Name: ציור כרומוזום דו מימדי ותלות מימדי אצל יתושים מלריה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-06T17:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: למד שיטת צביעת כרומוזומים בדו-מימד ובתלת-מימד ביתושי מלריה באמצעות FISH ומיקרו-ניתוח לייזר. טכניקה זו מאפשרת הדמיה מדויקת של אזורי כרומוזומים ללא צורך בידע מוקדם ברצף.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המענק של המכונים הלאומיים לבריאות 1R21AI094289 לאיגור נ' שרקוב

1) הכנת מגלשת כרומוזום פוליטן ללכידת לייזר מיקרו-דיסקציה
<ol><li>לנתח נקבות Anopheles חצי gravid ב 25 שעות לאחר האכלת הדם. לתקן שחלות מכחמש נקבות לתוך 500 μl של פתרון קרנוי שונה טרי (100% מתנול: חומצה אצטית קרחונית, 3:1) בטמפרטורת החדר במשך 24 שעות. העבר שחלות ל-20 °C (69 °F) לאחסון לטווח ארוך.</li>
	<li>הכינו את הפתרון של Carnoy (100% אתנול: חומצה אצטית קרחונית, 3:1) וחומצה פרופיונית 50% ממש לפני הכנת שקופיות כרומוזום.</li>
	<li>מניחים זוג אחד של שחלות בטיפה אחת של הפתרון של קרנוי על שקופית קרום Zeiss 1.0 PET. בהתאם לגודל, לפצל את השחלות לתוך כ 2-4 חלקים עם מחטים לנתח ומניחים אותם לתוך טיפה של 50% חומצה propionic על שקופיות נקיות תחת מיקרוסקופ ניתוח.</li>
	<li>יש להפריד זקיקים ולהסיר את הרקמה הנותרת באמצעות מגבת נייר תחת סטריאומיקרוסקופ ניתוק. מוסיפים טיפה חדשה של 50% חומצה פרופיונית לזקיקים ומאפשרים להם לשבת במשך 3-5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מניחים כיסוי סיליקון על גבי הטיפה. תן לשקופית לעמוד כדקה.</li>
	<li>מכסים את השקופית בחומר סופג (נייר סינון משמש לשיטה זו), ותוך שימוש בצד המחק של עיפרון, יש להפעיל כמות נדיבה של לחץ על העטיפה על ידי הקשה עליה שוב ושוב עם המחק.</li>
	<li>מחממים את השקופית ל 60 °C (60 °F) על מערכת denaturation / הכלאה שקופית במשך 15-20 דקות כדי לסייע בשיטוח כרומוזומי פוליטן. מניחים שקופיות לתוך תא לח ב 4 מעלות צלזיוס לילה כדי לאפשר לחומצה עוד יותר לשטח כרומוזומים.</li>
	<li>מניחים שקופיות קר 50% אתנול במשך 10 דקות. מוציאים בעדינות את הכיסוי, ומחליפים בקור 50% אתנול למשך 10 דקות נוספות.</li>
	<li>לייבש שקופיות ב 70%, 90%, 100% אתנול במשך 5 דקות כל אחד. מגלשות יבשות באוויר.</li>
	<li>הכן פתרון של פתרון מאגר GURR על-ידי הוספת טבליית חיץ אחת ל- 1 L של מים מזוקקים. מובלעת אוטומטית.</li>
	<li>הכינו את פתרון Giemsa על ידי הוספת 1 מ"ל של פתרון כתמי Giemsa ל 50 מ"ל של מאגר GURR.</li>
	<li>מניחים מגלשות מיובשות באוויר בתמיסת Giemsa למשך 10 דקות ושוטפים שלוש פעמים ב- PBS 1X. אוויר יבש מחליק שוב באקלים סטרילי מבוקר כדי למנוע זיהום.</li>
</ol>2) לייזר ללכוד מיקרו-דיסקציה של זרוע כרומוזום פוליטן יחיד
סעיף זה מפרט את השימוש בתוכנת PALMRobo, אשר מגיע עם מערכת מיקרודיסציה לייזר PALM MicroBeam. 
<ol><li>נקה את המיקרוסקופ עם 100% אתנול. לעקר כפפות וצינורות עם אור UV ב- UV-crosslinker.</li>
	<li>הפעל את מיקרוסקופ המיקרו-דיסקציה של PALM MicroBeam Laser בלייזר והפעל את הלייזר. פתח את חבילת ניתוח הלייזר PALMRobo וקבע את התצורה של הגדרות "צריכת חשמל" ו"מיקוד" לפי הצורך.</li>
	<li>חפש זרוע כרומוזום פוליטן של עניין.</li>
	<li>בעזרת הכלי עיפרון, חלוקה לרמות של האזור הנבחר.</li>
	<li>פתח את "חלון האלמנטים" מתוך שורת התפריטים.</li>
	<li>בחר את "הרכיב המצויר", ודא שבחרת באפשרות "גזור".</li>
	<li>התקן את צינור כובע דבק לתוך המחזיק ומניחים מעל המגלשה, משאיר רווח קטן <1 מ"מ בגודל, ולהתחיל לחתוך את הלייזר.</li>
	<li>הנח את "בחירת מעוט" בתוך האתר לחתוך, משאיר רווח בין הקצה הכרומוזום.</li>
	<li>בחר "LPC" מהאפשרות הנפתחת והתחל בליסטראות.</li>
	<li>בדוק כדי לוודא שהדגימה הוכנסה למכסה על-ידי לחיצה על סמל "עין".</li>
</ol>3) טיהור הדנ"א מזרוע כרומוזום פוליטנית מיקרו-דיסקית אחת
בצע את ההוראות של ערכת מיקרו DNA QIAamp לשחרר ולטהר את ה-DNA שנאסף. שלב 3.1 שונה כדי להתאים לצינור ההפוך. 
<ol><li>הוסף 15 μl מאגר ATL ו 10 μl proteinase K לצינור הפוך (בתוך הכובע) ואת הדגירה ב 56 °C (69 °F) במשך 3 שעות.</li>
	<li>הוסף 25 μl מאגר ATL, 50 μl מאגר AL, ו RNA נשא 1 μl; תערובת. להוסיף 50 μl 100% EtOH; לערבב.</li>
	<li>העבר lysate לעמודה QIAamp; צנטריפוגה, צנטריפוגה. לשטוף על ידי הוספת 500 μl מאגר AW1; צנטריפוגה, צנטריפוגה. מקם עמודה לתוך צינור אוסף חדש, להוסיף 500 μl מאגר AW2; צנטריפוגה, צנטריפוגה. מניחים את העמודה לתוך צינור חדש; צנטריפוגה להסרת נוזלים עודפים.</li>
	<li>מניחים את העמודה לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 μl ומוסיפים 20 μl של מים כדי elute; צנטריפוגה, צנטריפוגה.</li>
	<li>לאדות DNA מרומם טרי עד נפח סופי של 9 μl באמצעות ואקום.</li>
</ol>4) הגברה של דנ"א מזרוע כרומוזום פוליטנית מיקרו-דיסקית אחת
שני פרוטוקולים שונים שימשו עבור WGA של זרוע כרומוזום אחת. 
<ol><li>הגברה של דנ"א והכנת בדיקה באמצעות גנוםפלקס WGA<ol>
<li>בצע את פרוטוקול ערכת WGA4 תא יחיד GenomePlex כדי לייצר את האצווה הראשונה של DNA מוגבר:<ol>
<li>הוסף פתרון חלבון K שהוכן טרי לדגימה של 9 μl; לערבב. דגירה DNA ב 50 מעלות צלזיוס במשך 1 שעה, ולאחר מכן לחמם ל 99 מעלות צלזיוס במשך 4 דקות. שמור על קרח.</li>
			<li>הוסף 2 μl 1X מאגר הכנה לספריית תא יחיד ו 1 מיקרומטר של פתרון ייצוב ספריה; מערבבים. מחממים דגימה ל-95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. מצננים על קרח וצנטריפוגה.</li>
			<li>הוסף 1 μl של אנזים הכנת ספרייה; לערבב וצנטריפוגה. דגירה כדלקמן: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq1.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
			<li>הוסף 7.5 μl 10X הגברה מאסטר לערבב, 48.5 μl מים. 5.0 μl WGA DNA פולימראז; לערבב וצנטריפוגה.</li>
			<li>תרמוציקל כדלקמן: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq2.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
		</ol>
</li>
		<li>לטהר DNA באמצעות DNA גנומי נקי &amp Concentrator קיט. הפרוטוקול הוא כדלקמן:<ol>
<li>הוסף 5:1 מאגר מחייב DNA:דגימת DNA (במיוחד עבור DNA גנומי של פחות מ 2 kb. אם הדנ"א לדוגמה גדול מ- 2 kb, השתמש ביחס של 2:1) והעבר לעמודת הסיבוב שסופקה. צנטריפוגה, צנטריפוגה.</li>
			<li>מוסיפים 200 מיקרוגרם DNA לשטוף מאגר צנטריפוגה. חזור על שלב הכביסה. לאחר מכן, מוסיפים 50 μl של מים ו elute ה-DNA לתוך צינור חדש 1.5 מ"ל.</li>
		</ol>
</li>
		<li>הגבר מחדש את הדנ"א לדוגמה באמצעות ערכת ההטמימות GenomePlex WGA3 באופן הבא:<ol>
<li>הוסף 10 μl DNA לצינור PCR (הערכה ממליצה 10 ng הכולל של DNA) עם 49.5 μl מים, 7.5 μl 10x הגברה מאסטר לערבב, 3.0 μl 10 מ"מ DNTP לערבב, ו 5.0 μl WGA DNA פולימראז. מערבבים וצנטריפוגה.</li>
			<li>השתמש בפרופיל הבא לתגובה: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq3.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
			<li>אחסן דנ"א ב-20°C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>סמן דנ"א עבור FISH באמצעות ערכת ההטמנה מחדש של GenomePlex WGA3 כדלקמן:<ol>
<li>צור תערובת הורים מערכת תב"ע של GenomePlex WGA3 על-ידי הוספת דנ"א של 10 מיקרומטר לצינור PCR עם מים של 49.5 מיקרול, 7.5 μl 10X הגברה מאסטר לערבב, 3.0 μl 1 מ"מ dNTP לערבב (1 מ"ל של dATP, dCTP, dGTP, 0.3 μl 1 mM dTTP - אם באמצעות dUTP שכותרתו), 1 מיקרומטר של 25 nM שכותרתו dUTPP ו-5.0 מיקרוגרם פולימראז דנ"א WGA.</li>
			<li>השתמש בפרופיל הבא לתגובה: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq3.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
			<li>אתנול לזרז את הבדיקה שכותרתו על ידי הוספת 1/10 נפח התגובה הסופי (7.5 μl עבור 75 μl תגובה) של 3 M נתרן אצט pH 5.2 ו 2-3 כמויות של 100% אתנול. דגימת דנ"א צוננת ב-80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות.</li>
			<li>מדגם צנטריפוגה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי ליצור גלולה שכותרתו ולהסיר גלולה supernatant ואוויר יבש.</li>
			<li>צור מאגר הכלאה באופן הבא: 0.2 גר' דקסטרן סולפט 1200 μl פורממיד דהוי 580 μl H2O 120 μl 20X SSC</li>
			<li>הוסף 40 μl של חיץ הכלאה לכדור מיובש באוויר.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>הגברה DNA והכנת בדיקה באמצעות REPLI-G תא יחיד WGA ואחריו ניק-תרגום<ol>
<li>פעל לפי פרוטוקול ערכת WGA של תא יחיד של REPLI-g כדי להפיק את ה- DNA המוגבר:<ol>
<li>הכן מאגר D2 (3 מיקרומטר של 1 M DTT + 33 μl מאגר DLB).</li>
			<li>יש לערבב 4 מיקרו-μl של חומר מטוהר עם 3 מיקרול Buffer D2. צינור פליק לערבב. דגירה במשך 10 דקות ב 65 מעלות צלזיוס. הוסף 3 μl של פתרון עצירה; לערבב.</li>
			<li>הוסף 9 μl H2O, 29 μl REPLI-g מאגר תגובה, ו 2 μl של פולימראז DNA REPLI-g לדגימה. דגירה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 8 שעות. להשבית פולימראז DNA על ידי חימום ל 65 °C (65 °F) במשך 3 דקות. אחסן דנ"א ב-20°C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>פעל בהתאם לפרוטוקול התרגום של nick כדי לתייג את ה- DNA המוגבר של REPLI-g:<ol>
<li>הכן את תערובת התיוג הבאה: 1 מיקרוגרם של DNA מוגבר מאגר פולימראז DNA 5 μl 10X 5 μl 10X dNTP 5 מיקרול 1X BSA 1 μl 1 מ"מ עם תווית dNTP 4 μl 1 U / μl DNase I 1 μl 10 U / μl DNA פולימראז אני H2O עד 50 μl</li>
			<li>דגירה ב 15 מעלות צלזיוס במשך 2 שעות. הוסף 2 μl של 0.5 M EDTA כדי לעצור את התגובה. בדוק את גודל שבר הדנ"א על ידי ריצה על ג'ל.</li>
			<li>בצע את השלבים מ 4.1.4.3-4.1.4.6 כדי לזרז ולזלול גלולה.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>5) דגים דו-מימדיים על תכשירי דלעת פוליטנית וכרומוזום מיטוטי
אנא עיינו בפרוטוקולים מפורטים עבור FISH על הכנות של דלעת פוליטן 47 ומגלשות כרומוזום מיטוטי 48. כאן אנו מספקים פרוטוקולים קצרים.
