Name: ניתוח של תרגום ייזום בתנאי לחץ ידי Polysome פרופיל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: למדו ניתוח פרופיל פוליסומים למדידת השפעת תנאי לחץ על ייזום תרגום בתאי יונקים. שיטה זו מאפשרת הפרדת ריבוזומים פעילים ולא פעילים באמצעות צנטריפוגה בסוכרוז וניתוח ווסטרן בלוט.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הרשות הפלסטינית היא נמען של מלגה &quot;פייר דוראן&quot; בפקולטה לרפואה של האוניברסיטה לאוול. עבודה זו נתמכה על ידי למדעי הטבע והנדסת מועצת המחקר של קנדה (MOP-CG095386) ל RM fractionator polysome נרכש באמצעות קרן קנדית עבור חדשנות מענק (MOP-GF091050) לRMR M מחזיק הפרס משכורת חוקר חדש CIHR. אנו אסירי תודה לבני זוג. א Khandjian, י Gallouzi, ס &#39;Di-מרקו וא&#39; Cammas לעצות מועילות.

הפרוטוקול כדלקמן ההנחיות שאושר על ידי המועצה לביקורת האתית של לאוואל. 1. הכנת תרביות תאים ומניפולציה המוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי יונקים ודרוזופילה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול הלה תאי סרטן צוואר הרחם ותאים עובריים שניידר דרוזופילה כמומלץ על ידי התרבות האמריקנית אוסף סוג. עבודה עם תאים במעבר נמוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאים כדי להגיע למפגש 80% היום של הניסוי. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, השתמש ~ 12 x 10 6 תאים לכל תנאי ניסוי. לפני קבלת תמציות לניתוח polysome, לעורר תרגום על ידי הוספה בינונית מלא טרי לפחות 90 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד מוח: לבודד את המוח מעכברים בגילים שבין 9 ו16 ימים לאחר לידה. המתת חסד כרוך משאיפת CO 2 אחרי הרדמה ונקע בצוואר הרחם. בעקבות הקרבה, לבודד את המוח כולו וגם מקום שאניt ב -80 מעלות צלזיוס או ישירות להעביר אותו לקר PBS 1X לשימוש מיידי. </li></ol> 2. מערכת ההיפוך החלוקה Gradient הכנת הצפיפות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את מערכת צינורות עם 0.1% SDS למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את מערכת צינורות עם אתנול 70% למשך 5 דקות, ולאחר מכן עם RNaseZAP פתרון עבור 5 דקות לפני שטיפה עם מים DEPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משאבת אוויר כדי לייבש את מערכת צינורות של המנגנון. </li></ol> 3. הכנת עירובי סוכרוז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את פתרונות סוכרוז 15% ו55% ב20 מ&quot;מ טריס-HCl pH 7.4, 1.25 מ&quot;מ MgCl 2, 150 mM NaCl, ו1 מ&quot;מ DTT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור 15-55% שיפוע סוכרוז ליניארי באמצעות ISCO דגם 160 שיפוע לשעבר, כפי שתוארו על ידי הוראות היצרן. עם זאת, חשוב לשלוט גם על מהירות משאבת peristaltic טריס על מנת למנוע יצירה של בועות או מערבולות בהדרגות. שמור הדרגתיים על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הזמן שבו תכנית יצרנית השיפוע פועלת, לקרר את ultracentrifuge עד 4 ° C. </li></ol> 4. הכנת נייד ותמציות מוח עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תמציות סלולריים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת מקום (ים) בתאי קרח ולשטוף 3x עם PBS הקר 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים (~ 12 x 10 6) במאגר 1 תמוגה מיליליטר (20 מ&quot;מ טריס-HCl ב-pH 7.4, 1.25 מ&quot;מ MgCl 2, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 1% P40 Nonidet, 5 מעכב U / מיליליטר RNase, בתוספת עם טבליות מעכבי פרוטאז קוקטייל מלאים מיני ללא EDTA), להעביר אותם לצינור Eppendorf, ומערבבים היטב על ידי העברתם 15x באמצעות מזרק אינסולין U100 1cc 28 G 1/2. בואו lysate התא לנוח על קרח במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים כמה טיפות של lysate תא לשקופית להעריך תמוגה הסלולרית על ידי ההתבוננות במיקרוסקופ לעומת שלב באמצעות מטרת 10X. גרעינים רק צריכים להיות גלויים ולא קרום תא צריך להיות מעיד גלוי לתמוגה תא. כמו שליטה, להתבונןתאי unlysed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבהיר את lysate התא על ידי צנטריפוגה ב11,000 XG עבור 20 דקות על 4 מעלות צלזיוס ולשמור lysate המסיסים המכיל polyribosomes. