מתודולוגיה לדור היעיל של חלבונים נגיפי חיסון מתויגים בפלורסנטיות

ניסוי זה מייצר נגיפי vaccinia רקומביננטיים מסומנים פלואורסצנטית באמצעות שיטה מודולרית ומהירה המבוססת על ברירה דומיננטית זמנית. ראשית, צור וקטור רקומביננטי המכיל תג פלואורסצנטי המוקף באזורי הומולוגיה מינימליים מסונתזים, וכן סמנים לברירה מטבולית ופלואורסצנטית. בצע טרנספקציה של וקטור רקומבינציה זה לתאים נגועים והגבר את הנגיפים הרקומביננטיים באמצעות ברירה מטבולית ופלואורסצנציה. לאחר מכן, הסר את הברירה המטבולית כדי לחתוך את קסטת הסמן ובודד את התאים המכילים נגיפים רקומביננטיים באמצעות ברירה לפי הסמן הפלואורסצנטי. תוצאות של פלאקים נגיפיים על שכבות תאים מונו-שכבתיות מאפשרות ויזואליזציה של חלקיקי נגיף בודדים המאפיינים את הגן המסומן פלואורסצנטית.

פיתחנו את השיטה הזו מכיוון שרצינו לייצר נגיפים רקומביננטיים עם מספר מוטציות גנטיות באמצעות שיטת סלקציה שניתן להשתמש בה באופן חוזר ואוניברסלי, ללא קשר לתג. בעוד שעקרון הסלקציה הדומיננטית זמנית תואר בעבר, רצינו ליישם אותו בקנה מידה רחב יותר ובאופן מודולרי כדי להעניק לנו גמישות רבה יותר בביצוע שינויים גנומיים. הדגמה ויזואלית של שיטה זו היא קריטית, שכן סריקה ובידוד של פלאקים של נגיפים רקומביננטיים עלולים להיות מורכבים. השכיחות שלהם עשויה להיות נמוכה, ולכן נדרשות שיטות ייחודיות להשגה יעילה של הנגיף.

סמנו את הגן הויראלי המבוקש בקצה N או C של החלבון. בהתאם לכך, זהו אזורי הומולוגיה צדדיים באורך 150 bp. לאחר מכן, תכננו רצף אוליגונוקלאוטיד המורכב מהזרועות השמאלית והימנית באורך 150 bp, המופרדות על ידי זוג אתרי הגבלה לבחירה. כמו כן, הקיפו אזור זה בזוג שני של אתרי הגבלה השונים מהזוג הראשון, כדי לאפשר שילוב בתוך וקטור ה-TDS לאחר הסינתזה. כעת, ודאו כי האוליגונוקלאוטיד עם אתרי ההגבלה תוכנן להיות בתוך המסגרת (in frame) ביחס לאתר ההחדרה הרצוי. עבור סינתזת האוליגונוקלאוטיד, ודאו שאתרי ההגבלה שנשולבו בין הזרועות השמאלית והימנית תואמים לאתרים המקיפים את מסגרת הקריאה הפתוחה של תג הפלואורסצנציה הנבחר. שלבו את אותם אתרי הגבלה משני צדי תג הפלואורסצנציה באמצעות PCR. שבטו את הפgment המסונתז אל תוך וקטור ה-TDS. כמו כן, שבטו את תג הפלואורסצנציה אל תוך וקטור הרקומינציה שהתקבל, תוך שימוש באתרי ההגבלה שבין אזורי ההומולוגיה של הזרוע השמאלית והימנית. הדביקו שכבה אחת (monolayer) של תאי BS-C-one עם נגיף vaccinia במצע ללא סרום.

שעה לאחר ההדבקה, יש להציל את התאים באמצעות מצע Dulbecco's modified eagle medium. בצע טרנספקציה עם תערובת של פלסמיד וקטור רקומביננטי וסוכני טרנספקציה ביחס של שלושה לאחד במצע נטול סרום. לאחר 24 שעות, יש לגרד ולהחלים את התאים ב-DMEM שאינו מכיל fetal bovine serum. העבר את התאים שלושה מחזורי הפשרה-הקפאה כדי לפצח את התאים ולשחרר את חלקיקי הווירוס. לאחר מכן, כדי להשיג הפרדה מספקת של פלאקים בודדים, הדבק שכבות תאים (monolayers) של תאי BS-C-one בהספקה מלאה (100% confluent) עם דילולים סדרתיים של תכשיר חלקיקי הווירוס. כסה בשכבת overlay של 10%FBS ו-DMEM בתוספת סוכני ברירה ל-GPT, והדגר למשך 24 שעות.

שאבו את שכבת הנוזל העליונה והשתמשו במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לחפש פלאקים המראים פלואורסצנציה אדומה דיפוזית, המתאימה להטמעה של M-cherry מהווקטור TDS בתוך הנגיף. בהתאם לגן המטרה ולתג הפלואורסצנטי שנבחר, ניתן יהיה להבחין גם בפלואורסצנציה מקומית של גן התג באותו פלאק אדום.

כעת, בחרו מספר פלאקים עבור כל וירוס רקומביננטי, גרדו אותם באמצעות קצה הפפיטה והעבירו את התאים למבחנה מסוג Eppendorf עם 100 µL של DMEM המכיל 5% FBS. בצעו שלושה סבבים של הקפאה והפשרה לתאים שנגרדו, כדי לשחרר את הווירוסים הרקומביננטיים.