<ol><li>דגים על תכשירי דלעת כרומוזום פוליטן<ol>
<li>לטבול שקופיות 1X PBS במשך 20 דקות ב RT. לתקן שקופיות ב 4% Paraformaldehyde ב 1X PBS במשך דקה אחת.</li>
		<li>התייבש שקופיות דרך שטיפות אתנול: 50%, 70%, 90%, 100% במשך 5 דקות כל אחד ב RT. שקופיות יבשות אוויר.</li>
		<li>מחממים את החללית במאגר הכלאה ב 37 °C (69 °F). הוסף 10-20 μl של בדיקה להחליק. מכסים בכיסויים של 22 X 22 מ"מ. לחץ החוצה כל בועות אוויר באמצעות קצה פיפטה.</li>
		<li>כרומוזומי דנאטורה ובדיקה ב 90 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. חותם קצוות של כיסוי עם מלט גומי. מעבירים את השקופית לתא לח ומדגדגים ב-39 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
		<li>לשטוף את השקופיות עם 1X SSC ב 39 °C (69 °F) במשך 20 דקות. לשטוף את השקופיות עם 1X SSC ב RT במשך 20 דקות. שטפו שקופיות ב- 1X PBS ולאחר מכן הוסיפו את האפשרות 'התארך נגד עמעום' באמצעות DAPI. מכסים עם כיסוי, ומאחסנים בתיבת שקופיות ב- 4 °C (60 °F) למשך שעה לפחות לפני הפריט החזותי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>FISH על הכנות דלעת כרומוזום מיטוטי<ol>
<li>לחלץ כרומוזומים מיטוטיים מדיסקים דמיוניים של זחל 4כוכבים של An. gambiae.</li>
		<li>הכינו מגלשות כרומוזום המתאימות ל-FISH.</li>
		<li>הוסף 2-3 μl של בדיקה DNA שכותרתו למאגר הכלאה בצינור ומערבבים בעדינות על ידי pipetting.</li>
		<li>החל 10 μl של תערובת בדיקה על השקופית לכסות עם כיסוי 22 X 22 מ"מ. לחץ החוצה כל בועות אוויר באמצעות קצה פיפטה.</li>
		<li>לשיוך וזיהוי נגדיים, יש למרוח את האנטי-עמעום עם DAPI על ההכנה ולשמור בחושך לפחות שעה לפני הפריט החזותי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6) דגים תלת מימדיים על רקמת שחלות הר שלם
<ol><li>הכן את השילוב הבא של מאגר A: 60 מ"מ KCl 15 מ"מ NaCl 0.5 מ"מ זרע 0.15 מ"מ זרע 2 מ"מ אדטה 0.5 מ"מ אגטה 15 מ"מ צינורות</li>
	<li>הכן שקופיות להדמיה גרעינית על-ידי הוספת שכבה של nailpolish בתבנית מרובעת כדי להתאים לגודל של המכבסות. זה יוצר משטח מוגבה כדי למנוע מעוך של גרעינים בעת הנחת על כריכה בעתיד.</li>
	<li>לנתח שחלות טריות מן השלב של כריסטופר 3 נקבות ולשמור על פתרון של 150-250 μl Buffer A עם 0.5% דיגיטונין. הפעל מחט ניתוח גדולה יותר על זקיקים (בצינור עם חוצץ A עם 0.5% דיגיטונין) כדי להרוס קרום זקיקי.</li>
	<li>וורטקס במשך 5-10 דקות כדי להפריע עוד יותר זקיקים. לגרד את כל חתיכות זקיק גדול צינור צנטריפוגה במשך 30 שניות בהגדרה הנמוכה ביותר של ~ 500 מהפכות לדקה (סל"ד). להעביר supernatant לצינור חדש 2 מיליליטר Eppendorf, ולהוסיף 100 μl של חוצץ A. חזור על שלב 6.3 בין 5-7 פעמים, עד הרקמה הגלויה מחולק חלקיקים קטנים.</li>
	<li>לסובב את שני הצינורות במשך 10 דקות ב 2,000 סל"ד. השלך על טבעי בשני הצינורות. הערה: שני הצינורות ישמשו להכנת שקופיות הדמיה גרעינית סופית. הצינור עם supernatant שנאסף צריך להכיל בעיקר גרעינים שחולצו, בעוד הצינור המקורי עם רקמה יכיל תערובת של רקמה וגרעינים מוטבע בתאי האחות. הוסף 200 μl של חוצץ A – 0.1% טריטון דגירה לילה ב 4 °C (69 °F). צנטריפוגה 5 דקות ב 10,000 סל"ד (10,621 x G) ולהסיר supernatant.</li>
	<li>הוסף 200 μl 4% Paraformaldehyde ב- PBS. דגירה בתרמומקסר במשך 30 דקות, ערבוב ב 450 סל"ד. צנטריפוגה 5 דקות ב 5,000 סל"ד (2,655 x G) ולהסיר supernatant. לשטוף עם חוצץ A עם 0.1% טריטון במשך 5 דקות, ערבוב ב 450 סל"ד תרמומיקסר. צנטריפוגה 5 דקות ב 5,000 סל"ד (2,655 G) ולהסיר supernatant.</li>
	<li>הוסף מראש מחומם ב 37 מעלות צלזיוס שכותרתו בדיקה לצינור. דנאטורה ב 95 °C (60 °F) בתרמומיקסר, ערבוב ב 450 סל"ד, במשך 10 דקות. המשך denaturation ב 80 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות עם ערבוב מתמשך. דגירה ב 37 °C (69 °F) ב thermomixer, עם 450 סל"ד ערבוב לילה. צנטריפוגה 5 דקות ב 5,000 סל"ד (2,655 x G). הסר על-טבעי.</li>
	<li>לשטוף עם חוצץ A עם 0.1% טריטון במשך 5 דקות. צנטריפוגה 5 דקות ב 5,000 סל"ד (2,655 x G). חזור על הפעולה פעמיים. החל טיפה של התארכות נגד עמעום באמצעות DAPI.</li>
	<li>צנרת החוצה גרעיני / DAPI פתרון בזהירות (הימנעות בועות), להחיל על שקופית, לכסות עם coverlip.</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ישנם שלבים רבים קריטיים כדי להגביר בהצלחה את ה-DNA מדגימות כרומוזום פוליטן microdissected. הפרוטוקול משתמש בשימוש ב- LCM, שיטה הן מגבירה את היעילות הכוללת ומפחיתה את החשיפה לדנ"א זר על ידי הסרת האינטראקציה של כלים פיזיים עם הדגימה. עם זאת, הגברה של דנ"א זר היא עדיין המלכודת הפוטנציאלית הגדולה ביותר של ניסוי זה. לכן, במהלך כל התהליך, זה חיוני כדי לשמור על הדגימות מוגנות מפני זיהום. לאורך כל הכנת שקופית ושלבי microdissection, זה חיוני כדי לשטוף אתנול מחטי דיסקציה, שקופיות, לכסות מעידות, כמו גם את סביבת העבודה.  מומלץ גם UV לטפל בכל הציוד הישים (מחטים, שקופיות, coverslips) לפני השימוש.
הממברנה על שקופיות הניתוח מקשה מאוד על התפשטות הכרומוזומים.  חשוב להשתמש יותר של השחלה (חצי לזוג מלא של שחלות) בעת ביצוע שקופיות אלה, כדי לספק סיכוי גדול יותר למצוא גרעין התפשטות היטב.  מומלץ גם להשתמש ברקמה טרייה בעת ביצוע שקופיות, כמו שיעורי הגברה נראה לרדת כמו רקמות גיל 49 והתפשטות כרומוזום הופך להיות מאתגר יותר.  הכנת שקופיות עבור microdissection הוא הצעד זמן רב ביותר בפרוטוקול זה.  כרומוזומים חייבים להתפשט היטב כדי למנוע רכישה בשוגג של חומר לא רצוי.  כתמי Giemsa מאפשרים למשתמש לבדוק את איכות ההתפשטות באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה לפני השימוש במערכת המיקרו-דיסקציה.
השילוב של מיקרו-דיסקציה והגברה מספק את ההזדמנות לחלץ ולנתח שברים כרומוזומליים בגודלם מאזורים קטנים בעלי עניין לרוב הזרועות.  פרוטוקול זה מאפשר למשתמש להשיג דנ"א מאזורים שונים מבחינה מורפולוגית כגון היפוכים, רצועות אוכרומטיות ספציפיות וסרטים בין-דוריים, הטרוכרומטין טלומרי, סנטימטרי ובין-כוכבי. המשתמש יכול ליישם את בדיקות הציור שנוצרו כדי לבחון כרומוזומים חריגים, לחקור הומולוגיה בין מינים בלוקוסים מסוימים, או לאפיין ארגון מרחבי של כרומוזומים בגרעין תלת מימד שלם. לפיתוח צבעי כרומוזום, בחרנו מקטעים אוכרומטיים כדי למנוע הכלאה של דנ"א חוזר עם אזורים כרומוזומליים מרובים. כתוצאה מכך, השגנו ציור ספציפי לזרוע מבלי להשתמש במתחרה, כמו דנ"א גנומי כולל או שבר DNA C0t-1.
בחרנו להשתמש בערכות GenomePlex WGA ו- REPLI-G בהתבסס על ביקורות שהשוו את יעילות ושיעור הנשירה של ערכות הגברה מרובות 40,44.  שתי הערכות ביצעו את הטוב ביותר מבין השיטות הזמינות בשני שיעור הנושרים (GenomePlex היה שיעור של 12.5% לעומת 37.5% של REPLI-g%) ואחוז הסמנים המוגברים (ל-GenomePlex היה שיעור הגברה של 45.24% לעומת 30.0% של REPLI-g). 40. ערכת GenomePlex סיפקה גם כמות גבוהה יותר של DNA, ובכך הפכה אותה למועמדת טובה יותר לטכניקות מרובות במורד הזרם.  ערכת הגברה מחדש למערכת GenomePlex זמינה גם היא, ומאפשרת הגברה נוספת של הדנ"א. עם זאת, חשוב לציין כי הגברה אינה מושלמת.  האפשרות נשארת כי הגברה מוצלחת יכולה להציג שגיאות או יש הטיה כלפי loci ספציפי ב- DNA היעד. חשוב לקחת בחשבון את גודל הקטע הסופי של שיטות הגברה הגנום הזמינות.  פיצול GenomePlex גורם לספריה עם שברים הנעים בין 200-500 bp, בעוד שערכת REPLI-g מייצרת שברים בגודל של כ- 10-20 kb. היישום המיועד במורד הזרם של פרוטוקול זה הוא FISH, ובכך להפוך את ערכת GenomePlex אפשרות אפשרית יותר, כפי שהוא סיפק את גודל הקטע הרצוי ואת היכולת לתייג שברי DNA ישירות דרך WGA. מולקולות דנ"א ארוכות המיוצרות על ידי הגברה REPLI-g חייב להיות מקוטע בתגובת תיוג ניק-תרגום במורד הזרם.
פרוטוקול זה הותאם כדי להגביר בהצלחה את הדנ"א מזרוע כרומוזום פוליטן אחת.  פרוטוקולים אחרים דורשים איגום של שברי כרומוזום רבים (בדרך כלל 10-30) כדי להגביר בהצלחה את המדגם 7,11,28,40.  למרות איגום של כרומוזומים מרובים אפשרי בשיטה שלנו, הסבירות המוגברת של זיהום מדגם מדגיש את החשיבות של תחילת הניסוי עם כמה שפחות כרומוזומים. אם כרומוזומי פוליטן אינם זמינים, הפרוטוקול שלנו יכול להיות מותאם לשימוש בכרומוזומים מיטוטיים. עם זאת, ייתכן שיהיה צורך בריכה 10-15 כרומוזומים מיטוטיים לפני הגברה עבור דגים מוצלחים 11. הטיית הגברה נמוכה יותר עם כמויות גבוהות של DNA תבנית התחלתית 50. כרומוזומי פוליטן מספקים כ-512 עותקים של רצף דנ"א יחיד ו-1024 עותקים של שני רצפי דנ"א הומולוגיים.  לכן, איגום כרומוזומים מיטוטיים יעזור להגדיל את האיכות הכוללת של מוצר DNA לאחר הגברה.
הליך זה יש שימושים פוטנציאליים רבים במחקרים ציטוגנטיים וגנומיים. כאן, השתמשנו בצבעי כרומוזום כדי לבסס את ההתאמה בין קטעים אוכרומטיים של זרועות פוליטן וכרומוזום מיטוטי ב An. gambiae. ניתן להחיל את אותן בדיקות ציור על אפיון ציטוגנטי של קווי התא של א. גמביה. סידורים גנומיים נרחבים ושינויים במספרי הכרומוזום הם מאפיינים נפוצים של קווי תאים 51,52. סידורים מחדש של כלנית, פוליפלוידיה וכרומוזומליים כגון טרנסלוקציות, היפוכים, מחיקות וכרומוזומי טבעת זוהו בשורות שונות של תאי יתושים 53,54. תצפיות ציטוגנטיות קלאסיות 55 ומיפוי פיזי 56 הדגימו את התרחשותן של טרנסלוקציות כרומוזומליות בזרוע כולה באבולוציה של יתושים מלריה. לכן, חומר microdissected יכול לשמש בשילוב עם ניסויים FISH להשוות הומולוגיה של אזורים כרומוזומליים בין מינים. ביצענו בהצלחה דגים תלת מימדיים עם הגשושית 2R-painting על כרומוזומי פוליטן בתאי אחות בשחלות הר שלם. שיטה זו תקל על המעקב אחר מסלולי כרומוזום וללמוד את הארכיטקטורה הגרעינית ב Anopheles. טכניקות כמו genotyping DNA 57,58, הדור הבא של רצף הגנום 26,27, פיתוח מפת פיזית וחיבור, ודור של בדיקות לציור כרומוזום 33,59 כל יכול להפיק תועלת זרוע באזור ספציפי microdissection. על ידי שילוב טכנולוגיית LCM וקידום WGA חד-תאי, אנו מדגימים שיטה יעילה ומעשית לייצור כמויות סבירות של דנ"א מזרוע כרומוזום פוליטנית אחת.