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תמציות מוח עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize המוח כולו המבודד (~ מ&quot;ג 500) על ידי 10 משיכות בhomogenizer Dounce קר כקרח עם 2 מיליליטר של חיץ תמוגה ולהבהיר את homogenate על ידי צנטריפוגה ב11,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את supernatant וכתוצאה מכך על כרית של סוכרוז 50% ולהמשיך עם שקיעה לשעה 2 ב 200,000 XG באמצעות הרוטור ultracentrifuge TH-641 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הכדור השקוף המכיל polyribosomes ב 1 מיליליטר של חיץ תמוגה ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה. בואו שאר ההשעיה על הקרח למשך 30 דקות לפני העמסתי על הדרגות. </li></ol></li></ol> 5. טוען תמציות על סוכרוז הדרגות וultracentrifugation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את הריכוזשל RNA הנמצא בתמצית cytoplasmic באמצעות ספקטרופוטומטר. לאט ובזהירות לטעון ~ 20 OD 260 יחידות של התמצית על גבי שיפוע סוכרוז 15% ל55%. ודא שיש 2-3 מ&quot;מ של שטח פנוי על פני השטח של צינור כדי למנוע גדות הצינורות במהלך צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הדרגתיים באמצעות אולטרה צנטריפוגות במשך שעה 2 30 דקות ב 230,000 XG באמצעות הרוטור ultracentrifuge TH-641 ב 4 ° C. כאשר מסתיימת צנטריפוגה, להסיר את הצינורות ומניח אותם על קרח בזהירות שלא להפריע את השיפועים. </li></ol> 6. היפוך חלוק של תמציות cytoplasmic לPolysomes פרופיל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח הדרגתיים סוכרוז על מערכת היפוך חלוקה צפיפות אוטומטית ולהמשיך עם חלוקה ואיסוף אוטומטיים של שברים (0.5 מיליליטר כל אחד), כפי שתואר על ידי היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף כל חלק (~ μl 500) לתוך צינורות Eppendorf אדם עם ניטור רציף של הספיגה ב 254 ננומטר. בparallאל של מבצע חלוקה השיפוע, פרופיל polyribosomal יהיה עריכה על נייר התרשים. לחלופין, השתמש ביחידת רכישת נתונים המצורפת למקליט התרשים יש רכישה אלקטרונית של פרופיל polysome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף כל סיבוב, להעביר eppendorfs נאסף על קרח יבש. בשלב זה, גם חנות שנאספו שברים ב -80 מעלות צלזיוס או ישירות משקע מתחמי החלבון-RNA באופן הבא. </li></ol> 7. מיצוי חלבון וניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל שבר שנאסף משיפוע סוכרוז, להוסיף 2 כרכים של 100% אתנול קר ולתת קומפלקסי RNA-חלבון לזרז ב -20 לילה מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה כל משקע RNA-חלבון ב11,000 XG עבור 20 דקות על 4 מעלות צלזיוס ולאחר מכן לשטוף עם 70% אתנול. יבש וresuspend המשקע בחיץ מדגם SDS-PAGE לפני שתמשיך עם כתם מערבי באמצעות נוגדנים ספציפיים (ראה איור 2). </li></ol> 8. RNA חילוץ וnalysis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משקע מתחמי RNA-חלבון כמו בסעיף 7.1. Resuspend כל משקע RNA-חלבון במאגר תמוגה מכיל 0.1% SDS. לעכל את מרכיב החלבון של המשקע עם 2 מ&quot;ג / מיליליטר proteinase K ל30 דקות באמבט מים C ° 55. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלץ רכיבי RNA של המשקע על ידי הוספת נפח של 1 &quot;פנול: כלורופורם&quot;, 2 כרכים של כלורופורם, ו0.1 נפח של 2-pH M NaOAc 4 וצנטריפוגה ב 10,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. משקע RNA מהשלב וכתוצאה מהמימי של כל דגימת לילה בשעה -20 ° C על ידי הוספת נפח של 1 isopropanol ו0.2 מיקרוגרם / μl של גליקוגן. ספין המשקע עבור שעה 1 ב 10,000 XG ב 4 ° C. שטוף את כדור RNA עם 70% אתנול קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את כדור RNA לנפח קטן של מים חופשיים RNAse. להעריך את הכמות ואיכות של RNA באמצעות ספקטרופוטומטר. </li></ol>

