קביעת המישורים המחייבים קרח של חלבונים נגד קיפאון על ידי זיקה למטוס קרח מבוסס פלואורסצנטיות
15 בינואר 2014
חלבונים נגד קיפאון (AFPs) נקשרים למישורי קרח ספציפיים כדי למנוע או להאט את צמיחת הקרח. ניתוח זיקה למישור קרח (FIPA) המבוסס על פלואורסצנטיות הוא שינוי בשיטת תחריט הקרח המקורית לקביעת מטוסי קרח הקשורים ל- AFP. AFPs מסומנים באופן פלואורסצנטי, משולבים בגבישי קרח בודדים מקרוסקופיים, ומוצגים תחת אור UV.
המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להמחיש ויזואלית את מישורי הקרח המקושרים לחלבוני נוגד קיפאון המסומנים פלואורסצנטית. מטרה זו מושגת על ידי גידול גבישי קרח בודדים, אליהם ניתן לקשור את חלבוני נוגד הקיפאון כשלב שני. כל גביש נבחן באמצעות מקטבים מצלבים כדי לאשר את ייחודו ואת אוריינטציית שלו.
בשלב הבא, גביש קרח מורכב על גבי "אצבע קרה" (cold finger) בעלת בקרת טמפרטורה ומעוצב לצורת חצי כדור. לאחר מכן, הוא טובל בתמיסה של חלבוני נוגדי קיפאון המסומנים פלואורסצנטית, כדי לספוג את החלבונים הנוגדי קיפאון על מישורי קישור ספציפיים של חצי הכדור הצומח. תוצאות הקרח מתקבלות על ידי ויזואליזציה והדמיה של קרח הקשור לחלבון נוגד קיפאון המסומן פלואורסצנטית, תוך שימוש באור ובמסננים ספציפיים לאורך גל בחדר קר וחשוך.
היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תג' קרח (ice etching), הוא שחלבוני נוגדי הקפיאה מסומנים פלואורסצנטית כדי לאפשר ויזואליזציה מיידית של מישורי הקרח הקשורים לחלבון. התחילו את גידול הגבישים על ידי הכנת אמבט אתילן גליקול בטמפרטורה מבוקרת של 0.5- degrees celsius ומציאת תבנית מתכת נקייה המתאימה לאמבט ויכולה לצוף עליו. הגבישים נוצרים בתבניות. השתמשו בתבניות גליליות בגובה של שלושה עד ארבעה סנטימטרים, הגזורות מצינור polyvinyl chloride.
בכל תבנית צריכה להיות חריצה ברוחב מילימטר אחד ובגובה שני מילימטרים בצד אחד. יש למרוח שכבה דקה של גריז ואקום על דופן הטבעת ממנה נחתכה החריצה. יש לאטום את פני השטח המחורצים והמשומנים על גבי התבנית המתכתית, כאשר החריצה מופנית הרחק ממרכז התבנית.
הקפידו לא למלא או לחסום את החריצים בגריז. הכינו מספר תבניות רב ככל שניתן להכניס למגש. לאחר מכן, הוסיפו מים מסיננים ומסולקי גזים (Degas) ומים דה-יוניים למרכז המגש מחוץ לתבניות.
הקפידו לא להחדיר בועות אוויר. כאשר שכבת המים מועלית לגובה של חמישה מילימטרים, המים צריכים לחדור לאט לתבניות דרך החריצים. בסיום הפעולה, הניחו את התבנית באופן מאוזן לחלוטין בתוך אמבט האתילן גליקול.
לאחר שהמחבת והמים הגיעו למינוס 0.5 מעלות צלזיוס, הוסיפו חתיכת קרח קטנה למרכז המחבת מחוץ לתבניות. הדגרירו למשך הלילה כדי ליצור שכבת קרח במהלך שלושת הימים הבאים. החזירו לאמבטיה כדי להוסיף מים לתבניות.
העבירו 13 milliliters של מים דה-יוניים ומנוונים בטמפרטורה של ארבע degrees Celsius לכל תבנית. פעם ביום לאחר הוספת המים, הפחיתו את הטמפרטורה של אמבט האתילן גליקול. עד היום הרביעי, התבניות צריכות להיות מלאות לחלוטין בקרח.
הוציאו את התבניות והכינו משטח נקי עבור הקרח. משכו כל תבנית מהמגש ודחפו החוצה את גביש הקרח. הניחו את המשטח הנקי עם התבניות במקפיא בטמפרטורה של 20- degrees Celsius למשך שעה אחת.
לפני הטיפול. כאשר הקרח מוכן, העבירו אותו לחדר הקפאה או לחדר קירור כדי לקבוע אם מדובר בגביש בודד. הניחו את הקרח בין שני פולריזטורים מצולבים.
אם הקרח הוא גביש יחיד, לא אמורים להיראות סדקים או אי-רציפויות וכיוון האור לא צריך להשתנות בתוך הגביש. כאשר המקטב עדיין במקומו, קבעו את כיוון ציר ה-C על ידי התבוננות באור המועבר בזמן סיבוב הקרח. כדי לקבוע את כיוון ה-A AEs, עטפו את הקרח היטב בנייר אלומיניום.
כוון מחט בניצב לציר ה-sea ונקב חור קטן דרך הרדיד ואל תוך הקרח. לאחר מכן, הנח את הקרח בוואקום של 0.5 millibar למשך 20 דקות. לאחר הוצאת הגביש, חשוף אותו בחדר הקר.
