סינתזה והקרנה של גורמי שעתוק הופעל כימי עם כתבים המבוסס על ה-GFP מהיר

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא ליצור, לבחון ולתקף גורמי תעתוק מלאכותיים (ATFs) הניתנים להשראה ומקודדים גנטית, בעל ספציפיות רצויה. דבר זה מושג תחילה על ידי יצירת ה-ATF באמצעות טרנספורמציה פשוטה של שמרים, שבה הכללה של תוצר PCR של דומיין קשירת DNA גורמת להיתוך (fusion) בתוך המסגרת (in-frame) עם רצפטור एस्ट्रוגן אנושי ו-VP 16. השלב השני של הפרוצדורה הוא יצירת פלסמיד דשנאי (reporter plasmid) של GFP עבור ה-ATF, על ידי החלפת אתרי הקשירה בפלסמיד PMN 8 ברצפי מטרה של ה-TF.

השלב השלישי של הפרוצדורה הוא לבחון את יכולתו של ה-ATF להפעיל את הדיווח של ה-GFP, וכן להעריך את השפעתו על פיזיולוגיית השמרים על ידי מדידת קצב הגדילה. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא להשתמש ב-TF המתוקף כדי לבטא באופן מותנה מטרה גנומית טבעית. בסופו של דבר, ניתן להפוך כל גן מטרה רלוונטי לפעיל באופן מותנה.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון השראה של ביטוי גנים באמצעות גלקטוז, הוא שניתן להשיג השראה סלקטיבית תחת תנאים תזונתיים ופיזיולוגיים מגוונים ללא השפעות פליאוטרופיות. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בביולוגיה של שמרים באמצעות הכנסה מהירה והפיכה של תוצרי גנים רצויים, ובכך לאפשר מחקר הן של תפקוד מוגבר (gain of function) והן של אובדן תפקוד (loss of function). כדי להתחיל, בצעו הגברה ב-PCR של מתחם קישור ה-DNA או ה-DVD הרלוונטי באמצעות פולימראז בעל נאמנות גבוהה (high fidelity polymerase).

בצע טרנספורמציה של יותר מ-1 µg של תוצרי ה-PCR המטוהרים לתוך שמרים באמצעות שיטת הליתיום אצטט. לאחר הטרנספורמציה, סובב את התאים במהירות מרבית למשך 15 שניות במיקרו-צנטריפוגה, הסר את תערובת הטרנספורמציה והשהה את התאים מחדש בערך 200 µL של מים סטריליים לפני הזריעה על מצע תמצית שמרים, פפטו-דקסטרוז או מצע YPD. למחרת, בצע זריעה של העתקים (replica plating) מ-YPD אל חמישה צלחות המכילות חומצה פלואורו-ארוטית.

לאחר צמיחה של יומיים עד ארבעה ימים, בצעו ריסוּק (streak) של לפחות חמישה עד 10 מושבות על מצע YPD. לאחר מכן, בצעו PCR של מושבות (colony PCR) באמצעות הפריימרים המופיעים בפרוטוקול הכתוב ובצעו ריצוף כדי לאמת את ההכללה. דללו את האוליגוניוקלאוטידים של אזור הקישור הרצוי לריכוזים אקו-מולריים.

בצע פוספורילציה לאזור הקישור באמצעות T4 polynucleotide kinase, ולאחר מכן השתמש במכשיר thermocycler בהתאם לתנאי התגובה המפורטים בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, גשי כ-1 עד 2 µg של PMN8 באמצעות NotI ו-XbaI למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 °C.

טהרו את פס שלד ה-DNA (backbone) ודללו את השלד המטוה לריכוז של 10 nanograms per microliter. לאחר מכן, דללו את אתר הקישור המפוספורר דו-הגדילי לריכוז מולרי הגבוה פי חמישה מהריכוז של השלד למיקרוליטר. בעזרת T four DNA Ligase, חברו את אתרי הקישור לשלד שעבר עיכול בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.

בצע את הטרנספורמציה על ידי הוספת מחצית מתגובת הליגציה ל-50 µL של תאי E. coli כימיים קומפטנטים סטנדרטיים מסוג EIA, ופעל לפי הפרוטוקול המפורט בטקסט. לאחר השבת התאים, הוסף 100 עד 200 µL של תאים לכל צלחת Luria Bertani או LB עם ampicillin, והדגר למשך לילה. למחרת, גדל את תאי ה-E. coli במוציר LB עם ampicillin והפק את ה-plasmid DNA כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.

לאחר מכן, בצעו אימות רצף של פלסמיד הדורג (reporter plasmid) החדש מהמושבות שנוצרו מהליגציה. לבסוף, העבירו את פלסמיד הדורג החדש למאזן של זן E המכיל את TF A באמצעות טרנספורמציה של ליתיום אצטט. כדי להתחיל, גדלו במהלך הלילה זן המכיל את TF והדורג בחמישה מיליליטר של מצע סינתטי מלא (synthetic complete medium) ללא אורציל.

השג 9 בקבוקורי ניעור בנפח 250 milliliters, והוסף לכל אחד מהם 25 milliliters של SC minus URA. לאחר מכן, הכן שבעה מהבקבוקים עם דילולים שונים של beta estradiol כפי שפורט בפרוטוקול הטקסט, באמצעות דילול סדרתי עשירפיע 10 של תמיסת stock של beta estradiol בריכוז 25 millimolar; הוסף 125 microliters של תרביות לילה לשבעה בקבוקים אלו. לשני הבקבוקים שנותרו, תכלול זן המייצר GFP באופן קונסטיטוטיבי וזן חסר GFP. אלו נחוצים לצורך כיול של ה-flow cytometer.