<ol><li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of translational control.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (10), 827-835 (2004).</li>
<li>Jackson, R. J., Hellen, C. U. T., Pestova, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+eukaryotic+translation+initiation+and+principles+of+its+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (2), 113-127 (2010).</li>
<li>Fournier, M. -J., Gareau, C., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotherapeutic+agent+bortezomib+induces+the+formation+of+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+International%22%5BJournal%5D)">The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules.</a> Cancer Cell International. 10 (12), (2010).</li>
<li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+stress+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Mazroui, R., Huot, M. -E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trapping+of+messenger+RNA+by+Fragile+X+Mental+Retardation+protein+into+cytoplasmic+granules+induces+translation+repression%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression.</a> Human Molecular Genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).</li>
<li>Mazroui, R., Huot, M. -E., Tremblay, S., Boilard, N., Labelle, Y., Khandjian, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fragile+X+Mental+Retardation+protein+determinants+required+for+its+association+with+polyribosomal+mRNPs%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Fragile X Mental Retardation protein determinants required for its association with polyribosomal mRNPs.</a> Human Molecular Genetics. 12 (23), 3087-3096 (2003).</li>
<li>Farny, N. G., Kedersha, N. L., Silver, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Metazoan+stress+granule+assembly+is+mediated+by+P-eIF2alpha-dependent+and+-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">a Metazoan stress granule assembly is mediated by P-eIF2alpha-dependent and -independent mechanisms.</a> RNA. 15 (10), New York, N.Y. 1814-1821 (2009).</li>
<li>Gareau, C., Houssin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+fragile+x+mental+retardation+protein+recruitment+and+dynamics+in+Drosophila+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Characterization of fragile x mental retardation protein recruitment and dynamics in Drosophila stress granules.</a> PLoS ONE. 8 (2), (2013).</li>
<li>Brackett, D. M., Qing, F., Amieux, P. S., Sellers, D. L., Horner, P. J., Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMR1+transcript+isoforms%3A+association+with+polyribosomes%3B+regional+and+developmental+expression+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">FMR1 transcript isoforms: association with polyribosomes; regional and developmental expression in mouse brain.</a> PLoS ONE. 8 (3), (2013).</li>
<li>Khandjian, E. W., Huot, M. -E., Tremblay, S., Davidovic, L., Mazroui, R., Bardoni, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+evidence+for+the+association+of+fragile+X+mental+retardation+protein+with+brain+polyribosomal+ribonucleoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Biochemical evidence for the association of fragile X mental retardation protein with brain polyribosomal ribonucleoparticles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (36), 13357-13362 (2004).</li>
<li>Erikson, A., Winblad, B., Wallace, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+of+gene+expression+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neuropsychopharmacol+Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Translational control of gene expression in the human brain.</a> Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 13 (3-4), 469-479 (1989).</li>
<li>Stephens, S. B., Nicchitta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V+In+vitro+and+tissue+culture+methods+for+analysis+of+translation+initiation+on+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">V In vitro and tissue culture methods for analysis of translation initiation on the endoplasmic reticulum.</a> Methods in Enzymology. 431, 47-60 (2007).</li>
<li>Koritzinsky, M., Wouters, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+regulation+of+messenger+RNA+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and regulation of messenger RNA translation.</a> Methods in Enzymology. 435, 247-273 (2007).</li>
<li>Khandjian, E. W., Corbin, F., Woerly, S., Rousseau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fragile+X+mental+retardation+protein+is+associated+with+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The fragile X mental retardation protein is associated with ribosomes.</a> Nature Genetics. 12, 91-93 (1996).</li>
<li>Sivan, G., Kedersha, N., Elroy-Stein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+slowdown+mediates+translational+arrest+during+cellular+division%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Ribosomal slowdown mediates translational arrest during cellular division.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (19), 6639-6646 (2007).</li>
<li>Thomas, J. D., Johannes, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mRNAs+that+continue+to+associate+with+polysomes+during+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Identification of mRNAs that continue to associate with polysomes during hypoxia.</a> RNA. 13, 1116-1131 (2007).</li>
<li>Kumaraswamy, S., Chinnaiyan, P., Shankavaram, U. T., Lü, X., Camphausen, K., Tofilon, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-induced+gene+translation+profiles+reveal+tumor+type+and+cancer-specific+components%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Radiation-induced gene translation profiles reveal tumor type and cancer-specific components.</a> Cancer Research. 68 (10), 3819-3826 (2008).</li>
<li>Fournier, M. -J., Coudert, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+the+mTORC1-eIF4E+Pathway+alters+Stress+Granules+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Inactivation of the mTORC1-eIF4E Pathway alters Stress Granules Formation.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (11), 2285-2301 (2013).</li>
<li>Sanchez, G., Dury, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+function+for+the+survival+motoneuron+protein+as+a+translational+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel function for the survival motoneuron protein as a translational regulator.</a> Human Molecular Genetics. 22 (4), 668-684 (2013).</li>
<li>Béchade, C., Rostaing, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+distribution+of+survival+motor+neuron+%28SMN%29+protein%3A+possible+involvement+in+nucleocytoplasmic+and+dendritic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Subcellular distribution of survival motor neuron (SMN) protein: possible involvement in nucleocytoplasmic and dendritic transport.</a> The European Journal of Neuroscience. 11 (1), 293-304 (1999).</li>
<li>Goulet, I., Boisvenue, S., Mokas, S., Mazroui, R., Côté, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDRD3%2C+a+novel+Tudor+domain-containing+protein%2C+localizes+to+cytoplasmic+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">TDRD3, a novel Tudor domain-containing protein, localizes to cytoplasmic stress granules.</a> Human Molecular Genetics. 17 (19), 3055-3074 (2008).</li>
<li>Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+let-7a+miRNA+blocks+protein+production+on+actively+translating+polyribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Human let-7a miRNA blocks protein production on actively translating polyribosomes.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 13 (12), 1108-1114 (2006).</li>
<li>Genolet, R., Araud, T., Maillard, L., Jaquier-Gubler, P., Curran, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+to+analyse+the+specific+impact+of+rapamycin+on+mRNA-ribosome+association%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medical+Genomics%22%5BJournal%5D)">An approach to analyse the specific impact of rapamycin on mRNA-ribosome association.</a> BMC Medical Genomics. 1 (33), (2008).</li>
<li>Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Isolation+of+polysome-bound+mRNA+from+solid+tissues+amenable+for+RT-PCR+and+profiling+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">a Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments.</a> RNA. 13 (3), New York, N.Y. 414-421 (2007).</li>
<li>Thoreen, C. C., Chantranupong, L., Keys, H. R., Wang, T., Gray, N. S., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unifying+model+for+mTORC1-mediated+regulation+of+mRNA+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation.</a> Nature. 485 (7396), 109-113 (2012).</li>
<li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., Mcgeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li>
<li>Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+footprints+on+a+transcriptome+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Ribosomal footprints on a transcriptome landscape.</a> Genome Biology. 10 (4), (2009).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