ציור כרומוזום היא טכניקה שימושית לחקר האבולוציה של קריוטיפים 1-5 ולהמחיש מומים ציטוגנטיים באמצעות הכלאה של DNA כרומוזומלי שכותרתו פלואורסצנטית 1,6-8. שיטה זו מיושמת גם על לימוד הדינמיקה התלת מימדית של שטחי כרומוזום בפיתוח 9 ופתולוגיה 10. צבעי כרומוזום המסומנים באופן דיפרנציאלי משמשים להדמיה של מיטוטי יחיד 11,12, מיוטי 13,14, או שאינם פוליטנים בין-פאזיים 15,16 ופוליטן 9,11,17 כרומוזומים. פרוטוקול פשוט וחזק להשגת צבעי כרומוזום יהיה שימושי מאוד בהרחבת טכניקה זו לאורגניזמים שאינם מודל, כגון יתושים. מתחם Anopheles gambiae הוא קבוצה של שבעה יתושים בלתי ניתנים להבחנה מורפולוגית המשתנים בהתנהגות ובהסתגלות, כולל היכולת להעביר מלריה.  יתושים אלה משמשים מודל מצוין כדי להבין טוב יותר את האבולוציה של מינים קרובים כי שונים מאוד ביכולת הווקטורית שלהם.  רוב המחקרים הציטוגנטיים יתושים מלריה נעשו באמצעות מפותחים, כרומוזומים פוליטניים מאוד (נבדק ב 18,19). דפוסי הפסים הקריאים של כרומוזומי פוליטן אפשרו לחוקרים להדגים את הקשר בין היפוכים פולימורפיים לבין התאמות אקולוגיות ב Anopheles gambiae 20. כמו כן, תכונות ספציפיות לרקמות של 21 ומינים של כרומוזום פוליטן תלת-ממדי התאפיינו במתחם An. macullipennis. עם זאת, לימוד כרומוזומים מיטוטיים יכול לספק מידע חשוב נוסף. לדוגמה, רמה גבוהה יותר של פולימורפיזם הטרוכרומטין שנצפה בכרומוזומים מיטוטיים כבר בקורלציה עם פעילות הזדווגות מופחתת ופוריות ב An. gambiae 23. קשה לבסס את ההתאמה בין מקטעים אוכרומטיים של זרועות פוליטן וכרומוזום מיטוטי רק על ידי השוואת אורכיהם היחסיים. הסיבה לכך היא שהטרוכרומטין מהווה חלק משמעותי בכרומוזומים מיטוטיים, אך אינו מיוצג בכרומוזומים פוליטנים 24. הזמינות של צבעי כרומוזום ליתושים מלריה תאפשר לחוקרים להרחיב באופן משמעותי מחקרים ציטוגנטיים על ידי הכללת מינים נוספים, תוך צמצום משמעותי של העלות והזמן בניתוחים של האבולוציה הקריוטיפית והדינמיקה התלת מימדית של כרומוזומים בקבוצה זו של חרקים חשובים מבחינה אפידמיולוגית.
על מנת להשיג קטעים גדולים של כרומוזומים, microdissection הפך טכניקה אינטגרלית כדי לתפעל ולבודד אזורים ספציפיים של עניין של המשלים כרומוזומלי.  בשילוב עם הגברה גנומית שלמה (WGA), מיקרו-דיסקציה גורמת ליישומים רבי עוצמה במורד הזרם כולל FISH 11,12 ו רצף הגנום של הדור הבא 25-27. בעבר, הטכניקה דרשה שימוש במחטי microdissection מיוחדים שהיו צריכים להיות נשלטים באופן ידני על ידי משתמש מנוסה 28.  ההתקדמות של microdissection לכידת לייזר (LCM) הביא כלי פשוט מתאים יותר עבור בידוד תאים בודדים 29,30 או כרומוזומים בודדים 31-33 עם סיכון פחת של זיהום. גישה זו מאפשרת למשתמש לחקור את ההטרוגניות הגנטית ואת מומים כרומוזומליים המתרחשים בתאים בודדים, במקום נוף קונצנזוס הנובע מאיגום תאים מרובים יחד 34-36. נעשה שימוש בשיטות מרובות כדי להגביר את הדנ"א המופק ממיקרו-דיסקציה.  DOP-PCR, טכניקה שימושית להגברת רצפים שחוזרים על עצמו מאוד, שימשה להגברת כרומוזומים microdissected ממינים כולל חגב 37, צלופחים קוצניים 38, ואת אמנון הנילוס 39.  לאחרונה, ערכת תא יחיד GenomePlex WGA4 מבוסס PCR והגברת תזוזה מרובה מבוסס (MDA) Repli-G תא יחיד ערכה הפכו כלים יקרי ערך לניסויים מעורבים ניתוח גנטי של תאים אנושיים בודדים, כמו גם כרומוזומים40-42, כולל מערכות כרומוזום B בחגבים 37 ו ארבה 43. שתי ערכות אלה כל אחד יש יתרונות וחסרונות, אבל העליונות לכאורה שלהם מעל מערכות הגברה זמינות אחרות הוכח 44.
כמות הדנ"א שניתן להשיג מכרומוזום יחיד או מקטע כרומוזום נמוכה משמעותית מזו של גרעין שלם. לכן מיקרו-דיסקציה, הגברה וניתוח עוקב של כרומוזום יחיד הם הרבה יותר מאתגרים, במיוחד באורגניזמים עם גנומים קטנים כמו בדרוסופילה או אנופלס.  למרות צבעים פותחו כרומוזומים microdissected יחיד של אדם 33 ו צריעה 45, ניסוי FISH מוצלח נדרש מרובים (לפחות 10-15) כרומוזומים מיטוטיים microdissected של זבוב פירות 11. עם זאת, היכולת microdissect ולהגבר כרומוזום יחיד יהיה חשוב עבור (i) הפחתת הסיכוי לזיהום עם חומר כרומוזום שונה, (ii) צמצום מספר ההכנות כרומוזומליות הדרושות microdissection, (iii) הפחתת נוקלאוטידים ופולימורפיזם מבני של המדגם microdissected הן FISH ו רצף במורד הזרם יישומים. כרומוזומי פוליטן המצויים במינים דיפטרניים רבים מציעים הזדמנות ייחודית לרכוש כמות התחלתית גבוהה בהרבה של דנ"א. הם גם מספקים רזולוציה גבוהה יותר ומבנה כרומוזום שלא ניתן להשיג באמצעות כרומוזומים מיטוטיים. רזולוציה נוספת זו יכולה להיות קריטית בהדמיית סידורים מחדש כרומוזומליים, מבנה כרומטין ומקטעים כרומוזומליים להיות microdissected 28,46.
כאן אנו מציגים הליך לבודד ביעילות קטע אוכרומטי מזרוע כרומוזום פוליטן יחיד, להגביר את ה- DNA, ולהשתמש בו ביישומי FISH במורד הזרם יתושים מלריה.  ראשית, אנו מיישמים LCM כדי לבודד ולחלץ זרוע כרומוזום אחת ממגלשות קרום שהוכנו במיוחד. שנית, WGA משמש כדי להגביר את ה-DNA מהחומר microdissected. שלישית, אנו הכלאה DNA מוגברת בניסויים FISH כדי polytene הכנות סקווש 47, metaphase ו שקופיות כרומוזום interphase 48, כמו גם דגימות הר שלמות השחלות 3D. הליך זה נעשה כדי לצייר בהצלחה את רוב האוכרומטין בזרועות כרומוזומליות של An. gambiae.