הוסיפו את ה-DMEM המכיל וירוס שהופשר לאחר הקפאה לשכבה אחת של תאים (monolayer), בפלטה בעלת 12 בארין, כדי להגביר את הווירוסים הרקומיננטיים עם סוכני ברירה של GPT במצע הגידול. לאחר מכן, גרדו את ההגברות המוצלחות 24 שעות לאחר ההדבקה. עבור בדיקת פלאקים (plaque assay) של פלאקים שהוגברו בהצלחה ומראים פלואורסצנציה אדומה, זרעו פלטה בעלת שישה בארין עם שכבה אחת של תאי BS-C-one.

בצעו דילול סדרתי של הווירוסים הרקומביננטיים והדביקו את הבארים בדילולים עולים של וירוסים ב-DMEM ללא FBS. שעה לאחר ההדבקה, הסירו את המצע הנוזלי וכסו כל באר בשכבת agarose בריכוז 0.5% בתוך complete minimal essential medium. שלושה ימים לאחר ההדבקה, בחרו את הפלאקים המראים פלואורסצנציה שהיא הן אדומה והן בצבע של תג הפלואורסצנציה שנבחר.

בצע הגברה נוספת ללא ברירה באמצעות GPT. בחר פלאקים שאיבדו את הפלואורסצנציה האדומה הדיפוזית, אך שמרה על הפלואורסצנציה הממוקמת התואמת לתג הנבחר. המשך בטיהור פלאקים ללא ברירה כדי להשיג מאגר טהור של נגיפים רקומביננטיים שאיבדו את M-cherry ואת גני הברירה של GPT, אך שמרו על הפלואורסצנציה הממוקמת התואמת לתג שנבחר.

הערך את טוהר המלאים באמצעות בדיקת פלאקים (plaque assay), במטרה להשיג פלאקים בעלי פנוטיפ דומה. הגבר את מלאי הווירוסים לבדיקה בשכבה אחת (monolayer) של תאי BS-C-one. 24 שעות לאחר ההדבקה, גרד את התאים המודבקים לתוך 250 µL של DMEM. סבב את התאים המודבקים בצנטריפוגה, הסר את העלייה (supernatant) והשהה מחדש את משקע התאים ב-500 µL של 0.1% SDS בבופר TE. בצע ערבוב ב-Vortex כדי ל lysed את התאים. לאחר מכן, הוסף 500 µL של phenol, chloroform, isoamyl alcohol, והפוך את המבחנה לערבוב. סבב בצנטריפוגה. אסוף את השכבה העליונה וחזור על תהליך המיצוי.

לאחר מכן, כדי להשקיע את ה-DNA מהשכבה המימית, הוסיפו מיליליטר אחד של אתנול 100% מקורר ו-50 µL של נתרן אצטט. ערבבו על ידי היפוך והניחו את הדגימה בטמפרטורה של 20- °C למשך הלילה. לאחר השקת ה-DNA באמצעות סנטריפוגה, הסירו את כל הנוזל, ייבשו את משקע ה-DNA באוויר והמיסו אותו מחדש ב-50 µL של תמיסת TE. השתמשו בתבנית ה-DNA הגנומי זו לצורך סריקת PCR להשבחת היתוך ויראלי. ייצרו נגיפים רקומביננטיים עם תגים מרובים כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב.

נגיפי ואקסיניה רקומביננטיים אלו מביעים חלבונים המסומנים במסמני פלואורסצנציה המכוונים לחלבונים מבניים של הנגיף, A3 ו-F13, המהווים חלק מהליבה הפנימית של הנגיף ומהמעטפת החיצונית, בהתאמה. גנים המקודדים לחלבונים הממוקמים בויריון נבחרו כדי להמחיש את חלקיקי הנגיף. A3 הוא חלבון ליבה של ויריון הוואקסיניה, ו-F13 הוא חלבון מעטפת נגיפי.

מוצג גם נגיף בעל תיוג כפול, הכולל הן את A3 והן את F13 המסומנים פלואורסצנטית. ניתן לבצע מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בזמן אמת עם נגיף מסומן באופן כפול. במקרה זה, מדובר בחלבון הליבה הפנימי של נגיף הוקסיניה (vaccinia virus). A3 מסומן באדום וחלבון המעטפת החיצוני F13 מסומן בירוק.

חלקיקי נגיף לא עטופים ממפעל הנגיף מוצגים בצבע אדום, וויריונים עטופים מיוצגים על ידי קולוקליזציה של הערוצים האדום והירוק. ניתוח כמותי שימש לקביעת יעילויות הרקומינציה בין וקטורים רקומביננטיים לבין הגנום של נגיף הווקסיניה. ניתן לזהות את יעילות הרקומינציה ההומולוגית של וקטורים עם הגנום של נגיף הווקסיניה באמצעות אזורי הומולוגיה קצרים של עד 70 base pair.

שיטה זו שימשה ליצירת וירוסים עם מספר תגי פלואורסצנציה ו/או מספר מחיקות גנים. אלו שימשו במחקר של מחזור החיים הזיהומי של הווירוס, תפקידם של חלבונים ויראליים בשיבוש מערכות ההגנה של המארח, וכן באינטראקציות עם תהליכי איתות של המארח. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של אופן הפקת וירוסי vaccinia רקומביננטיים באמצעות שיטה שהיא מודולרית בתגים המשמשים אותה, מדויקת בבידוד הרקומביננטים הרצויים וניתנת ליישום במגוון הקשרי מחקר.