מתודולוגיה לדור היעיל של חלבונים נגיפי חיסון מתויגים בפלורסנטיות

ניסוי זה מייצר נגיפי EO רקומביננטיים בעלי תווית פלואורסצנטית באמצעות שיטה מודולרית ומהירה המבוססת על ברירה דומיננטית חולפת. ראשית, צור וקטור רקומביננטי המכיל תג פלואורסצנטי המוקף באזורים מינימליים מסונתזים של הומולוגיה, כמו גם סמנים לברירה מטבולית ופלואורסצנטית. העבירו וקטור רקומבינציה זה לתאים נגועים והגבירו עבור נגיפים רקומביננטיים באמצעות ברירה מטבולית ופלואורסצנטית.

לאחר מכן, הסר את הברירה המטבולית כדי לכרות את קלטת הסמן ולבודד את התאים המכילים נגיפים רקומביננטיים על ידי סמן פלואורסצנטי. בחירה. תוצאות של פלאק ויראלי על חד-שכבות תאים מאפשרות הדמיה של חלקיקי וירוס בודדים האופייניים לגן המתויג פלואורסצנטי. פיתחנו שיטה זו מכיוון שרצינו ליצור וירוסים רקומביננטיים עם שינויים גנטיים מרובים באמצעות שיטת ברירה שניתן להשתמש בה שוב ושוב ובאופן אוניברסלי ללא קשר לתג.

בעוד שעקרון הברירה הדומיננטית החולפת תואר בעבר, רצינו ליישם אותו בקנה מידה גדול יותר ובאופן מודולרי כדי לתת לנו גמישות רבה יותר בביצוע שינויים גנומיים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שבדיקת רובד ויראלי רקומביננטי ובידוד יכולים להיות מסובכים. תדירותם יכולה להיות נמוכה, ולכן נדרשות כמה שיטות ייחודיות להתאוששות יעילה של הנגיף.

אז תויג כגן ויראלי מעניין בקצה N או C של החלבון. בהתאם לכך, זהה 150 אזורי אגף ארוכים של זוגות בסיסים של הומולוגיה. לאחר מכן תכנן רצף אוליגונוקלאוטידים הכולל את 150 זוגות הבסיסים זרוע שמאל וימין, מופרדים על ידי זוג אתרי הגבלה לבחירה.

כמו כן, אגף את האזור הזה על ידי זוג שני של אתרי הגבלה השונים מהזוג הראשון כדי לאפשר שילוב בווקטור TDS. לאחר הסינתזה, ודא כעת שהאוליגונוקלאוטיד עם אתרי ההגבלה מתוכנן להיות במסגרת עם אתר ההחדרה הרצוי. עבור סינתזת האוליגונוקלאוטיד, ודא את אתרי ההגבלה המשולבים בין הזרוע השמאלית והימנית.

התאימו לאלה שמאגפים את מסגרת הקריאה הפתוחה של תג הקרינה הנבחר. שלב את אותם אתרי הגבלה משני צידי תג הקרינה על ידי PCR. שכפל את השבר המסונתז לווקטור TDS.

כמו כן, שכפל את תג הקרינה לווקטור הרקומבינציה שנוצר באמצעות אתרי ההגבלה בין הזרוע השמאלית והימנית. אזורי הומולוגיה. להדביק שכבה אחת של תאי BSC one עם וירוס חיסון ומדיה ללא סרום.

שעה לאחר ההדבקה. הצל את התאים עם טרנספקט מדיום נשר שונה של ECCOs עם תערובת של רקומבינציה, פלסמיד וקטורי וריאגנטים טרנספקציה ביחס של שלושה לאחד במדיה חופשית בסרום. לאחר 24 שעות, יש לגרד ולשחזר תאים ב-DMEM שאינם מכילים סרום בקר עוברי.

הכניסו את התאים לשלושה מחזורי הפשרה חופשיים כדי לשבור תאים פתוחים ולשחרר את חלקיקי הנגיף ליד כדי להשיג הפרדה נאותה של פלאק בודד. להדביק 100% חד-שכבות של תאים קונפלואנטים של תאי BSC אחד בדילולים סדרתיים של הכנת חלקיקי הנגיף. כיסוי עם נוזל 10% FBS ו-DMEM בתוספת בחירת GPT, ריאגנטים ודגירה למשך 24 שעות.

שאפו את שכבת הנוזל והשתמשו במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לחפש פלאק. מציג פלואורסצנטיות אדומה מפוזרת המתאימה לשילוב של דובדבן M מווקטור TDS לתוך הנגיף. בהתאם לגן המטרה ולתג הקרינה שנבחר, ניתן להבחין בפלואורסצנציה מקומית של גן התגית גם באותו רובד אדום.

כעת כדי לבחור מספר פלאק עבור כל וירוס רקומביננטי, מגרדים עם קצה הפיפטה ועם 100 מיקרוליטר של 5% FBS המכילים DMEM העבירו את התאים לצינור איינור. בצע שלושה סבבים של הפשרת הקפאה של התאים המגורדים. לשחרור הנגיפים הרקומביננטיים.