ניתוח פרופיל polysome על הדרגתיים סוכרוז מאפשר מדידה של חניכה תרגום על ידי ניתוח הצפיפות של polysomes מבודד תאים או רקמות 9,11-14. טכניקה זו היא הטובה ביותר (אם לא ייחודית) הגישה למדידת ייזום תרגום in vivo. הוא משמש כדי לפקח על מצב translational של גידול תאים בתא מחזור 15, וכדי להעריך את ההשפעות של סוגים שונים של לחץ כוללים זיהומים נגיפיים, היפוקסיה 13,16, קרינה 17, ותרופות כימיות 18 משמשים בטיפול, בייזום תרגום. עם זא...

תאי אוקריוטים נתקלים כל הזמן במגוון של מצבים פיסיולוגיים וסביבתיים מזיקים מתח שדורשים תגובת תא הסתגלות מהירה. תגובת לחץ תא כרוכה באיזון מדויק בין גורמים הפועלים נגד הישרדות והפרה הישרדות. לשבש את האיזון הזה יכול להיות השלכות בלתי הפיכות המובילות את הפיתוח של פתולוגיות אדם כגון סרטן ומחלות ניווניות. במהלך השלב הראשון של תגובת הלחץ, תאים להפעיל מסלולים הפרו הישרדות שכוללים שליטה מתואמת של שינויים בביטוי גנים ברמה של תרגום ה-mRNA. תרגום ה-mRNA באאוקריוטים הוא תהליך תאי מורכב שכרוכים באינטראקציות מתואמות בין גורמי חניכה התרגום (EIFS), חלבוני RNA הספציפי מחייבים (ריב &#39;), ומולקולות RNA 1. תרגום ה-mRNA מתחלק לשלושה שלבים ברורים: ייזום, התארכות, וסיום. למרות שכל שלושת השלבים כפופים לreguמנגנוני latory, מנגנוני בקרת translational למקד בעיקר בשלב הייזום של תרגום, אשר ובכך מהווה את צעד שער הגבלה של חלבון סינתזה 2. חניכה תרגום היא תהליך הורה מאוד שמתחיל עם הקמתה של eIF2a.GTP.Met-tRNA פגשתי מורכב משולשת ולאחר מכן מחייבת שלה למקטע הריבוזום 40S, מה שמוביל להיווצרות של המתחם טרום החניכה. השלב הבא הוא הגיוס של מתחם preinitiation mRNA, הכולל את הפעילות של גורמי חניכה תרגום כגון eIF4F וeIF3. מורכב preinitiation 48S וכך נוצרו עובר שינויי קונפורמציה ספציפיים המאפשרים למנגנון הזה כדי להתחיל לסרוק את אזור 5&#39;-מתורגם של ה-mRNA עד שהוא מזהה את הייזום קודון אוגוסט אז רוב גורמי החניכה התרגום משתחררים ויחידות משנת 60S מגויסות כדי ליצור 80S הריבוזום מורכב מוסמך לתרגום,לא שמתחיל את סינתזת חלבון נקודה (איור 1). יותר מפעם אחת 80S monosome ניתן לתרגם את אותו mRNA בזמן הפקת polysomes שנקרא (או polyribosomes). הצפיפות של polysomes על mRNA משקפת ייזום, התארכות ושיעורי סיום ובכך הוא מדד של translatability של תעתיק מסוים. עם זאת, polysome פרופיל משמש בעיקר כדי להעריך את השינויים בתרגום ה-mRNA בשלב הייזום. כאן השתמשנו מעכב הפרוטאזום כמעכב ייזום תרגום. טיפול בתאי סרטן עם תרופה זו גורם לתגובת לחץ המאופיינת בהפעלה של קינאז בשם המתח HRI שphosphorylates גורם החניכה תרגום eIF2a 3. זירחון של eIF2a הוא אחד האירועים המרכזיים שהובילו לעיכוב של חניכה תרגום בתאי יונקים 4.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Cells</td></tr><tr><td>HeLa תאי סרטן צוואר הרחם</td><td>אוסף תרביות מסוג אמריקאי (Manassas, VA; ATCC)</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>שניידר Drosophila תאים עובריים</td><td>אוסף תרביות מסוג אמריקאי (Manassas, VA; ATCC)</td><td>CRL-1963</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">מדיום תרבות ותוספי</td></tr><tr><td>מזון שניידר s Drosophila</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td> בינוני <td>SO146-500ml</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life טכנולוגיות</td><td>11995-073</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מדען FBS</td><td>פישר</td><td>SH30396-03</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">פתרונות סוכרוז</td></tr><tr><td>D-סוכרוז</td><td>מדען</td><td>פישר BP220-212</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>49767</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ברומופנול כחול</td><td>פישר מדען</td><td>B3925</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">מאגר ליזה</td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Fisher Scientist</td><td>BP153-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Tekniscience</td><td>3624-05</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DTT</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D 9779</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Nonidet P40 (Igepal CA-630</td>) <td>MJS Biolynx</td><td>19628</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Tekniscience</td><td>4095-02</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מעכב RNase (מעכב ריבונוקלאז רקומביננטי RnaseOUT)</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>10777-019</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>נוגדי פרוטאזות (מלא, מיני, ללא EDTA)</td><td>רוש</td><td>11,836,170,001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">מיצוי RNA</td></tr><tr><td>פרוטאינאז K</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>AM2542</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>פנול:כלורופורם</td><td>פישר מדען</td><td>BP1754I-400</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>פישר מדען</td><td>C298-500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>גליקוגן</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>10814-010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>איזופרופנול</td><td>אקרוס אורגני</td><td>327270010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">נוגדנים</td></tr><tr><td>נגד נוגדן FMRP</td><td>פורנייה et al., Cancer Cell International, 2010</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

