ניתוח של תרגום ייזום בתנאי לחץ ידי Polysome פרופיל

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד את ההשפעות של מצבי לחץ על תרגום, התחלת תאי יונקים ורקמות על ידי פרופיל פוליזום. זה מושג על ידי טיפול תחילה בתאי סרטן יונקים בתרופה אנטי סרטנית ולאחר מכן הכנת תמציות תאים. השלב השני הוא הכנת סוכרוז, שיפועים.

לאחר מכן, תמציות התאים נטענות על הסוכרוז, השיפועים והאולטרה צנטריפוגה כדי להפריד בין שברים ריבוזומליים. בסופו של דבר, ניתוח כתמים מערביים באמצעות נוגדנים ספציפיים מבוצע כדי להעריך את הקשר של חלבונים שנבדקו עם פוליזום. היתרון העיקרי של טכניקה זו של שיטה קיימת כמו תיוג מטבולי, הוא שהיא מאפשרת לנו להעריך את ההשפעה של תנאי לחץ על שלב ההתחלה של התרגום.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הטיפול בלחץ, כגון האם וכיצד תרופות אנטי-סרטניות משפיעות על התחלת התרגום. ההשלכה של טכניקה זו משתרעת על טיפול בסרטן מכיוון שהיא עוזרת לחשוף מסלולים רגולטוריים חדשים של התחלת תרגום. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ויסות התחלת התרגום בתרביות תאים, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כגון רקמות מבודדות, כולל מוח וגידולים.

כדי להכין תחילה את מערכת פיצול שיפוע הצפיפות האוטומטית, שטפו את מערכת הצינורות של המכשיר עם 0.1% SDS למשך חמש דקות. לאחר מכן שטפו את מערכת הצינורות עם אתנול 70% למשך חמש דקות, ולאחר מכן תמיסת RNA Zap למשך חמש דקות. ולבסוף, עם DEPC, מים, יבש את מערכת הצינורות על ידי שאיבת אוויר למערכת.

לאחר מכן, הכן פתרונות סוכרוז של 15% ו-55% מייצרים את שיפוע הסוכרוז הליניארי של 15 עד 55% באמצעות מודל ISCO אחד של שיפוע 60 לשעבר. בהתאם להוראות היצרן, חשוב לשלוט בקפידה במהירות המשאבה הפריסטלטית על מנת למנוע היווצרות בועות או מערבולות בשיפועים בזמן שתוכנית יצרנית השיפוע פועלת לקרר את הצנטריפוגה האולטרה-צנזיסלית לארבע מעלות צלזיוס. שמור על השיפועים בארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש בניסוי זה משתמש בתאי סרטן צוואר הרחם במעבר נמוך שצופו בעבר כדי להגיע למפגש של 80%.

ביום הניסוי. חשוב לבצע מיצוי מתאים טריים וכדי להימנע מזיהום RNA במהלך הליך זה, 90 דקות לפני הוספת התרופה האנטי סרטנית, החלף את המדיום של התאים במדיום טרי ושלם. כדי לעורר תרגום, החזירו את התאים לחממה.

הוסף את התרופה האנטי סרטנית ישירות לתרבית התאים כתוספת בקרה. DMSO דגירה במשך ארבע שעות ב-37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני לאחר ארבע שעות, הנח צלחות על קרח ושטוף תאים שלוש פעמים עם תאי קציר PBS קרים במיליליטר אחד של מאגר ליזה לקבלת התוצאות הטובות ביותר. השתמש בכ-12 מיליון תאים עבור כל מצב ניסוי.

מעבירים תאים מצלחות מגורדות לצינור עינור ומערבבים היטב על ידי העברתם 15 פעמים דרך מזרק. תנו לליזטים של התא לנוח על קרח למשך 15 דקות. לאחר מכן, הניחו כמה טיפות של ליזאט תאים על שקופית והעריכו את הליזה התאית על ידי מיקרוסקופ ניגודיות פאזה באמצעות מטרה של פי 10.

לאחר אימות ליזיס התאים, הבהירו את הליזאט של התא על ידי צנטריפוגה ב-11,000 Gs למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. העבירו את הליזאט המסיס המכיל את הפולי ריבוזומים לצינור חדש ושמרו אותו על קרח לפני העמסת התמציות הציטופלזמיות על שיפועי סוכרוז. מדוד את ריכוז ה-RNA הקיים באמצעות ספקטרופוטומטר בזהירות וטען לאט כ-20 OD שתי 60 יחידות של התמצית על שיפוע הסוכרוז של 15 עד 55%.