<table><tbody><tr><td>חומצה אצטית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A491-212</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פרופיונית&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>402907</td><td></td></tr><tr><td>ממברנה שקופיות 1.0 PET</td><td>Zeiss</td><td>415190-9051-000</td><td></td></tr><tr><td>טבליות חיץ " גור"</td><td>Life Technologies</td><td>10582-013</td><td></td></tr><tr><td>KaryoMAX Giemsa Stain</td><td>Life Technologies</td><td>10092-013</td><td></td></tr><tr><td>מערכת דנטורציה/הכלאה של שקופיות ThermoBrite</td><td>Abbott Molecular</td><td>30-144110</td><td></td></tr><tr><td>רכז ואקום</td><td>ואקום Eppendorf</td><td>22820001</td><td></td></tr><tr><td>Spectroline נשלט על ידי מיקרו-מעבד UV Crosslinker XL-1000</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-992-89</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific NanoDrop</td><td>Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>REPLI-g ערכת תא יחיד</td><td>Qiagen</td><td>150343</td><td></td></tr><tr><td>GenomePlex ערכת תא יחיד (WGA4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WGA4-10RXN</td><td></td></tr><tr><td>GenomePlex WGA Reamplification Kit (WGA3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WGA3-50RXN</td><td></td></tr><tr><td>MZ6 Leica סטריאומיקרוסקופ</td><td>Leica</td><td>VA-OM-E194-354</td><td>ניתן להשתמש בסטריאומיקרוסקופ אחר</td></tr><tr><td>אולימפוס CX41 מיקרוסקופ פאזה</td><td>אולימפוס</td><td>CX41RF-5</td><td>ניתן להשתמש במיקרוסקופ פאזה שונה</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ מיקרו-דיסקציה לייזר PALM MicroBeam Zeiss</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>22670000</td><td></td></tr><tr><td>10x</td><td>PBS Invitrogen</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>50x Denhardt& rsquo; s solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2532</td><td></td></tr><tr><td>99% פורממיד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP227500</td><td></td></tr><tr><td>דקסטרן סולפט מלח נתרן</td><td>סיגמא</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC buffer</td><td>Invitrogen</td><td>AM9765</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold antifade Reagent עם DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P-36931</td><td></td></tr><tr><td>dATP, dCTP, dGTP, dTTP</td><td>Fermentas</td><td>R0141, R0151, R0161, R0171</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-dUTP, Cy5-dUTP</td><td>GE Healthcare</td><td>PA53022, PA55022</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>DNA פולימראז I</td><td>Fermentas</td><td>EP0041</td><td></td></tr><tr><td>DNase I&nbsp;</td><td>Fermentas</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>Spermine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3256-1G</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0266-1G</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי (KCl)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP3581</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0396-25G</td><td></td></tr><tr><td>צינורות</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757-25G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>AdhesiveCap 500 Clear</td><td>Zeiss</td><td>415190-9211-000</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Micro Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td></td></tr><tr><td>ערכת ניקוי וריכוז DNA גנומי</td><td>Zymo Research</td><td>D4010</td><td></td></tr><tr><td>37% פרפורמלדהיד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>F79-500</td><td></td></tr></tbody></table>