ניתוח של תרגום ייזום בתנאי לחץ ידי polysome פרופיל

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

שליטה מדויקת של תרגום ה-mRNA היא יסוד להומאוסטזיס תא אוקריוטים, בעיקר בתגובה ללחץ פיסיולוגי ופתולוגיים. שינויים של תכנית זו יכול להוביל לצמיחה של תאים שניזוקו, סימן היכר של התפתחות הסרטן, או למוות של תאים מוקדמים כגון ראה במחלות ניווניות. הרבה ממה שידוע בנוגע לבסיס המולקולרי לבקרת translational כבר מתקבלים מניתוח polysome באמצעות מערכת חלוקה שיפוע צפיפות. טכניקה זו מסתמכת על ultracentrifugation של תמציות cytoplasmic על שיפוע סוכרוז ליניארי. ברגע שהספין הושלם, המערכת מאפשרת חלוקה וכימות של אזורי centrifuged המתאימים לתרגום שונה הריבוזומים אוכלוסיות, ובכך וכתוצאה מכך פרופיל polysome. שינויים בפרופיל polysome מעידים על שינויים או פגמים בייזום תרגום המתרחשים בתגובה לסוגים שונים של מתח. טכניקה זו מאפשרת גם להעריך את התפקיד דואר של חלבונים ספציפיים על ייזום תרגום, וכדי למדוד את פעילות translational של mRNAs הספציפי. כאן אנו מתארים הפרוטוקול שלנו לביצוע פרופילי polysome על מנת להעריך חניכה תרגום של תאים ורקמות אוקריוטים בתנאי גידול נורמלים או מתח.

כאמור, polysome פרופיל מאפשר הניתוח של שינויים של חניכה תרגום בתנאי לחץ. איור 1 היא תצוגה פשוטה של ייזום תרגום אשר כפי שתואר קודם לכן הוא תהליך רב שלבי מעורבים הרכבה מסודרת של מתחמי ייזום תרגום. תחת תנאי גידול רגילים, מתחמי ייזום תרגום מומרים לpolyribosomes גילויו על ידי פרופיל polysome מעיד על חניכה תרגום פעילה (איור 2; שלא טופל). תחת תנאי לחץ לעומת זאת, חניכה תרגום חסומה וכתוצאה מכך ההצטברות של monosomes 80S והפחתה של פסגות polysome (איו...

כאן, אנו מתארים שיטה לניתוח שינויים בייזום של תרגום ה-mRNA של תאי אוקריוטים בתגובה למצבי לחץ. שיטה זו מבוססת על הפרדת המהירות בשיפועי סוכרוז של תרגום ריבוזומים מהריבוזומים שאינם תרגום.

