Name: נוזל עמוד שדרת MicroRNA פרופיל שימוש כמותי בזמן אמת PCR (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: למד פרופיל microRNA בנוזל עמוד השדרה באמצעות PCR כמותי בזמן אמת. השיטה מאפשרת ניתוח של 742 רצפים ייחודיים ומסייעת בחקר מנגנונים נוירוביולוגיים ובאבחון מצבים נוירולוגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

הפרויקט המתואר נתמכה על ידי מספר פרס R01MH079751 (PI: פ Peruzzi) מהמכון הלאומי לבריאות נפש. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות נפש או המכון הלאומי לבריאות.

<ol><li>Pacifici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+miRNA+profile+in+HIV-encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid miRNA profile in HIV-encephalitis.</a> J. Cell. Physiol. 10, (2012).</li>
<li>Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+widespread+regulation+of+microRNA+biogenesis%2C+function+and+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet.%22%5BJournal%5D)">The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay.</a> Nat. Rev. Genet.. 11, 597-610 (2010).</li>
<li>Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+signatures+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNA signatures in human cancers.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 857-866 (2006).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+microRNAs+in+serum%3A+a+novel+class+of+biomarkers+for+diagnosis+of+cancer+and+other+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.</a> Cell Res. 18, 997-1006 (2008).</li>
<li>De Smaele, E., Ferretti, E., Gulino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+as+biomarkers+for+CNS+cancer+and+other+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs as biomarkers for CNS cancer and other disorders.</a> Brain Res. 1338, 100-111 (2010).</li>
<li>Heneghan, H. M., Miller, N., Kerin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiRNAs+as+biomarkers+and+therapeutic+targets+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">MiRNAs as biomarkers and therapeutic targets in cancer.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 10, 543-550 (2010).</li>
<li>Kosaka, N., Iguchi, H., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNA+in+body+fluid%3A+a+new+potential+biomarker+for+cancer+diagnosis+and+prognosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNA in body fluid: a new potential biomarker for cancer diagnosis and prognosis.</a> Cancer Sci. 101, 2087-2092 (2010).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiles+classify+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiles classify human cancers.</a> Nature. 435, 834-838 (2005).</li>
<li>Shah, A. A., Leidinger, P., Blin, N., Meese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA%3A+small+molecules+as+potential+novel+biomarkers+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">miRNA: small molecules as potential novel biomarkers in cancer.</a> Curr. Med. Chem. 17, 4427-4432 (2010).</li>
<li>Blondal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+sample+and+miRNA+profile+quality+in+serum+and+plasma+or+other+biofluids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Assessing sample and miRNA profile quality in serum and plasma or other biofluids.</a> Methods. 59, 1-6 (2013).</li>
<li>Jensen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+two+commercial+global+miRNA+expression+profiling+platforms+for+detection+of+less+abundant+miRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of two commercial global miRNA expression profiling platforms for detection of less abundant miRNAs.</a> BMC Genomics. 12, 435 (2011).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

מיקרו RNA הוא RNAs noncoding הקטן המווסתים את ביטוי הגנים על ידי עיכוב תרגום ו / או קידום mRNA השפלה 2. בשל היציבות הגבוהה שלהם בתנאים ללא תא, מיקרו RNA שכבר זוהה בנוזלי גוף רבים. יתר על כן, פרופיל ביטוי מובהק של מיקרו RNA כבר בקורלציה עם שלב ו / או התקדמות בסוגים שונים של הסרטן אנושי 3-9. ישנם מספר כלים העומדים לרשות פרופיל מיקרו RNA, כוללים מערכי שבבים קלאסיים או טכנולוגיית הריצוף העמוקה ה...

מיקרו RNA שייך למשפחתו של קטן (21-23 NT באורך) noncoding RNAs המווסתים את ביטוי הגנים שלאחר תעתיק. יכול להיות מופרש מיקרו RNA במרחב תאי שבו הם נראים יציבים יחסית. תוך קביעת שינויים בביטוי מירנה יכולה להיות צעד חשוב לקראת זיהוי של סמנים ביולוגיים, ביצוע פרופילי מירנה וטיפול בכמות גדולה של נתונים עלולים להיות מפחיד. כאן אנו מתארים פרוטוקול כדי לקבוע שינויים בביטוי מירנה בנוזל המוח והשדרה (החלים על נוזלי גוף אחרים) על ידי בזמן אמת רגיש ה-PCR. אנו גם מתארים את השימוש בתוכנות לניתוח נתונים, כוללים ניתוח סטטיסטי וייצוג גרפי של תוצאות. התהליך כולו הוא קל ופשוט יחסית, ותלוי במספר דגימות להיות צדודית ומספר מכונות PCR בזמן אמת זמין, גם מהיר יחסית. החלק הניסיוני דורש דיוק בטיפולרנ&quot;א וpipetting לתוך צלחות 384 גם, ואילו סעיף ניתוח נתונים באמצעות Genex דורש קצת ידע בסיסי באינפורמטיקה ונתונים סטטיסטיים.

