נוזל עמוד שדרת MicroRNA פרופיל שימוש כמותי בזמן אמת PCR

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור פרופיל מיקרו-RNA בנוזלי עמוד השדרה המוחיים על ידי PCR כמותי ולנתח את הנתונים באמצעות תוכנה מקצועית Gen X. זה מושג על ידי בידוד RNA כולל מדגימות נוזל עמוד השדרה המוחיות. השלב השני הוא לבצע שעתוק הפוך על מנת לתמלל את ה-RNA ל-CDNA.

לאחר מכן, ה-CDNAs מעורבבים עם תערובת מאסטר ירוקה סייבר נטענת ב-384 לוחות באר המכילים פריימרים ל-742 רצפים ייחודיים ומוגברים באמצעות PCR בזמן אמת. השלב האחרון הוא ניתוח הנתונים המתקבלים מההגברה בזמן אמת. בסופו של דבר, ניתן לבטא את התוצאות כשינוי קיפול, עלייה או הקטנה על פני בקרה, ולהמחיש אותן בייצוגים גרפיים שונים.

אז היתרון העיקרי של הטכניקה שלנו על פני שיטות קיימות כמו מערכי שבבים הוא שהשיטה שלנו רגישה מאוד ודורשת כמות מינימלית של RNA. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בגלל כמות הנתונים הגבוהה שנוצרה והשימוש בתוכנה לניתוח נתונים. ראשית, יש לרסס את אזור העבודה והפיפטות ב- RNA Zap.

כדי להתחיל, סינתזת CDNA מדללת את דגימות ה-RNA של התבנית לריכוז של חמישה ננוגרם למיקרוליטר עם מים ללא נוקלאז. לאחר מכן, הנח בעדינות את מאגר התגובה פי חמש על קרח להפשרה. לאחר מכן הוסיפו 40 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז ל-RNA כדי להשעות מחדש את המגיב, מערבלו את הצינור והשאירו אותו על קרח למשך 15 עד 20 דקות.

לאחר מכן, הוציאו את האנזימים מהמקפיא, העבירו את הצינורות והניחו אותם על קרח. כמו כן, לאחר שכל הריאגנטים הפשירו, סובב אותם במהירות. הכן תמיסת עבודה של טרנסקריפטאז הפוך בשפופרת eph של 1.5 מיליליטר על ידי הוספת אנזים חיץ תגובה פי חמישה.

מערבבים מים נטולי נוקלאז וספייק RNA בתבנית באמצעות הפרופורציות המצוינות בטבלה הראשונה. לאחר מכן, מערבבים את תמיסת העבודה על ידי מערבולת למשך שנייה עד שתיים במהירות מרבית. סובב בקצרה את התמיסה למשך 10 שניות, ולאחר מכן חלק את תמיסת העבודה לצינורות PCR נטולי נוקלאז.

לאחר מכן הוסף את התבנית RNA ישירות לצינורות ה-PCR. מערבב בעדינות את התגובה למשך שנייה עד שתיים כדי להבטיח שכל הריאגנטים מעורבבים היטב וסובבו את הצינורות למשך 10 שניות. הנח את הדגימה במכונת ה-PCR והזן את ההגדרות המוצגות כאן.

לאחר מכן התחל את התוכנית לאחר תמלול רטרו. ה-CDNA מוכן להגברת PCR בזמן אמת וניתן לאחסן אותו בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס עד חמישה שבועות. כדי להתחיל בהגברת PCR בזמן אמת, הנח תחילה את ה-CDNA ואת תערובת המאסטר PCR על קרח.

כדי להפשיר הגן על בקבוקוני התערובת הראשיים של PCR מפני אור על ידי כיסויים בנייר אלומיניום בזמן ההפשרה. לאחר הפשרת המערבולת, ערבוב המאסטר PCR למשך שנייה עד שתיים. לאחר מכן, שלב 2000 מיקרוליטר של שני תערובת מאסטר XPCR ו-1,980 מיקרוליטר מים בצינור חרוטי של 15 מיליליטר.

הוסף 20 מיקרוליטר של ה-CDNA לתערובת ומערבב בעדינות את התמיסות למשך שנייה עד שתיים. לאחר מכן סובבו את התמיסות בצנטריפוגה מקוררת בטמפרטורה של 1, 500 פעמים G למשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הנח את תערובת תגובת ה-PCR למאגר פיפטה רב-ערוצי.

