קביעת המישורים המחייבים קרח של חלבונים נגד קיפאון על ידי זיקה למטוס קרח מבוסס פלואורסצנטיות

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לדמיין את מישורי הקרח הקשורים על ידי חלבונים מונעי קפיאה המסומנים פלואורסצנטית. זה מושג על ידי גידול גבישי קרח בודדים שאליהם החלבונים מונעי הקפאה יכולים להיקשר כצעד שני. כל גביש נצפה דרך מקטבים מוצלבים כדי לבסס את הייחודיות והכיוון שלו.

לאחר מכן, גביש קרח מורכב על אצבע קרה מבוקרת טמפרטורה ונוצר לחצי כדור. לאחר מכן הוא טובל בתמיסה של חלבונים נוגדי קיפאון המסומנים בפלואורסצנט על מנת לספוג את החלבון נוגד הקפאה למישורי קישור ספציפיים של חצי הכדור הגדל. תוצאות הקרח מתקבלות על ידי הדמיה והדמיה של קרח הקשור על ידי חלבון מונע קפיאה המסומן פלואורסצנטי, תוך שימוש באור ספציפי לאורך גל ומסננים בחדר קירור חשוך.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו תחריט קרח, הוא שהחלבונים נגד הקפאה מסומנים באופן פלואורסצנטי כדי לאפשר הדמיה מיידית של מישורי הקרח הקשורים לחלבון התחל לגדל גביש על ידי הכנת אמבט אתילן גליקול מבוקר טמפרטורה במינוס 0.5 מעלות צלזיוס ומציאת מחבת מתכת נקייה שמתאימה לתוכה ויכולה לצוף עליה. הגבישים נוצרים בתבניות. השתמש בתבניות גליליות בגובה שלושה עד ארבעה סנטימטרים חתוכות מצינור פוליוויניל כלוריד.

לכל תבנית צריך להיות חריץ ברוחב מילימטר אחד, בגובה שני מילימטר בצד אחד. מרחו סרט קל של שומן ואקום על צד הטבעת שממנה נחתך החריץ. אטום את המשטח המחורץ המשומן הזה על תבנית המתכת כשהחריץ מכוון הרחק ממרכז התבנית.

הקפד לא למלא או לחסום את החריצים בשומן. מכינים כמה שיותר תבניות שיכולות להיכנס לתבנית. לאחר מכן, הוסיפו דגה מסוננים ומים נטולי יונים למרכז התבנית מחוץ לתבניות.

היזהר לא להכניס בועות. כאשר שכבת המים מוגבהת לחמישה מילימטרים, המים צריכים להיכנס לאט לתבניות דרך החריצים. בסיום, הניחו את התבנית בצורה מושלמת לתוך אמבט האתילן גליקול.

לאחר שהמחבת והמים הגיעו למינוס 0.5 מעלות צלזיוס, מוסיפים חתיכת קרח קטנה לאמצע התבנית מחוץ לתבניות. דגרו למשך הלילה כדי ליצור שכבת קרח במהלך שלושת הימים הבאים. חוזרים לאמבטיה כדי להוסיף מים לתבניות.

הפקידו 13 מיליליטר של ארבע מעלות צלזיוס, דגה ומים נטולי יונים לכל תבנית. פעם ביום לאחר הוספת המים, הפחיתו את הטמפרטורה של אמבט האתילן גליקול. ביום הרביעי יש למלא את התבניות לחלוטין בקרח.

אחזר את התבניות והכין משטח נקי לקרח. משוך כל תבנית מהתבנית ודחף את גביש הקרח החוצה. מניחים את המשטח הנקי עם התבניות במקפיא מינוס 20 מעלות צלזיוס למשך שעה.

לפני הטיפול. כשהקרח מוכן, קחו אותו לחדר הקפאה או לחדר קירור כדי לקבוע אם מדובר בגביש בודד. הניחו את הקרח בין שני מקטבים חוצים.

אם הקרח הוא גביש בודד, אין לראות סדקים או אי רציפות וכיוון האור לא אמור להשתנות בתוך הגביש. כשהמקטב עדיין במקומו, קבע את הכיוון של ציר C על ידי התבוננות באור המועבר בעת סיבוב הקרח. כדי לקבוע את הכיוון של AEs A, עטפו את הקרח היטב בנייר אלומיניום.

כוון מחט רגילה לציר הים ותקע חור קטן דרך נייר הכסף לתוך הקרח. לאחר מכן, הניחו את הקרח בוואקום של 0.5 מיליבר למשך 20 דקות. לאחר שליפת הקריסטל, חשפו אותו בחדר הקירור.