<table><tbody><tr><td colspan="4">טבלה 3. רשימת ציוד.</td></tr><tr><td> Finnpipette Novus Multichannel Pipetter </td><td>Thermo Scientific</td><td>HH05279</td><td></td></tr><tr><td> Finntip טיפים לפיפטה </td><td>Thermo Scientific</td><td>9400613</td><td></td></tr><tr><td> Thermal Cycler C1000 </td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0.2 מ"ל פרופיל נמוך, צינורות PCR שקופים </td><td>Biorad</td><td>TLS0801</td><td></td></tr><tr><td> רצועות מכסה שטוח </td><td>Biorad</td><td>TLS0803</td><td></td></tr><tr><td>pLightCycler 480 מערכת PCR בזמן אמת</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 רדיד איטום</td><td>Roche</td><td>04 729 757 001</td><td></td></tr><tr><td> צנטריפוגה מקוררת 5804R </td><td>רוטור דלי נדנדה</td><td></td><td></td></tr><tr><td> p, 4 מקומות </td><td>Eppendorf</td><td>A-4-44</td><td></td></tr><tr><td> bench-top מיני צנטריפוגה </td><td>פישר</td><td>05-090-100</td><td></td></tr><tr><td> מערבולת ספסל </td><td>פישר</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה, מעוקרים </td><td>פישר</td><td>02-681-5</td><td></td></tr><tr><td> מאגר ריאגנט מטריקס, 25 מ"ל </td><td>Thermo Scientific</td><td>8093</td><td></td></tr><tr><td> Thermomixer Confort </td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bench-Top מיני צנטריפוגה סיגמא 1-15</td><td>סיגמא</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bench-Top Vortex </td><td>Velp Scientifica</td><td>F202A0173</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">טבלה 4. רשימת ריאגנטים.</חזק></עמ></td></tr><tr><td> ערכת סינתזה c-DNA אוניברסלית, 16-32 rxns </td><td>Exiqon</td><td>203300</td><td></td></tr><tr><td> SYBR תערובת מאסטר ירוקה, Universal RT, 25 מ"ל </td><td>Exiqon</td><td>203400</td><td></td></tr><tr><td> Ultrapure מים מזוקקים Dnase, Rnase free </td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td> MicroRNA מוכן לשימוש PCR פאנלים אנושיים (I+II) V2.R </td><td>Exiqon</td><td>203608</p</td><><td></td></tr><tr><td>p>mirערכת בידוד miRNA, 40 בידודים</td><td>אמביון</td><td>AM1556</td><td></td></tr><tr><td> MS2 RNA נשא </td><td>Roche Applied Science</td><td> 10165948001</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148-25ml</td><td></td></tr><tr><td> Ethanol 100% </td><td>Carlo Erba</td><td><>p64-17-5</td><td></td></tr><tr><td> nuclease free water </td><td>Qiagen</td><td>1039480</p</td><><td></td></tr><tr><td>p>RNAse Zap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td></td></tr></tbody></table>

נוזל עמוד שדרת microrna פרופיל שימוש כמותי בזמן אמת pcr

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

<html> מיקרו RNA (miRNAs) מהווה שכבה חזקה של ויסות הגנים על ידי המנחה RISC למקד לאתרים הממוקמים על mRNAs וכתוצאה מכך, על ידי ויסות דיכוי translational שלהם. שינויים בביטוי מירנה הוכחו להיות מעורבים בפיתוח של כל המחלות מורכבות הגדולות. יתר על כן, הממצאים אחרונים הראו כי יכול להיות מופרש miRNAs לסביבה תאית ולהיכנס למחזור הדם ונוזלי גוף אחרים שבו הם יכולים להסתובב עם יציבות גבוהה. הפונקציה של miRNAs במחזור כזה נשארה במידה רבה חמקמקה, אבל גישות שיטתיות תפוקה גבוהה, כגון מערכי פרופיל מירנה, יש להוביל לזיהוי של חתימות מירנה בכמה מצבים פתולוגיים, כוללים הפרעות ניווניות ומספר סוגים של סרטן. בהקשר זה, את זיהוי של פרופיל ביטוי מירנה בנוזל השדרה, כפי שדווח במחקר שנערך לאחרונה שלנו, הופך את המועמדים אטרקטיביים miRNAs לניתוח סמן ביולוגי. _content &quot;&gt; ישנם מספר כלים זמינים לאפיון מיקרו RNA, כגון microarrays, כמותיים בזמן אמת PCR (qPCR), ורצף עמוק. כאן אנו מתארים שיטה רגישה לפרופיל מיקרו RNA בנוזלי המוח והשדרה על ידי בזמן אמת PCR כמוני. השתמש בפנלי האדם PCR Exiqon microRNA מוכנים לשימוש I ו-II V2.R, המאפשר זיהוי של מיקרו RNA האנושי 742 הייחודי. ביצענו מערכים בריצות בשלושה עותקים ועבדנו וניתחנו נתונים באמצעות תוכנת Genex המקצועית 5. באמצעות פרוטוקול זה, יש לנו צדודית בהצלחה מיקרו RNA בסוגים שונים של שורות תאים ותאים ראשוניים, CSF, פלזמה, וברקמות מוטבעות פרפין קבוע פורמלין.