ניתוח של תרגום ייזום בתנאי לחץ ידי Polysome פרופיל

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא למדוד את השפעותיהם של תנאי עקה על תרגום וייזום בתאים וברקמות של יונקים באמצעות פרופיל פוליסומים. הדבר מושג תחילה על ידי טיפול בתאי סרטן של יונקים בתרופה אנטי-סרטנית ולאחר מכן הכנת תמציות תאים. השלב השני הוא הכנת מדרגי סוכרוז.בשלב הבא, תמציות התאים נטענות על מדרגי סוכרוז ועוברות אולטרה-צנטריפוגציה כדי להפריד את הפракציות הריבוזומליות. לבסוף, מבוצע ניתוח western blot באמצעות נוגדנים ספציפיים כדי להעריך את הקשר של החלבונים הנבדקים עם הפוליסומם. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון סימון מטבולי, הוא שהיא מאפשרת לנו להעריך את השפעתם של תנאי עקה על שלב האיניציאציה של התרגום.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הטיפול במצבי עקה, כגון האם וכיצד תרופות אנטי-סרטניות משפיעות על תחילת התרגום. השלכותיה של טכניקה זו חולשות על טיפול בסרטן, כיוון שהיא מסייעת בחשיפת מסלולי בקרה חדשים של תחילת התרגום. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הבקרה של תחילת התרגום בתרביות תאים, ניתן ליישמה גם במערכות אחרות כגון רקמות מבודדות, כולל מוח וגידולים.להכנת מערכת הפרדת מדרג הצפיפות האוטומטית, שטפו תחילה את מערכת הצינורות של המכשיר ב-0.1% SDS למשך חמש דקות. לאחר מכן, שטפו את מערכת הצינורות ב-70% ethanol למשך חמש דקות, ולאחריהם בתמיסת RNA Zap למשך חמש דקות. לבסוף, שטפו במים עם DEPC, וייבשו את מערכת הצינורות על ידי הזרמת אוויר למערכת.לאחר מכן, הכין תסמיכי סוכרוז בריכוזים של 15% ו-55%, וצור גרדיאנט סוכרוז ליניארי של 15% עד 55% באמצעות מכשיר gradient former מדגם ISCO model one 60. בהתאם להוראות היצרן, חשוב לשלוט בקפידה במהירות משאבת הפריסטלטיקה כדי למנוע היווצרות בועות או טורבולנציות בגרדיאנטים בזמן הרצת תוכנת יצירת הגרדיאנט. קרר את האולטרה-צנטריפוגה ל-4°C. שמור את הגרדיאנטים בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש. ניסוי זה משתמש בתאי סרטן צוואר הרחם HeLa במעבר נמוך (low passage), אשר נזרעו מראש עד להגעה ל-80% confluence.ביום הניסוי. חשוב לבצע מיצויים מתאיםים לתאים טריים ולהימנע מזיהום ב-RNA במהלך הליך זה; 90 דקות לפני הוספת התרופה נגד הסרטן, החליפו את המצע של התאים במצע טרי ומלא. כדי לעודד תרגום, החזירו את התאים לאינקובטור.הוסיפו את התרופה נגד הסרטן ישירות לתרבית התאים כביקורת חיובית. דגמו ב-DMSO והדגירו למשך ארבע שעות ב-37 °C ו-5% carbon dioxide. לאחר ארבע שעות, הניחו את הפלטות על קרח ושטפו את התאים שלוש פעמים ב-PBS קר. אספו את התאים ב-1 mL של באפר ליזיס לקבלת התוצאות הטובות ביותר. השתמשו בכ-12 מיליון תאים עבור כל תנאי ניסויי.העבירו את התאים מהצלחות הגרד למבחנת אפנדורף וערבבו היטב על ידי העברתם 15 פעמים דרך מזרק. הניחו לליזאטים של התאים לנוח על קרח למשך 15 דקות. לאחר מכן, טפטפו מספר טיפות של ליזאט תאי על זכוכית, והעריכו את הליזיס התאי באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה עם עדשה של 10x.לאחר שווידאת את ליזיס התאים, הבהר את ליזט התאים באמצעות צנטריפוגציה ב-11,000 Gs למשך 20 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. העבר את הליזט המסיס המכיל את הפוליריבוסומים למבחנה חדשה ושמור אותו על קרח לפני טעינת התמציות הציטופלזמיות על מדרגי סוכרוז. מדוד את ריכוז ה-RNA הקיים באמצעות ספקטרופוטומטר, וטען בזהירות ובאיטיות כ-20 OD עד 60 יחידות מהתמצית על מדרג סוכרוז של 15% עד 55%.