סובב בקצרה את הצלחות המוכנות לשימוש בצנטריפוגה מקוררת ב -1, 500 פעמים G לפני הסרת אטם הצלחת. לאחר מכן חלקו 10 מיקרוליטר מתערובת המאסטר PCR המכילה CD NA לכל באר של צלחת 384 בארות. בעזרת פיפטה 16 תעלות ואטום את הצלחת בסרט איטום אופטי.

לאחר הוספת תערובת המאסטר, סובב בקצרה את הצלחת בצנטריפוגה מקוררת ב -1, 500 פעמים G כדי למשוך את התמיסה לתחתית הבארות. מערבבים את הדגימות ומסירים בועות אוויר כדי להשהות את הניסוי. בשלב זה, אחסן את התגובות באזור מוגן מאור בארבע מעלות צלזיוס עד 24 שעות.

לאחר מכן, בצע ניתוח עקומת התכה והגברת PCR בזמן אמת בהתאם לפרמטרים המפורטים בטבלה השנייה. כדי להתחיל בניתוח, בחר בשיטת ניתוח הנגזרת השנייה במחזור האור של רוש. לאחר מכן חשב את מחזור הכימות או ערכי CQ.

ייצא את הנתונים כטבלה ושמור אותם כקובץ טקסט. לאחר מכן, ייבא את הנתונים ל-Gen X על ידי לחיצה ראשונה על כפתור אשף הייבוא של gon ולאחר מכן לחיצה על התחל בחלון הבא, בחר את קבצי הפורמט של המכשיר ופריסת הצלחת. ניתן להוריד קבצי אקסל של פריסת צלחות מאתר GON.

לאחר מכן ייבא את החלונית הראשונה ולחץ על הבא. הטבלה שנוצרה לאחר ייבוא הקובץ מכילה עמודות מוגדרות מראש, עריכת שמות לדוגמה והוספה או הסרה של עמודות סיווג בשלב זה. לחץ על הבא כשתסיים ושמור את הנתונים.

לאחר מכן טען אותו לעורך הנתונים ראשית, כייל את הנתונים בין הלוחות על ידי בחירת כיול INTERPLATE מתפריט העיבוד המקדים כדי להבטיח שכל הלוחות מחושבים באמצעות אותם פרמטרים. לאחר מכן, הגדר ערך חיתוך שישליך נתונים גבוהים ממחזור הסף או ct. אם למיקרו RNA יש CT גדול יותר עבור העתק אחד מתוך שלושה, קריאה זו תוחלף בממוצע ה-CT משתי הבדיקות האחרות.

הגדר גני ייחוס על ידי בחירת רשימה של מיקרו-רנ"א בעלי ערכי CQ דומים בכל הדגימות והפעלת נורמה גנטית. לאחר מכן, נרמל את הנתונים באמצעות גני הייחוס המתקבלים. הערכים המתקבלים יתאימו לדלתא ct.

הסר עמודות ריקות וכמעט ריקות על-ידי פתיחת חלון העיבוד המקדים ובחירה באפשרות אמת גיליון ולאחר מכן בחירה באפשרות החל בשורה הסר עמודות ריקות בשורה שלהלן. בחר את האחוז הרצוי של נתונים תקפים ולחץ על החל. בחר 100%אם ברצונך להשוות רק microRNA המשותפים לכל הדגימות.

טען את קובץ ה-MDF הסופי ל-Gen X ופתח את מנהל הנתונים כדי לסווג אשכול ולדמיין מיקרו-RNA ודגימות על מפות חום וגרמים של דנדרו. לאחר מכן בחר וצור קבוצות של דוגמאות ולחץ על Apply כשתסיים. לאחר מכן, בחלון לוח הבקרה, לחץ על הפעל.

שמור את מפת החום בפורמט הרצוי כגון TIFF או מפת סיביות, ולאחר מכן העתק ושנה את מפת החום לפי הצורך. סרגל גרפי זה התקבל מיישום הנורמה G בתוך Gen X כדי לנתח 10 גנים אפשריים של מיקרו RNA. תוצאות אלה מצביעות על כך ש-MIR 622 ו-MI 1, 266 הם המיקרו-רנ"א המתבטאים בצורה היציבה ביותר.

תרשים הקופסה המוצג כאן מציג את התפלגות הנתונים עבור כל אחד מ-11 מיקרו-רנ"א מובהקים סטטיסטית בתוך הקבוצות של HIVE ו-HIV פלוס ללא דלקת המוח. בכל עמודה, העלילה מציינת את הרבעון החציוני והראשון והשלישי, יחד עם ערכי המקסימום והמינימום. לאחר הליך זה, ניתן לבצע פרופיל מינרלי על כל נוזלי גוף, דגימות רקמה ותאים מתורבתים.