תוצאות ממחקר זה כבר פורסמו בעבר 1. איור 1 מציג תוצאות מהניתוח של מיקרו RNA התייחסות המועמד באמצעות יישום geNorm. בהתאם לכך, שני מיקרו RNA, miR-622 ו miR-1266, זוהו כגני התייחסות ושימש לנרמל את ערכי מירנה. לצורך המחקר CSF היו לנו שלוש קבוצות של דגימות: HIV-(n = 10), כוורת (n = 4), ו-HIV + ללא דלקת קרום המוח (HIV +, n = 5). שתי קבוצות, הכוורת וHIV +, הושוו עם ה...

אנו מתארים פרוטוקול של PCR בזמן אמת לפרופיל מיקרו RNA בנוזל המוח והשדרה (CSF). למעט פרוטוקולי מיצוי RNA, ההליך יכול להתארך עד RNA המופק מנוזלים אחרים בגוף, תאים בתרבית, או דגימות רקמה.

נוזל עמוד שדרת MicroRNA פרופיל שימוש כמותי בזמן אמת PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לאפיין microRNAs בנוזל חבירה מוחי באמצעות PCR כמותי ולנתח את הנתונים באמצעות תוכנת Gen X professional. מטרה זו מושגת תחילה על ידי בידוד RNA כולל מדגימות של נוזל חבירה מוחי. השלב השני הוא ביצוע תעתוק הפוך כדי לתעתק את ה-RNAs ל-CDNAs.בשלב הבא, מערבבים את ה-CDNAs עם תערובת מאסטר (master mix) של cyber green בלוחיות בעלות 384 בארות המכילות פריימרים עבור 742 רצפים ייחודיים, ומבצעים הגברה באמצעות real-time PCR. השלב הסופי הוא ניתוח הנתונים שהתקבלו מההגברה בזמן אמת. לבסוף, ניתן להביע את התוצאות כשינוי יחסי (fold change), עלייה או ירידה ביחס לבקרה, ולהציגן במגוון ייצוגים גרפיים.יתרון המפתח של הטכניקה שלנו על פני שיטות קיימות, כגון מערכי שבבים (chip arrays), הוא ששיטתנו רגישה מאוד ודורשת כמות מינימלית של RNAs. בדרך כלל, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקלו בקשיים בשל כמות הנתונים הגדולה המופקת והשימוש בתוכנה לניתוח נתונים. ראשית, רססו את אזור העבודה ואת הפפטים ב-RNA Zap.כדי להתחיל את סינתזת ה-CDNA, דללו את דגימות ה-RNA המשמשות כתבנית לריכוז של 5 ng/µL באמצעות מים נקיים מנוקלאזים. לאחר מכן, הניחו בעדינות את תמיסת התגובה (5x reaction buffer) על קרח להפשרה. לאחר מכן, הוסיפו 40 µL של מים נקיים מנוקלאזים ל-RNA spike in כדי להשעות מחדש את הרכיב, ערבבו את המבחנה במערבל (vor

cerebrospinal-fluid-microrna-profiling-using-quantitative-real-time

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

נדגים את ההתקנה וניתוח של microRNA טרום 96-היטב עבור מערכים QPCR באמצעות רובוט, כמו גם על ידי ביד עם פיפטה מדעי רב מטריקס Thermo.

פרופיל של טרום מיקרו RNAs ו רנ&quot;א באמצעות כמותי בזמן אמת PCR (qPCR) מערכים

כאן אנו מתארים זמנית אופטימיזציה הפוך transcriptase PCR כמותי (qRT-PCR) פרוטוקול בשילוב עם פלטפורמת microfluidic ככלי העלות והזמן תפוקה גבוהה יעיל ההקרנה microRNA (מירנה) רמות הביטוי, במיוחד כאשר עובדים עם כמויות מוגבלות של המדגם.