ציור כרומוזום דו מימדי ותלות מימדי אצל יתושים מלריה

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

פלואורסצנט בהכלאה במקום (FISH) של בדיקות כרומוזום זרוע שלמות היא טכניקה איתנה למיפוי אזורים גנומיים מעניינים, גילוי סידורים מחדש כרומוזומליים וחקר ארגון כרומוזומים תלת מימדי (3D) בגרעין התא. הופעתו של microdissection לכידת לייזר (LCM) והגברת הגנום כולו (WGA) מאפשר קבלת כמויות גדולות של DNA מתאים בודדים. הרגישות המוגברת של ערכות WGA גרמה לנו לפתח צבעי כרומוזום ולהשתמש בהם לחקר ארגון כרומוזום ואבולוציה באורגניזמים שאינם מודלים. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה לבודד ולהגברת מקטעי האוכרומטיות של זרועות כרומוזום פוליטן יחיד מתאי אחות השחלות של יתוש המלריה האפריקאי אנופלס גמביה. הליך זה מספק פלטפורמה יעילה להשגת צבעי כרומוזום, תוך הפחתת הסיכון הכולל להחדרת דנ"א זר לדגימה. השימוש ב- WGA מאפשר מספר סבבים של הגברה מחדש, וכתוצאה מכך כמויות גבוהות של DNA שניתן להשתמש בהם לניסויים מרובים, כולל דגים דו-ממדיים ותלת-ממדיים. הוכחנו כי צבעי הכרומוזום המפותחים יכולים לשמש בהצלחה כדי לבסס את ההתאמה בין חלקים אוכרומטיים של זרועות פוליטן וכרומוזום מיטוטי ב An. gambiae. בסך הכל, האיחוד של LCM ו- WGA של כרומוזום יחיד מספק כלי יעיל ליצירת כמויות משמעותיות של דנ"א יעד למחקרים ציטוגנטיים וגנומיים עתידיים.