וודאו שנותר מרווח פנוי של שני עד שלושה מילימטרים על פני השטח של המבחנה כדי למנוע גלישה של תכולתה במהלך הצנטריפוגציה. העמיסו את המבחנות על הרוטור. מקמו את הרוטור בעלטרה-צנטריפוגה וסובבו את הגרדיאנטים ב-230,000 Gs בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius למשך שעתיים ו-30 דקות.עם סיום הסבוב במצנטריפוגה, הוצא את המבחנות והנח אותן בזהירות על קרח מבלי להפר את הגרדיאנטים. כדי להתחיל בפרקציונציה של תמציות הציטופלזמה, הנח את גרדיאנט הסוכרוז במערכת אוטומטית לפרקציונציית צפיפות ובצע פרקציונציה ואיסוף אוטומטיים של הפרקציות לפי הנחיות היצרן. אסוף כל פרקציה של 0.5 מיליליטר למבחנות einor נפרדות תוך ניטור רציף של הבליעה ב-250 ננומטר במקביל לפעולת פרקציונציית הגרדיאנט; פרופיל הפוליריבוסומים יודפס על נייר גרף בסיום כל ריצה.העבירו את מבחנות ה-eend עם הפראקציות שנאספו אל קרח. כדי להתחיל בהליך זה, הוסיפו שני נפחים של 100% ethanol קר לכל פראקציה שנאספה, והניחו לקומפלקסים של RNA וחלבון לשקוע בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס למשך הלילה. לצורך מיצוי חלבונים, סבבו במערך צנטריפוגה כל משקע של RNA וחלבון ב-11,000 Gs למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס; לאחר שטיפה ב-70% ethanol, ייבשו באוויר והמיסו מחדש את המשקע.בפר אוף לדגימה עבור SDS page לפני המשך בניתוח western blot למיצוי של RNA Resus, השעו כל משקע של חלבון RNA בבפר ליזיס המכיל 0.1%SDS; עשקו את רכיב החלבון של המשקע עם proteinase K בריכוז two milligrams per milliliter למשך 30 דקות. במקלח מים בטמפרטורה של 55%Celsius, הוסיפו נפח אחד של פנול כלורופורם, שני נפחים של כלורופורם ו-0.1 נפח של sodium acetate בריכוז two molar ב-pH ארבע. השאירו את התערובת לנוח על קרח למשך 15 דקות.סבבו בצנטריפוגה ב-10,000 GS בטמפרטורה של 4 °C למשך 20 דקות. אספו את הפאזה המימית שהתקבלה מכל דגימה. שקעו את ה-RNA על ידי הוספת נפח אחד של איזופרופנול ו-0.2 µg/µL של גליקוגן, והשאירו את הדגימה בטמפרטורה של 20 °C- למשך לילה. למחרת, סבבו את המשקע בצנטריפוגה ב-10,000 Gs בטמפרטורה של 4 °C למשך שעה אחת.הסר את הנוזל העליון ושטוף את משקע ה-RNA באתנול קר בריכוז 70%. השב את משקע ה-RNA לנפח קטן של מים נקיים ל-RNA. הער את כמות ואיכות ה-RNA באמצעות ספקטרופוטומטר.מוצגים כאן פרופילים מייצגים של פוליסומים מתוך תמציות ציטופלזמיות. התמציות הופקו מתאי HeLa שגודלו בתנאים רגילים או לאחר טיפול במעכב פרוטאוזום למשך ארבע שעות, והצנטריפוגה בוצעה במדרג סוכרוז ליניארי של 15% עד 55% (נפח למשקל). מיקומם של ריבוזומים 40s, ריבוזומים 60s, מונוסומים 80s ופוליסומים מסומנים בכל פרופיל.שברים מהחלק העליון לתחתון של המדרג מוצגים משמאל לימין; השברים נאספו ונולתחו באמצעות Western blot עם נוגדנים נגד החלבון הריבוזומלי הגדול L 28, וכן נגד החלבון FMRP הקשור לפוליסומים, המשמשים כביקורות לשלמות הפוליסומים בתנאי צמיחה רגילים. קומפלקסים של התחלת תרגום הופכים לפוליריבוזומים, שזיהויים באמצעות פרופיל פוליסומים מעיד על התחלת תרגום פעילה, כפי שנראה כאן. טיפול עם מעכב פרוטאוזום מפחית את שיאי הפוליסומים עם עלייה נלווית במונוסומים, מה שמעיד על עיכוב של התחלת התרגום. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לעבוד בסביבה נטולת RNase, לטפל במדרגים בזהירות ולבקר את ליזיס התאים בעקבות הליך זה.ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון western blot ו-northern blot, כדי לענות על שאלות נוספות, למשל כיצד השפעת הטיפול נגד סרטן על קישור של חלבון ספציפי או mRNA לפוליסום לאחר פיתוחו. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום התרגום ל explorable של השפעת ויסות גורמי פתיחת התרגום במחלות אנוש כגון סרטן ומחלות נוירודגנרטיביות.