ודא שיש שניים עד שלושה מילימטרים של מקום פנוי על פני הצינור כדי למנוע הצפת הצינור במהלך הצנטריפוגה. טען את הצינורות על הרוטור. הנח את הרוטור על הצנטריפוגה האולטרה-צנטריפוגה וצנטריפוגה את השיפועים ב-230,000 Gs בארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים ו-30 דקות.

בסיום הצנטריפוגה, הסר את הצינורות והניח אותם על קרח בזהירות מבלי להפריע לשיפועים. כדי להתחיל בפיצול התמציות הציטופלזמיות, הנח את שיפועי הסוכרוז על מערכת פיצול צפיפות אוטומטית והמשך בפיצול אוטומטי ואיסוף שברים כמתואר על ידי היצרן. אסוף כל שבר של 0.5 מיליליטר לצינורות איינור בודדים עם ניטור רציף של הספיגה ב-250 ננומטר במקביל לפעולת הפיצול של השיפוע, הפרופיל הפולי-ריבוזומלי יערוך על נייר התרשים בסוף כל ריצה.

העבירו צינורות עם שברים שנאספו על קרח. כדי להתחיל בהליך זה, הוסף שני נפחים של 100% אתנול קר לכל חלק שנאסף, ותן לקומפלקסים של חלבון ה-RNA לשקע במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למיצוי חלבונים, צנטריפוגה כל חלבון RNA משקע ב-11,000 גרם למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס לאחר שטיפה עם 70% אתנול יבש באוויר והשהה את המשקעים.

מאגר דגימת דף SDS לפני שתמשיך בניתוח כתמים מערביים למיצוי RNA Resus, השהה כל משקע חלבון RNA במאגר ליזה המכיל 0.1% SDS לעכל רכיב חלבון של המשקעים עם שני מיליגרם למיליליטר פרוטאינאז K למשך 30 דקות. באמבט מים של 55% צלזיוס, הוסף נפח אחד של פנול כלורופורם, שני נפחים של כלורופורם ונפח 0.1 של שני נתרן אצטט טוחנת pH ארבע. תן לו לנוח על קרח במשך 15 דקות.

צנטריפוגה ב-10,000 GS ב-4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. אסוף את השלב המימי המתקבל של כל דגימה לזרז RNA על ידי הוספת נפח אחד של איזופרופנול ו-0.2 מיקרוגרם למיקרוליטר גליקוגן והשארתו במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, סובבו את המשקעים ב-10,000 גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה.

הסר את הסופרנטנט ושטוף את כדור ה-RNA עם אתנול קר של 70% השהה מחדש את כדור ה-RNA לנפח קטן של RNAs. מים חינם. העריכו את הכמות והאיכות של RNA באמצעות פוטומטר הספקטרו.

מוצגים כאן פרופילי פוליזום מייצגים מתמציות ציטופלזמיות. מוכן מתאי HELO שגדלו בתנאים רגילים או לאחר טיפול במעכב הפרוטאזום במשך ארבע שעות וצנטריפוגה ביצעה שיפוע סוכרוז ליניארי של 15 עד 55% נפח למשקל. המיקומים של ריבוזומים 40 שניות 60 שניות, ריבוזומים 80 שניות, מונוס ופוליזום מצוינים בכל פרופיל.

שברים מלמעלה למטה של השיפוע מוצגים משמאל לימין שברים נאספו ונותחו על ידי Western Blot עם נוגדנים כנגד החלבון הריבוזומלי הגדול L 28, כמו גם החלבון הקשור לפוליזום FMRP המשמשים כבקרות לשלמות הפוליזומים בתנאי גידול רגילים. מתחמי התחלת תרגום מומרים לריבוזומים פולי שזיהויים על ידי פרופיל פוליזום מעיד על התחלת תרגום פעילה כפי שנצפה כאן. טיפול במעכב הפרוטאזום מפחית את שיאי הפוליזום עם עלייה נלווית ב-DS Monos המעידה על עיכוב התחלת התרגום תוך כדי השתתפות בהליך זה, חשוב לעבוד בסביבה נטולת שיפועים כדי לטפל בשיפועים בזהירות ולשלוט על ליזיס תאים לאחר הליך זה.

ניתן לבצע שיטות אחרות כגון דם מערבי ודם צפוני על מנת לענות על שאלות נוספות כמו עם אסוציאציה של חלבון ספציפי או M MNA עם פוליזום מושפע מטיפול אנטי סרטני לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום התרגום לחקור את ההשפעה של ויסות גורמי התחלת תרגום במחלות אנושיות כגון סרטן ומחלות ניווניות.