איור 1 מתאר את הזרימה הכוללת של הפרוטוקול המתואר במאמר זה.  המשתמש מתחיל בתחילה על ידי דגימות DNA כרומוזום microdissecting משקופיות קרום.  חומר מיקרו-מוזה מופק ומטוהר. לאחר מכן הדנ"א המטוהר מוגבר, מוגבר מחדש, מסומן מחדש ולאחר מכן משמש את FISH לתיוג ממרחי כרומוזום.
ניתן לחלק את פרוטוקול LCM לשלושה שלבים כוללים: 1) מציאת כרומוזומים מעניינים והכנת האזור לחיתוך(איור 2A),2) חיתוך וחיתוך אזור הכרומוזום המעניין באמצעות לייזר(איור 2B) בדיקהכדי לקבוע אם הדגימה אכן מוחלקת לכובעדבק (איור 2C). התהליך של LCM בשימוש על כרומוזומי פוליטן זן An. gambiae סואה מוצג וידאו 1. הסרטון מפרט את התהליך כולו מהפעלת התוכנית, כולל פונקציות תוכנה חשובות וטיפים.
ערכות WGA של תא יחיד GenomePlex ו- REPLI-g המשמשות בפרוטוקול זה שונות מאוד בגודל המוצר וכתוצאה מכך בתפוקה הכוללת.  איור 3 מראה את התוצאות של אלקטרופורזה ג'ל רץ עבור GenomePlex ו REPLI-g ערכות, כמו גם כימות של הדגימות על ידי Nanodrop.
חומר Microdissected שימש ליצירת בדיקות FISH כי היעד אזורים אוכרומטיים של כרומוזום.  איור 4 מדגים דגים של חמש גשושיות שנוצרו מחומר מיקרו-סודי על כרומוזומי פוליטן של א. גמביה.  ארבע זרועות אוטוזומליות סומנו עם שלושה פלואורופורים באמצעות ערכת WGA3: כרומוזום 3R מסומן בירוק (פלואורסצנט), כרומוזום 3L הוא בתערובת של אדום (Cy-3) וצהוב (Cy-5), כרומוזום 2R הוא בצהוב (Cy-5), ואת כרומוזום 2L הוא באדום (Cy-3). כרומוזום X תויג בכתום (Cy-3) באמצעות ניק-תרגום של חומר REPLI-g בניסוי נפרד. כדי לבסס את ההתכתבות בין חלקים אוכרומטיים של זרועות פוליטן וכרומוזום מיטוטי, צבעי כרומוזום הוכלאו לכרומוזומים בין-פאזיים, פרופאז, פרומטאפאז ומטאפאאז של א. גמביה (איור 5).  כדי לדמיין את הארגון 3D של זרוע אחת כרומוזום פוליטן בגרעין התא, דגים הר שלם בוצע על An. gambiae Sua זן תאים אחות השחלות (וידאו 2).  שטחי זרוע כרומוזום מובחנים נראים בבירור בגרעין עם כרומוזומי אינטרפאז(איור 5D)ופוליטן (וידאו 2).
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig1.jpg"> איור 1. ייצוג סכמטי של ההליכים הניסיוניים לקראת הכנת צבעי כרומוזום. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig2.jpg"> איור 2. השלבים העיקריים במיקרו-דיסקציה כרומוזום. A) חיתוך בסיוע לייזר של האזור הכרומוזומלי של עניין דרך הממברנה. ב) הממברנה עם חור לאחר הבליסטראות מבוצעת. ג) הנוף של החתיכה המפוספסת של הממברנה עם קטע כרומוזומלי בתוכה מחובר לכובע הדבק. החץ מציין את ההטרוכרומטין של כרומוזום X שנשאר בשקופית. כוכבית מראה חתיכה של כרומוזום אחר שנשאר על המגלשה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig3.jpg"> איור 3. תמונות ג'ל אגרוז מראה DNA אחרי WGA. A) משקל מולקולרי נמוך (200-500 bp) DNA מזרוע 3R לאחר שימוש בערכות WGA4 ו- WGA3 GenomePlex. B) משקל מולקולרי גבוה (10-20 kb) DNA מזרוע 2L לאחר הגברה REPLI-g. סולם 100 bp מוצג בנתיבים השמאליים. הטבלאות מתחת לתמונות ג'ל מראות ריכוזי דנ"א הנמדדים על ידי Nanodrop. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.</a>
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig4.jpg"> איור 4. ציור של כרומוזומי פוליטן מתאי אחות השחלות של א. גמביה באמצעות ארבע בדיקות שנוצרו מחומר מיקרו-דיסקטי. כרומוזום X מסומן בכתום (Cy-3) על ידי תרגום ניק של חומר REPLI-g. זרוע 2R מסומנת בצהוב (Cy-5); זרוע 2L היא באדום (Cy-3); זרוע 3R מסומנת בירוק (פלואורסצנטין); זרוע 3L מסומנת בתערובת של אדום (Cy-3) וצהוב (Cy-5). אוטומטיים מסומנים בערכת ההגברה WGA3. כרומטין מוכתם בכחול (DAPI). שמות כרומוזומים ממוקמים ליד אזורים טלומריים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig4highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.</a>
<img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig5.jpg"> איור 5. ציור של כרומוזומים בין-פאזיים (A), פרופאז (B), פרומטאפאז (C) וכרומוזומים של מטפאאז (D) מדיסקים דמיוניים זחלים של זן א. גמביה מופטי באמצעות שלוש בדיקות שנוצרו מחומר מיקרו-סודי המסומן על ידי WGA3. זרוע 2R מסומנת בירוק (פלואורסצנטין); זרוע 2L היא ללא תווית; זרוע 3R היא בוורוד, תערובת של אדום (Cy-3) וכתום (Cy-5); זרוע 3L מסומנת בכתום (Cy-5). לכרומוזום X יש תווית אדומה המתאימה לבדיקת 18S rDNA. כרומטין מוכתם בכחול (DAPI). אזורים מוכתמים בבהירות של כרומוזומים תואמים את ההטרוכרומטין. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig5highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.</a>
וידאו 1. התהליך של LCM של כרומוזומי פוליטן An. gambiae. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/Sharakhov_video1.mp4" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בסרטון 1.</a>
וידאו 2. כל הר 3D FISH שבוצע על An. גמביה תאים אחות השחלות. הגשושית מסומנת ב-Cy-3 (מתוארת בכחול) והתבצעה מזרוע כרומוזום 2R מיקרו-דיסקית.  כרומטין היה מוכתם ב- DAPI ומתואר על ידי ציאן פסאודו-צביעה (כחול בהיר). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/Video2.avi" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בסרטון 2.</a>

ציור כרומוזום הוא שיטה שימושית לחקר ארגון גרעין התא והתפתחות הקריוטיפ. כאן, אנו מדגימים גישה לבודד ולהגביר אזורים ספציפיים של עניין מכרומוזומי פוליטן יחיד המשמשים לאחר מכן עבור פלואורסצנט דו מימדי בהכלאה situ (FISH).