תפוקה גבוהה פרופיל MicroRNA: Multiplex אופטימליים qRT-PCR בקנה מידה Nanoliter על IFCs דינמי Fluidigm ArrayTM

פולימראז כמותי זמן אמת תגובת שרשרת (QPCR) היא שיטה מהירה רגישה כדי לחקור את רמות הביטוי של microRNA שונים (מירנה) מולקולות דגימות הגידול. שימוש בביטוי זה השיטה של ​​מאות מולקולות שונות מירנה יכול להיות מוגבר, לכמת אותה ולנתח אותה מהתבנית cDNA אותו.

MicroRNA איתור גידולים הערמונית ב כמותי בזמן אמת PCR (QPCR)

Microglia תושב מקרופאגים הם המספקים את השורה הראשונה של מעקב ההגנה החיסונית של מערכת העצבים המרכזית. מיקרו RNA הם מולקולות רגולטוריות כי לשחק תפקיד חשוב בתהליכים פיזיולוגיים רבים, כולל הפעלת והבחנה של מקרופאגים. במאמר זה נתאר את שיטת המדידה של מיקרו RNA ב microglia.

זיהוי של מיקרו RNA ב microglia על ידי Real-time PCR ב CNS רגיל ובמהלך Neuroinflammation

מולקולרי איתות דרך גם אסטרוגן ומייקרו RNA הם קריטיים בהתפתחות סרטן השד וצמיחה. אסטרוגן מפעיל את קולטני האסטרוגן, שהם גורמי שעתוק. גורמי שעתוק רבים יכולים לווסת את הביטוי של מיקרו RNA, והוא יכול להיות צדודית מיקרו RNA מוסדר אסטרוגן תוך שימוש בטכניקות שונות בקנה מידה גדולה.

פרופיל של מיקרו RNA המוסדר אסטרוגן בתאי סרטן השד

מתוך כוונה לאפיין שינויים ב-miRNAs על תאי גזע עצביים אנושיים מובחנים (hNSCs) אנו מתארים התמיינות hNSC במערכת תלת מימדית, הערכת שינויים בביטוי microRNA על ידי מערך miRNA PCR, וניתוח חישובי לחיזוי יעד miRNA ואימותו על ידי בדיקת לוציפראז כפולה.

בידול של קו תאי גזע עצבי אדם בשלוש תרבויות ממדים, גני ניתוח של MicroRNA והמשוער יעד

מיקרו-רנ"א במחזור צמחו לאחרונה כסמנים ביולוגיים מבטיחים וחדשניים לסוגי הסרטן שונים ולמחלות אחרות. המטרה של מאמר זה היא לדון בשלוש פלטפורמות שונות המבוסס על בדיקה בזמן אמת PCR ושיטות שאינן זמינים לכמת ולקבוע את השפע של מיקרו-רנ"א במחזור.

בזמן אמת המבוסס על הבדיקה PCR גישות למדידת כמותית של מיקרו-רנ&quot;א

מתוארת שיטה רגישה ומדויקת לכימות מיקרו-רנ"א נטול תאים באמצעות כימיה מבוססת צבע וטכנולוגיית PCR דיגיטלית טיפות.

במחזור כימות MicroRNA שימוש DNA מחייבת כימיה דיי PCR דיגיטלי אגל

כאן אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי ביטוי microRNA ב קרום עכברוש עכברוש באמצעות כמותי בזמן אמת הפוכה תעתיק התגובה שרשרת פולימראז. שיטה זו מתאימה ללימוד פרופיל הביטוי microRNA בקרום עכברוש עכברוש במספר תנאים פתולוגיים.

איתור הביטוי microRNA בממברנה פריטוניאלית של חולדות באמצעות כמותי בזמן אמת PCR

הדו ח מתאר פרוטוקול למדידת ברמות המוחלטות miRNA פלזמה, באמצעות שעתוק במהופך בזמן אמת PCR כמותי עם או בלי הגברה מראש. פרוטוקול זה מאפשר הבנה טובה יותר של כמות פלזמה miRNAs ומאפשר הערכה איכותית של נתונים התואמים מחקרים שונים או מעבדות.

כימות מוחלטת של פלזמה רמות MicroRNA בקופים Cynomolgus, באמצעות שעתוק במהופך בזמן אמת PCR כמותי

למד פרופיל microRNA בנוזל עמוד השדרה באמצעות PCR כמותי בזמן אמת. השיטה מאפשרת ניתוח של 742 רצפים ייחודיים ומסייעת בחקר מנגנונים נוירוביולוגיים ובאבחון מצבים נוירולוגיים.

נוזל עמוד שדרת MicroRNA פרופיל שימוש כמותי בזמן אמת PCR

גלה סרטונים נוספים