית במהלך חלוקת התא. שיטה זו מאפשרת בחינה כמותית ברזולוציה גבוהה של אינטראקציות בין חלבונים למיקרוטובוליים, ובכך תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים ובתיקוף מטרות בשלבי הגילוי המוקדמים. הגישה מגבירה את הביטחון החזוי עבור צוותי מו"פ המעריכים מטרות של השלד התאי ומנגנוני הובלה הרלוונטיים לתיקי עבודות בתחומי האונקולוגיה והביולוגיה של התא.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה ישירה של תפקוד חלבונים בקצוות דינמיים של מיקרוטובולי תחת תנאים ביוכימיים מוגדרים.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי הבחנה בין התנהגויות של חלבונים העוקבים אחר קצה המיקרוטובול לבין חלבונים שאינם עוקבים אחריו.
- מקל על ניתוח כמותי של סטוכיומטריה של קומפלקסים חלבונים באמצעות מדידות עצימות פלואורסצנציה.
- משפר את הביטחון החזוי לבחירת מטרות במחקר של נתיבי הציטושלט והמיטוזה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספקת פלטפורמה הניתנת לשחזור להערכת ניידות של חלבונים ומטען בתגובה לפירוק מבוקר (depolymerization) של מיקרוטובוליים.
- מאפשרת סטנדרטיזציה של בדיקות פלואורסצנציה כמותיות באמצעות פרוטוקולים מותאמים להסרת רעשים ואופטימיזציה של יחס אות לרעש.
- תומכת ביכולת הרחבה (scalability) ובשימוש חוזר של הבדיקה באמצעות תאי זרימה עמידים וניתנים לשימוש חוזר והכנה של מיקרוטובוליים במקטעים.
- מספקת תוצאות אמינות לסריקת תרכובות או מבנים גנטיים (constructs) המכוונים לתהליכים הקשורים למיקרוטובוליים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה בדיקות ניידות במבחנה (in vitro) למנגנונים הרלוונטיים למחלה, כגון הפרדת כרומוזומים ושגיאות מיטוטיות.
- מספק רצף מהמנגנון המולקולרי ועד לתיקוף במודל פרה-קליני עבור מטרות של השלד התאי.
- מאפשר קבלת החלטות על קידום מבוסס התאמה לסיכון, באמצעות הבהרת תפקוד החלבון בהקשרים תאיים דינמיים.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל ממחקרים מכניסטיים מוקדמים, דרך פיתוח בדיקות ומחקר תרגומי עבור מטרות של השלד התאי.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי צימוד חלבון-מיקרוטובולי ומנגנוני יצירת כוח.
- סינון: מספק קריאות כמותיות וניתנות לשחזור של ניידות ומעקב אחר קצוות להערכת מבנים או תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת כימות מבוסס פלואורסצנציה של גודל קומפלקס חלבונים ופרמטרי ניידות.
- מחקר תרגומי: מגשר בין ממצאים מכניסטיים in vitro לתהליכים תאיים הרלוונטיים למחלה, כגון מיטוזה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמת בדיקה סטנדרטית וניתנת לשימוש חוזר עבור מבני חלבון מרובים ומסעות סינון.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות בשלד התא.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות של הבדיקה, את הסטנדרטיזציה ואת התפוקה באמצעות תאי תגובה רב-פעמיים ופרוטוקולים מותאמים.
- ערך אסטרטגי: תומך בקבלת החלטות מושכלת לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) וביעילות הון על ידי הבהרת המכניזם של המטרה בשלב מוקדם.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכונים של תוכניות העוסקות בשלד התה ובמסלולים של המיטוזה.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות במיקרוסקופיית פלואורסצנציה, סימון חלבונים וביוכימיה של מיקרוטובוליים.
- נדרשת גישה למערכות דימוי המסוגלות לבצע פוטואבלאציה ולתוכנה לניתוח כמותי.
- נדרשת הכנה קפדנית של זכוכית כיסוי והרכבת תא כדי להבטיח עקביות של הבדיקה.
- יש להתאים את הפרוטוקולים למבני חלבונים שונים ולציפוי חרוזיים בהתאם לצורך.
- אופטימיזציה של יחס אות לרעש ותיקון תאורה הם קריטיים לקבלת תוצאות כמותיות.