נער את הבקבוק במהירות של 200 RPM ובטמפרטורה של 30 °C למשך 12 עד 18 שעות. לאחר מכן, העבר 500 µL מכל תרבית והסנטריפוג אותם בנבובות אפנדורף נפרדות בנפח של 1.7 mL. לאחר שאיבת הנוזל העליון, שטוף את התאים שהשקיעו פעם אחת עם בופר לציטומטריית זרימה, ולאחר מכן השהה את התאים ב-1 mL מאותו בופר.

בשלב הבא, העבירו מיליליטר אחד של בופר לציטומטריה זרימה לתשע מבחנות פלקון. הוסיפו את התאים שנשעו מחדש לבופר במבחנות הפלקון לנפח סופי השווה לשני מיליליטרים. לבסוף, בצעו ציטומטריה זרימה.

השתמשו בפיזור קדימה (forward scatter) ובפיזור צידי (side scatter) כדי לזהות תאי שמרים. הגדירו את קצב הזרימה לכ-3000 תאים לשנייה. מדדו את ה-GFP דרך ערוץ 50 והמשיכו כפי שמוסבר בפרוטוקול הטקסט: ממאגרים קפואים, בצעו מריחה של זן המכיל A TF ושל זן חסר A TF על מצע YPD. לאחר יומיים של גדילה, חסנו נבגים לשפורי תרבית נפרדים המכילים 5 mL של YPD נוזלי, וגדלו כל זן למשך לילה בטמפרטורה של 30 °C.

בצעו מהלולי דילוס (דילולים סדרתיים) פי 10 של תמיסת מלאי beta estradiol בריכוז 0.25 millimolar עד לדילול של פי 10,000 ב-100% ethanol. הוסיפו 40 microliters מכל תרבית לילה ל-10 milliliters של YPD נוזלי. עבור כל זן, הוסיפו 96 microliters של התאים המדוללים ל-18 בארות של פלטת 96 בארות.

לאחר מכן, הוסיפו ארבעה µL של beta estradiol לתאים. נקודה חיונית היא לוודא שבכל באר תהיה אותה כמות כוללת של ethanol. בצעו תכניס לשלוש מהבארים עבור כל זן המכילות ethanol בלבד.

מכסים את פלטת 96 הבארים בממברנה חדירה לגזים כביקורות. עוקבים אחר הגדילה באמצעות מדידת צפיפות אופטית באורך גל של 600 ננומטרים באמצעות קורא פלטות. מכמתים את קצבי הגדילה באמצעות מספר שיטות, כגון מציאת השיפוע המקסימלי.

לאחר הכנת הפלסמיד לפי ההנחיות בפרוטוקול הטקסט PCR, הגבירו את קסטת הפרומוטור can MX. טרנספורמציה של תוצרי ה-PCR לתוך זן המבטא A TF באמצעות שיטת הליתיום אצטט, זרעו את התאים שעברו טרנספורמציה על YPD ובצעו זריעת רפליקה על YPD בתוספת האנטיביוטיקה G four 18 למחרת. לבסוף, אשר את ההחדרה הנכונה של הפרומוטור באמצעות פריימר קדמי ופריימר אחורי פנימי לגן שפרומוטורו הוחלף.

תוצר ה-PCR הסופי הוא בערך 1.2 KB; מוצגת כאן השראת GFP על ידי שלושה זוגות שונים של מקדם ו-TF: Z4EV, Z3EV או GEV לאורך זמן בתגובה ל-1 µM beta estradiol. שימו לב לעלייה בייצור GFP בתגובה ל-ATFs המכילים דומיינים לקשירת DNA שאינם של שמרים. הדבר עשוי לנבוע מכך שגורמים אלו משיגים ספציפיות לגן בודד בגנום השמרים.

השראה של GEV לבדה מובילה להפעלה או لديה של מאות גנים, בעוד ש-Z three EV ו-Z four EV מפעילים רק את הביטוי של גן מטרה הממוקם במורד של פרומוטר סינתטי המכיל אתרי קישור מתאימים. כאן מוצגת השראה של GFP על ידי Z three EV בתגובה ל-0 nM beta estradiol, ול-1 µM beta estradiol לאחר 18 שעות של השראה. פלואורסנציה נמדדה גם מתאים החסרים GFP כדי להדגים את הרגולציה ההדוקה של מערכת Z three EV. היכולת של Z three EV להשריות GFP במגוון ריכוזי beta estradiol מוצגת כאן.

הפלואורסצנציה הממוצעת של ההתפלגויות מגלה כי הקשר בין ריכוז המשרה לבין תפוקת הביטוי הוא מדורג, עם מקדם היל (hill coefficient) של כ-1, המעיד על קישור בלתי תלוי של Z three EV. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון מערכים של ביטוי גנים (gene expression microarrays), כדי לענות על שאלות נוספות, כגון כיצד שינוי בביטוי של גן בודד משפיע על דפוסי ביטוי גנים רחבים בגנום. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להנדס, לבחון ולתקף את היעילות של פקטורי שעתוק מלאכותיים. פקטורי שעתוק מלאכותיים אלו שולטים באופן מותנה בביטוי של גנים הממוקמים במורד רצפי מטרה מתאימים של DNA.