analysis-translation-initiation-during-stress-conditions-polysome

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מאמר זה מתאר פרוטוקול להפקת תרגום הריבוזומים של התאים האיקריוטים. לאחר שחולצו, ריבוזומים מופרדים monosomes ו polyribosomes על ידי חלוקה סוכרוז הדרגתי כדי לאפשר לאוכלוסיות שונות ריבוזומלי להיות מנותח. ככזה, שיטה זו היא תקן הזהב לבחינת הרגולציה של התרגום.

האיקריוטים פרופיל Polyribosome ניתוח

הריבוזומים לשחק תפקיד מרכזי בסינתזה של חלבונים. חלוקה Polyribosome (polysome) על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות סוכרוז מאפשרת קביעה ישירה של יעילות תרגום של mRNAs הבודד בקנה מידת הגנום כולו. בנוסף, בשיטה זו ניתן להשתמש לצורך הניתוח ביוכימי של הריבוזום וגורמים הקשורים polysome כגון מלווים ומולקולות איתות.

Polysome היפוך חלוק וניתוח של יונקי Translatomes בקנה מידת הגנום

היכולת של תאים להסתגל ללחץ היא קריטית להישרדותם. ויסות תרגום mRNA הוא אסטרטגיית הסתגלות כזו, המספקת ויסות מהיר של הפרוטאום. כאן, אנו מספקים פרוטוקול פרופיל פוליזום סטנדרטי לזיהוי mRNAs ספציפיים המתורגמים באופן סלקטיבי בתנאי לחץ.

הערכת סלקטיבי mRNA התרגום בתאי יונקים ידי Polysome פרופיל

פרוטוקול זה מתאר שיטה קלה לחילוץ ופיצול תעתיקים מרקמות צמחים על בסיס מספר הריבוזומים הקשורים. הוא מאפשר הערכה גלובלית של פעילות התרגום וקביעת סטטוס התרגום של mRNAs ספציפיים.

שיטה קלה הצמח Polysome Profiling

תקנה translational ממלא תפקיד חשוב בבקרה על שפע חלבונים. כאן, אנו מתארים שיטה תפוקה גבוהה לניתוח כמותי של תרגום שמרים ניצני האפייה.

הגנום כולו כימות של תרגום ניצני שמרים על-ידי יצירת פרופיל ריבוזום

Toeprinting נועד למדוד את היכולת של במבחנה עיבד RNA ל טופס תרגום חניכה מתחמי עם הריבוזומים תחת מגוון תנאים. פרוטוקול זה מתאר שיטה עבור toeprinting בתרבית של RNA והוא יכול לשמש כדי ללמוד תרגום תלויי-קאפ והן מונחות IRES.

ניתוח Toeprinting של תרגום חניכה היווצרות מורכבות על יונקים mRNAs

המטרה הכוללת של טכניקה פרופיל polysome הוא ניתוח של פעילות translational של הפרט mRNAs או transcriptome mRNAs במהלך סינתזת החלבון. השיטה זו חשוב ללימודים של רגולציה סינתזה של חלבון, הפעלת תרגום ודיכוי בריאות ומחלות האנושי מרובים.

Polysome פרופיל לישמניה, תאים אנושיים, Testis העכבר

התפתחות מוח היונקים דורשת שליטה נאותה בביטוי הגנים ברמת התרגום. כאן, אנו מתארים מערכת פרופיל פוליזום עם פלטפורמת יצירת שיפוע סוכרוז קל להרכבה ושבר כדי להעריך את מצב התרגום של mRNAs במוח המתפתח.

ניתוח תרגום במוח העכבר המתפתח באמצעות פרופיל פוליזום

אנו מציגים טכניקה לייצוב מהיר של מתחמים תרגומיים (ביוסינטזה של חלבונים) עם קשרים צולבים פורמלדהידים בתאי שמרים ויונקים חיים. הגישה מאפשרת לנתח מתווכים ארעיים ואינטראקציות דינמיות של RNA:חלבון. ניתן להשתמש במתחמים המקושרים ביישומים מרובים במורד הזרם, כגון בשיטות פרופיל מבוססות רצף עמוק, מיקרוסקופיה וספקטרומטריית מסה.

קיבוע מהיר ב- Vivo ובידוד מתחמים תרגומיים מתאי אוקריוטיים

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור פרופיל פוליזום מבלי להשתמש ביצרני שיפועים אוטומטיים או במערכות פיצול הדרגתיות.

פרופיל פוליזום ללא יצרני שיפועים או מערכות פיצול

הפרוטוקול המוצג כאן כולל פרופיל פוליזומלי כדי לבודד טרנסלטום, mRNA הקשור לריבוזומים, לרנ"א לא פוליזומלי ופוליזומלי מארבידופסיס באמצעות צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות סוכרוז. שיטה זו מדגימה את יעילות התרגום של Arabidopsis בלחץ חום.

בדיקת יעילות תרגום באמצעות פרופילי פוליזום תחת לחץ חום

למדו ניתוח פרופיל פוליסומים למדידת השפעת תנאי לחץ על ייזום תרגום בתאי יונקים. שיטה זו מאפשרת הפרדת ריבוזומים פעילים ולא פעילים באמצעות צנטריפוגה בסוכרוז וניתוח ווסטרן בלוט.

ניתוח של תרגום ייזום בתנאי לחץ ידי Polysome פרופיל

גלה סרטונים נוספים