התבונן בתחריט המשושה במישור הבסיסי. ה-A AEs עוברים דרך קודקודי הכוכב בעל ששת הקצוות. גביש זה ייחתך לשניים לאורך קו מקביל לנקודות מנוגדות בכוכב.

כדי לחשוף מישור פריזמה ראשוני, החזק את הגביש היטב על ספסל. השתמש במסור כדי לחתוך את הקריסטל לשניים. אוספים את החלקים להרכבה על אצבע קרה.

יש להכין את גביש הקרח עוד יותר להרכבה על אצבע קרה, למצוא שני מוטות אלומיניום בקטרים שונים במקצת, אך דומים בגודלם לאצבע הקרה. השתמש לסירוגין במוטות כדי להמיס חלל לתוך החלק העליון של עצירת הגביש כאשר יש חלל שאליו האצבע הקרה יכולה להשתלב. מצננים את האצבע הקרה למינוס 0.5 מעלות צלזיוס ומניחים אותה בחלל הקרח.

החזק את הגביש במקומו עד שהוא קופא למתכת. לאחר מכן, מלאו חצי כדורית בקוטר כפול של גביש הקרח במים מסוננים נטולי יונים מקוררים לארבע מעלות צלזיוס. טבלו את גביש הקרח הקשור באצבע קרה בכוס, הסירו עודפי מים כך שהחלק העליון של גביש הקרח יהיה בערך ישר עם הנוזל והקרח לא נוגע.

דפנות הגביעונית מכסות את הגביעונית בבידוד ומורידים את הטמפרטורה למינוס חמש מעלות צלזיוס. אפשרו לקרח ליצור חצי כדור במשך כשעה. התכוננו להוסיף את החלבון הפלואורסצנטי.

כאשר חצי הכדור מוכן. הסר את גביש הקרח מהכוס, הסר מים מהכוס. לאחר מכן הוסף 25 עד 30 מיליליטר של תמיסת חלבון מקוררת מראש עם תווית פלואורסצנטית בריכוז הרצוי.

תוך שמירה על נפח הנוזל הכולל ללא שינוי, טבלו את גביש הקרח בכוס. שוב. ודא שהחלק העליון של הגביש ישר עם הנוזל ואינו נוגע בדפנות הכוס. הורידו את טמפרטורת האצבע הקרה למינוס שמונה מעלות צלזיוס ותנו לתמיסת החלבון לקפוא לתוך הגביש למשך שעתיים-שלוש.

עצור את צמיחת הקרח כאשר נוצרו לפחות חמישה מילימטרים של קרח מתמיסת החלבון. כשהאצבע הקרה עדיין מחוברת, הסר את גביש הקרח מהכוס. נתק את האצבע הקרה על ידי חימום נוזל הקירור לקצת מעל אפס מעלות צלזיוס.

המתן עד שגביש הקרח יימס. כאשר הגביש נמס מהאצבע הקרה, הנח אותו עם הצד השטוח כלפי מטה על משטח נקי. היזהר לא לגעת בקרח החדש שנוצר.

אחסן את הקריסטל בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפחות לפני שתמשיך לדמיין את עבודת הקרינה בחדר קר שניתן להחשיך. הכן מנורות עם מסנני עירור ספציפיים באורך גל כדי לרגש את תווית הפלואורסצנט ומסנני פליטת המצלמה. כדי לחסום אור לא ספציפי, הניחו את הקרח עם הצד השטוח כלפי מטה מתחת למנורות, החשיכו את החדר והתבוננו בתבניות בקרח המואר.

כדי להעריך את מישורי הקרח הקשורים על ידי חלבוני האנטיפריז, השווה תמונת תחריט קרח מסורתית לזו של מישור הקרח המבוסס על הקרינה המקבילה ניתוח זיקה באמצעות טריקסי שניהם מראים חלבונים נוגדי קפיאה מסוג אחד המיוצרים על ידי סנדל החורף פסאודו פקטוס אמריקנה. ניתן להשתמש בטכניקה כדי להשוות בו זמנית דפוסי קשירת קרח של חלבונים מונעי קפיאה שונים. במקרה זה, פסיפיק בלו תייג סוג 3 NFEA FP 8 וטריקסי תייג חלבון נוגד קפיאה מסוג 1.

זו התוצאה של הדמיה של סוג 3 N-F-E-A-F-P שמונה כאן, רק חלבון נוגד הקפאה מסוג 1 מוצג בתמונה זו. השניים מוצגים יחד. שימו לב שציר C זהה לכל תמונה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לגדל ולכוון גבישי קרח בודדים ולהשתמש בניתוח הזיקה הרגילה של קרח מבוסס פלואורסצנטי כדי להעריך דפוסי קשירה רגילים של קרח של חלבונים מונעי קפיאה המסומנים בפלואורסצנט.