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להפיק כמות מספקת של אמפליקון DNA מזרוע אחת של כרומוזום polytan שעברה מיקרו-דיסקציה, על מנת להשתמש בה ישירות לניסויי דגים. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת דגימות ריסוק (squashes) של כרומוזומי polytan על שקופיות ממברנה שתוכננו במיוחד למיקרו-דיסקציה. השלב השני של הפרוצדורה הוא בידוד ולכידה של זרועות בודדות של כרומוזומי polytan באמצעות מיקרו-דיסקציה בלייזר.השלב השלישי הוא בידוד DNA מהדגימה שעברה מיקרו-דיסקציה והגברה של ה-DNA באמצעות שני סבבים של הגברה גנומית מלאה. השלבים הסופיים הם סימון ה-DNA המוגבר ושימוש בו בניסויי דגים. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להניב כמויות גדולות של DNA מסומן פלואורסצנטית עבור אזור עניין.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון FISH עם BAC clones או מקטעי PCR, הוא שניתן לצבוע פלואורסצנטית חלקים גדולים של כרומוזומים באמצעות גששים מסומנים אלו. כמו כן, אין צורך בידע על הרצף עבור צבעי הכרומוזומים, כיוון שהם מבודלים באופן מכני מזרועות כרומוזומים שלמות. ראשית, יש לבודד במקרה זה את הכרומוזומים משחלותיהם של כחמישה יתושים שקובעו בתמיסת Carnot טרייה.לאחר שאישור פריסה טובה של הכרומוזומים התקבל, הכרומוזומים משטחים על ידי דנטורציה, ולאחריה אינקובציה קרה למשך לילה. למחרת, הכרומוזומים עוברים דהידרטציה ושטיפה כדי להכינם למיקרודיסקציה. יש לוודא כי מיקרוסקופ המיקרודיסקציה מנוקה באתנול וכי הכפפות והמבחנות עברו סטריליזציה ב-uv.לאחר מכן, בצעו מיקרו-דיסקציה של הכרומוזומים בהתאם לסרטון המשני המסופק בפרוטוקול הטקסט. אספו את ה-DNA באמצעות ערכת cogen עם התאמה למבחנה הפוכה. המשיכו בניקוי בעזרת עמודה (column purification) ואלוציה לתוך מים.קיימים שני נתיבים להגברה של גנום שלם עבור זרוע אחת של כרומוזום. נתיב ה-ley g מספק תנובה ראשונית גבוהה יותר, אך מחייב תרגום NIC כדי לסמן את ה-DNA. לנתיב ה-genome plex את היתרון של אפשרות לביצוע מספר סבבים של רפליקציה, כמו גם סימון ישיר של הפרובים בתוצאה הסופית.יש להקפיד על תנאים סטריליים ככל האפשר, שכן קיים סיכוי גבוה להגברה של מזהמים. עבור השורש של ה-genome plex: ראשית, יש לאפשר לערכה של single cell WGA four להפיק את הסבב הראשון של DNA מוגבר. שנית, יש לטהר את ה-DNA באמצעות ערכת genome clean and concentrator.אל תשכחו להעביר את ה-DNA השטוף באמצעות מים ולא באמצעות באפר TE. שלישית, בצעו רייפיקציה (reify) ל-DNA ורביעית סמנו אותו עבור שני שלבי הדגים. השתמשו בערכת הגברה של WGA three.סימון ה-DNA דורש שימוש בתערובת DNTP מיוחדת המשלבת יחס ספציפי של נוקלאוטידים וכן את ה-DUTP המסומן. בעת ביצוע ערכת ה-rege, השתמשו תחילה בערכת ה-WGA לתא בודד שלהם עם מים שעוקרו לאחרונה ובבופר D two שהוכן לאחרונה. לאחר מכן, פעלו לפי פרוטוקול התרגום של ה-NIC כדי לסמן את ה-DNA שהועשר.יש לוודא את גודל מקטע ה-DNA על ג'ל. המקטעים צריכים להיות באורך של כ-200 עד 500 זוגות בסיסים. לסיום, יש להשקיע את ה-DNA המסומן באמצעות אתנול וסבון (ethanol precipitate) ולסובב את הדגימה בצנטריפוגה בטמפרטורה של 4°C למשך 10 דקות.לאחר מכן, ייבשו באוויר את המשקע שהופק והוסיפו 40 µL של תמיסת היברידיזציה. מראש, הכינו סליידים עם דפנות מרובעות של לק ציפורים שעליהן יונחו הזכוכיות, כדי שהגרעינים לא יימעכו על ידי הזכוכית.העבירו את השחלות למבחנה המכילה 150 עד 250 µL של בופר, בתוספת 0.5% digitonin במבחנה. השתמשו במחט דיסקציה גדולה כדי להרוס את קרומי הזקיקים. לאחר מכן, בצעו ערבוב במערבל Vortex למשך חמש עד 10 דקות כדי להמשיך ולפרק את הזקיקים.גרדו את כל חלקי הזקיקים הגדולים וסובבו את המבחנה בצנטריפוגה למשך 30 שניות במהירות נמוכה, כ-500 RPM. העבירו את התוצרים העליונים (supernatants) למבחנה חדשה והוסיפו 100 µL של בופר A למבחנה המקורית המכילה את הזקיקים המפורקים. כעת, חזרו על שלבי בידוד הגרעינים על הזקיקים המפורקים עד שהרקמה הנראית לעין תהיה רק חלקיקים קטנים.אספו את כל הנוזל העליון (supernatant) לאותה מבחנה, שכן כולו יכיל בעיקר גרעינים. לאחר מכן, סובבו בצנטריפוגה את המבחנה המכילה את הנוזל העליון ואת המבחנה המכילה את הרקמה שנותרה, המעובדת כאמצעי הגנה. השליכו את הנוזל העליון והוסיפו 200 µL של buffer A עם 0.1% Triton; ערבבו את המבחנות ב-vortex בעוצמה עד לפירוק המשקעים, ולאחר מכן הדגירו את הדגימות למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C.ביום למחרת, סובבו את המבחנות בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-10,000 RPM, הסירו את העל-נוזלים והוסיפו 200 µL של 4% paraform aldehyde ב-PBS. לאחר מכן, הדגירו את המבחנות ב-thermo mixer למשך 30 דקות, תוך ערבוב ב-450 RPM. הסירו את המקבע באמצעות סבב של חמש דקות ב-5,000 RPM, ולאחר מכן השליכו את העל-נוזלים.לאחר מכן, הוסף buffer A עם 0.1% Triton והדגרא את המבחנות למשך חמש דקות ב-thermo mixer במהירות של 450 RPM, ולאחר מכן שטוף את התאים למשך חמש דקות נוספות בצנטריפוגה במהירות של 5,000 RPM. הכן את הגשש (probe) המסומן וחמם אותו ל-37 degrees Celsius. כאשר התאים ישקעו כמשקע (pellet), החלף את הנוזל העליון (supernatant) בלפחות 20 microliters של הגשש המסומן.אין צורך להקפיד על הריכוז שלו. בשלב הבא, דנטורציה של ה-DNA בטמפרטורה של 95 °C ב-Thermo mixer במהירות של 450 RPM למשך 10 דקות, והמשך של הדנטורציה בטמפרטורה של 80 °C למשך 15 דקות תוך ערבוב רציף. לאחר מכן, הורד את הטמפרטורה ל-37 °C והשאר את הדגימה בערבוב למשך הלילה.למחרת, השג את הגרעינים על ידי סרכזה למשך חמש דקות, ב-5,000 RPM (2,655 Gs). החלף את ה-SUPERNAT בשטיפה של באפר המכיל 0.1% tritton. אפשר לתאים להישטף למשך חמש דקות עם ערבוב במהירות של כ-500 RPM בטמפרטורת החדר.הסר את תמיסת השטיפה באמצעות סבוב נוסף של צנטריפוגה וחזור על תהליך השטיפה פעמיים נוספות. לאחר הסרת השטיפה השלישית, השהה את הגרעינים ישירות בטיפה של prolonged anti fade עם DPI. סיים על ידי העברה זהירה של הגרעינים, תוך הימנעות מבועות, לזכוכית preparat מוכנה והנח לוחית כיסוי genome plex ו-ee.ערכות WGA לתא בודד שימשו שניהם כפי שתואר על רקמת יתוש. ה-DNA שהתקבל הושווה באמצעות אלקטרופורזה בג'ל. ניכר כי התנובה השתנתה באופן משמעותי, ודבר זה אושש גם באמצעות ספקטרוסקופיה.ביצעו FISH באמצעות חמישה גששים עבור חומר שבוצע מיקרו-דיסקציה על כרומוזומי פוליטן של יתוש. ארבעה אוטוזומים סומנו בשלושה פלואורופורים באמצעות ערכת WGA three. כרומוזומ ה-R השלישי סומן בפלואורסצאין ירוק.כרומוזום L השלישי הוא בתערובת של אדום וצהוב. כרומוזום R השני הוא בצהוב וכרומוזום L השני הוא באדום. כרומוזום X סומן בכתום באמצעות תרגום NIC של חומר ley G וניסוי נפרד לקביעת ההתאמה בין חלקים כרומטיים של זרועות כרומוזומי פוליטן ומיטוטיים.צבעי כרומוזומים (Chromosome paints) הועברו בהיברידיזציה לכרומוזומי אינטרפאזה. זרוע R השנייה מסומנת בירוק. זרוע R השלישית מסומנת בוורוד, וזרוע L השלישית מסומנת בכתום.הכרומטין נצבע בכחול באמצעות DPI וכרומוזומי פרופאזה נצפו. לכרומוזום X יש סימון אדום המתאיב לגשש 18 S-R-D-N-A. לאחר מכן נצפו כרומוזומי פרו-מטאפאזה. כמו כן נמצאו כרומוזומי מטאפאזה.האזורים הצבועים בכחול בהיר תואמים להטרוכרומטין, לצורך הדמיה של הארגון התלת-ממדי של זרוע כרומוזום פוליטני בודד בגרעין התא. ביצוע דגימת דג שלמה (Whole mount) בוצע על זן sue. טריטוריות של זרועות כרומוזומים בתאי סיעוד של שחלה ביתושים נראות בבירור בכרומוזומים הפוליטניים.באופן דומה, ניתן לראות בבירור טריטוריות נפרדות של זרועות כרומוזומים בגרעינים במצב interface. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לבצע את כל השלבים תוך התחשבות בסיכוני זיהום. קל מאוד לזהם את הדגימות, דבר שיוביל לתשואת הגברה נמוכה של ה-DNA המיועד.