הוסף את ה-DMEM המכיל וירוס מופשר בהקפאה לשכבה אחת של תאים. בצלחת 12 בארות להגברת הנגיפים הרקומביננטיים עם ריאגנטים לבחירת GPT במצעי הגידול. לאחר מכן מגרדים את ההגברות המוצלחות 24 שעות לאחר ההדבקה לבדיקת פלאק של פלאקים מוגברים בהצלחה, המציגה פלואורסצנטיות אדומה C שתיים שש, משוחק היטב עם חד-שכבה של תאי BSC אחד.

בצע דילול סדרתי של הנגיפים הרקומביננטיים והדביק את הבארות בדילול הולך וגובר של וירוסים ב- FBS חינם DME M1 שעה לאחר ההדבקה. הסר את המדיה הנוזלית וכסה כל באר עם 0.5% אגרוס במדיום חיוני מינימלי מלא שלושה ימים לאחר ההדבקה. בחר את הלוחות המציגים את הקרינה שהיא גם אדום וגם את הצבע של תג הקרינה שנבחר.

הגבירו אותם שוב ללא בחירת GPT. בחר לוחות שאיבדו את הקרינה האדומה המפוזרת שלהם, אך שומרים על הקרינה המקומית המתאימה לתג הבחירה. המשך בטיהור הפלאק ללא ברירה כדי להשיג מלאי טהור של נגיפים רקומביננטיים שאיבדו את גני הברירה של דובדבן M ו-GPT, אך שומרים על הקרינה המקומית המתאימה לתג הנבחר.

העריכו את טוהר המניות באמצעות בדיקת פלאק המכוונת לכל הפלאקים של פנוטיפ פלאק דומה. להגביר את מלאי הבדיקה הנגיפי בשכבה אחת של תאי BSC one. לאחר 24 שעות לאחר ההדבקה, מגרדים את התאים הנגועים ל-250 מיקרוליטר של צנטריפוגת DMEM התאים הנגועים.

הסר את הסופרנט והשהה מחדש את כדור התא ב-500 מיקרוליטר של 0.1% SDS במערבולת חיץ TE כדי לזלזל בתאים. לאחר מכן מוסיפים 500 מיקרוליטר פנול, כלורופורם, אלכוהול איזואמיל, והופכים לערבוב צנטריפוגה. קצרו את השלב העליון וחזרו על המיצוי.

לאחר מכן כדי לזרז את ה- DNA מהשכבה המימית, הוסף מיליליטר אחד של אתנול צונן, 100% ו -50 מיקרוליטר נתרן אצטט. מערבבים על ידי היפוך ומניחים את הדגימה על 20 מעלות צלזיוס שליליות למשך הלילה. לאחר כדור ה-DNA על ידי צנטריפוגה, הסר את כל הנוזל וייבש באוויר את כדור ה-DNA והחייאה.

השעו אותו ב -50 מיקרוליטר של מאגר TE. השתמש בתבנית DNA גנומית זו למסך PCR להחדרה ויראלית. צור וירוסים רקומביננטיים עם תגים מרובים כמפורט בפרוטוקול הטקסט.

נגיפי החיסון הרקומביננטיים הללו מבטאים חלבונים המתויגים בסמנים פלואורסצנטיים המכוונים לחלבונים מבניים נגיפיים, A 3 ו-F 13, שהם חלק מהליבה הפנימית של הנגיף והמעטפת החיצונית בהתאמה. גנים המתאימים לחלבונים מקומיים של ויריון נבחרו כדי לדמיין חלקיקי נגיף. שלוש הוא חלבון ליבה של ויריון החיסון, ו-F 13 הוא חלבון מעטפת ויראלי.

נגיף עם תיוג כפול עם תווית פלואורסצנטית A 3 ו-F 13 מוצג גם הוא במיקרוסקופיה פלואורסצנטית בזמן אמת שניתן לבצע עם וירוס בעל תווית כפולה. במקרה זה, חלבון הליבה הפנימי של נגיף החיסון. שלוש מסומן באדום וחלבון המעטפת החיצונית F 13 מסומן בירוק.

חלקיקי וירוס לא עטופים ממפעל הנגיפים מוצגים באדום וויריון עטוף מיוצגים על ידי לוקליזציה של תעלות אדומות וירוקות. ניתוח כמותי שימש לקביעת יעילות רקומבינציה בין וקטורים רקומביננטיים לגנום נגיף החיסון. ניתן לזהות את היעילות של רקומבינציה הומולוגית של וקטורים עם גנום נגיף החיסון עם עד 70 אזורי זוגות בסיסים של הומולוגיה.

שיטה זו שימשה ליצירת וירוסים עם תגים פלואורסצנטיים מרובים או מחיקות גנים מרובות. אלה שימשו בחקר מחזור החיים הזיהומי של הנגיף, תפקידם של חלבונים נגיפיים בערעור מערכות ההגנה של המארח, כמו גם אינטראקציות עם תהליכי איתות מארח. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור וירוסי חיסון רקומביננטיים בשיטה שהיא מודולרית בתגים המשמשים, קפדנית בפתרון רקומביננטים רצויים וישימה במגוון הקשרי מחקר.