2d-and-3d-chromosome-painting-in-malaria-mosquitoes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

ברגע גן מזוהה עקשן פוטנציאלי עבור מלריה, זה חייב להיות מוערך על תפקידה במניעת זיהומים Plasmodium בתוך היתוש. פרוטוקול זה מדגים כיצד מידת זיהומים Plasmodium של יתושים יכול להיות assayed. טכניקות להכנת תרבות gametocyte, האכלה קרום יתושים דם האדם, assaying titers ויראלי midgut היתושים הם הפגינו.

פרוטוקול זיהומים Plasmodium falciparum בקביעת הפנוטיפ יתושים זיהום

חוצה גנטי של טפילי מלריה מכרסם מבוצעות על ידי האכלה two טפילים שונים גנטית יתושים. הצאצאים רקומביננטי הם משובטים מהדם לאחר עכבר המאפשר יתושים לנשוך עכברים נגועים. סרט הווידאו הזה מראה איך לייצר צלבי הגנטי...

פרוטוקול עבור הפקה של הצלב גנטית של טפילי מלריה מכרסמים

הרכבות גנום המבוססות על טכנולוגיות ריצוף DNA מקבילי מאסיבי הן בדרך כלל מקוטעות מאוד. פיתוח מפות כרומוזומים פיזיות עשוי לשפר את הרכבות הגנום. כאן, אנו מציגים גישות חדשניות להכנת כרומוזומים, היברידיזציה פלואורסצנטית in situ ודימוי, המגבירות משמעותית את התפוקה של פיתוח המפה הפיזית.

תפוקה גבוהה מיפוי פיזי של הכרומוזומים באמצעות אוטומטי<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה

בין השלושה סוגי היתושים,...

פלואורני<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה על כרומוזומים mitotic של יתושים

סרטון זה מדגים את הדור של מודל עכבר ניסיוני של מלריה מוחית. ספורוזואיטים שבודדו מנקבות יתושים נגועות בפלסמודיום ברגהיי מוזרקות לוורידי הזנב של עכבר מרוסן, מה שמוביל להפרעה במחסום הדם-מוח ולדלקת במוח, מה שגורם למלריה מוחית. מודל עכבר נגוע זה מציע כלי רב ערך לחקר פתולוגיה מיקרו-וסקולרית in vivo הקשורה למלריה מוחית.

יצירת מודל עכברי של מלריה מוחית ניסיונית באמצעות ספורוזואיטים שמקורם ביתושים מארחים

ליתושים המעבירים מלריה יש מספר מאפיינים חשובים מבחינה אפידמיולוגית שניתן לזהות רק באמצעות טכניקות מולקולריות. תוך שימוש בפלטפורמת גנוטיפ SNP מבוססת MALDI-TOF, פיתחנו בדיקה לזיהוי בו-זמנית של תכונות מפתח מרובות (מינים, עמידות לקוטלי חרקים, זיהום טפילים ובחירת מארח) של וקטורים למלריה.

Assay Multi-זיהוי ליתושי מלריה העברה

אנו מתארים מודל עכבר של מלריה מוחית ניסיונית ומראים כיצד ניתן לעקוב אחר פתולוגיה דלקתית ומיקרו-וסקולרית in vivo באמצעות הדמיית תהודה מגנטית.

בשנת מעקב Vivo של בצקת פיתוח ופתולוגיה מיקרוסקולרית במודל של מלריה מוחית ניסיוני באמצעות תהודה מגנטית הדמיה

בשל הדמיון הבולט של מחזור החיים ביולוגיה של טפילים מלריה מכרסמים לטפילים מלריה אדם, מודלים מלריה מכרסם הפכו חיוניים למחקר מלריה. בזאת, אנו מתוקננת כמה מן הטכניקות החשובות ביותר בשימוש בניתוח פנוטיפ של פראי סוג ומלריה מכרסם הטרנסגניים.

ניתוח פנוטימית של מלריה מכרסם טפיל מינית ושלבי דם מיניים ושלבי יתוש

הפרוטוקול מתאר כיצד להשיג שינויים מכווני אתר בגנום של יתושי מלריה אנופלס באמצעות מערכת φC31 . השינויים המתוארים כוללים הן את האינטגרציה והן את חילופי הקלטות מהונדסות בגנום של קווי עגינה נושאי attP.

אתר φC31-בתיווך אינטגרציה וחילופי קלטות בוקטורים אנופלס של מלריה

בהתחשב באנטומיה הפשוטה שלהם, אשכי אנופלס מציעים מודל ציטולוגי טוב לחקר זרע. פרוטוקול זה מתאר הכלאה פלואורסצנטית באתרה , טכניקה המשמשת לחקר תהליך ביולוגי זה, כמו גם את הפנוטיפ של זנים טרנסגניים בעלי מוטציות בגנים המעורבים בייצור זרע.

הכלאה פלואורסצנטית באתרה לחקר ספרמטוגנזה ביתוש האנופלס

גנטיקה כימית כוללת החלפה של שאריות שוער בחומצת אמינו המכילה שרשרת צדדית שונה במוקד המטרה. כאן, יצרנו טפיל מוטנטי המכיל אלל היפומורפי של cdpk1 וזיהינו מסלולי פיצוי שאומצו על ידי הטפיל ברקע המוטנטי.

הבנת התפתחותם של מסלולי פיצוי בטפיל מלריה מוטנטי בעל אלל היפומורפי של קינאזות דמויות צמחים

למד שיטת צביעת כרומוזומים בדו-מימד ובתלת-מימד ביתושי מלריה באמצעות FISH ומיקרו-ניתוח לייזר. טכניקה זו מאפשרת הדמיה מדויקת של אזורי כרומוזומים ללא צורך בידע מוקדם ברצף.

ציור כרומוזום דו מימדי ותלות מימדי אצל יתושים מלריה

גלה סרטונים נוספים