יש לבחון את התבנית המשושה של התאתוך (etch) במישור הבסיס. ה-A AEs עוברים דרך קודקודי הכוכב בעל שש הפונים. גביש זה ייחתך לחצי לאורך קו המקביל לנקודות נגדיות בכוכב.
כדי לחשוף מישור מנסרה ראשוני, אחזו את הגביש בבטחה על סביב השולחן. השתמשו במסור ברזל כדי לחתוך את הגביש לחצי. אספו את החלקים לצורך התקנה על "אצבע קרה" (cold finger).
יש להכין את גביש הקרח להרכבה על גבי ה-cold finger; מצאו שני מוטות אלומיניום בעלי קטרים שונים מעט, אך בגודל דומה לזה של ה-cold finger. השתמשו במוטות לסירוגין כדי להמיס חלל בחלקו העליון של הגביש, והפסיקו כאשר ייווצר חלל שבו יוכל ה-cold finger להשתלב. קררו את ה-cold finger למינוס 0.5 °C והניחו אותו בחלל הקרח.
החזיקו את הגביש במקומו עד שיהקפיא למתכת. לאחר מכן, מלאו כוס חצי-כדורית שקוטרה גדול בערך פי שניים מקוטר גביש הקרח במים דה-יונזים מסוננים שקוררו ל-4 °C. טבלו את גביש הקרח הקשור למשטח הקירור (cold finger) בתוך הכוס, והסִירו עודפי מים כך שראש גביש הקרח יהיה בערך בגובה פני הנוזל והקרח לא יגע בהם.
כסו את דפנות הכוס בבידוד והורידו את הטמפרטורה למינוס חמש מעלות צלזיוס. המתינו כשעה עד שייווצר קרח בצורת חצי כדור. התכוננו להוסיף את החלבון הפלואורסצנטי.
כאשר ההמיספרה מוכנה, הוצא את גביש הקרח מהכוס ורוקן את המים מהכס. לאחר מכן, הוסף 25 עד 30 milliliters של תמיסת חלבון מסומנת פלואורסצנטית שהקוררה מראש בריכוז הרצוי.
תוך שמירה על נפח נוזל כולל ללא שינוי, טבלו את גביש הקרח לתוך הכוס. שוב. ודאו שחלקו העליון של הגביש נמצא בקו אחד עם הנוזל ואינו נוגע בדפנות הכוס. הפחיתו את טמפרטורת האצבע הקרה ל-8- °C והניחו לתמיסת החלבון קפואה לתוך הגביש למשך שעתיים עד שלוש שעות.
עצרו את צמיחת הקרח כאשר נוצרו לפחות חמישה מילימטרים של קרח מתמיסת החלבון. בעוד שהקירור (cold finger) עדיין מחובר, הוציאו את גביש הקרח מהכוס. נתקו את הקירור על ידי חימום נוזל הקירור לטמפרטורה הגבוהה במעט מאפס מעלות Celsius.
המתינו עד שגביש הקרח ינמס וייפול. כאשר הגביש נמס ומסוגל להיפרד מהגביש הקר (cold finger), הניחו אותו כאשר הצד השטוח פונה כלפי מטה על משטח נקי. היזהרו לא לגעת בקרח שזה עתה נוצר.
אחסנו את הגביש בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפחות. לפני המעבר לוויזואליזציה של הפלואורסצנציה, עבדו בחדר קר שניתן להחשיכו. הכינו מנורות עם מסנני עירור בעלי אורך גל ספציפי לעירור התג הפלואורסצנטי ומסנני פליטה למצלמה. כדי לחסום אור לא ספציפי, הניחו את הקרח כאשר הצד השטוח פונה כלפי מטה מתחת למנורות, החשיכו את החדר וצפו בדפוסים בקרח המואר.
כדי להעריך את מישורי הקרח הכבולים על ידי חלבוני נוגדי קיפאון, השוו תמונת תג' ice etch מסורתית לתמונת ניתוח זיקה של מישורי קרח מבוססת פלואורסצנציה תואמת; שתיהן מראות חלבוני נוגדי קיפאון מסוג one המיוצרים על ידי דג הפלונדר החורפי pseudo pectus Americana. ניתן להשתמש בטכניקה כדי להשוות בו-זמנית דפוסי קישור לקרח של חלבוני נוגדי קיפאון שונים. במקרה זה, type three NFEA FP eight המסומן ב-Pacific Blue וחלבון נוגד קיפאון מסוג one המסומן ב-trixy.
זוהי התוצאה של ויזואליזציה של סוג שלושה בלבד של N-F-E-A-F-P eight; כאן רק חלבון נוגד קיפאון מסוג אחד מוצג בוויזואליזציה בתמונה זו. השניים מוצגים יחד. שימו לב שציר ה-C זהה בכל אחת מהתמונות.
לאחר צפייה בסרטון זה, תרכושו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לגדל ולכוון גבישי קרח בודדים, ולהשתמש בניתוח זיקה למישורי קרח המבוסס על פלואורסצנציה כדי להעריך דפוסי קישור למישורי קרח של חלבוני נוגัด קיפאון המסומנים פלואורסצנטית.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מתמקד בוויזואליזציה של מישורי קרח הקשורים לחלבוני נוגדי קיפאון (AFPs) המסומנים פלורוצנטית. הניסוי עושה שימוש בניתוח זיקה של מישורי קרח מבוסס פלורוצנציה כדי לבחון כיצד AFPs מקיימים אינטראקציה עם גבישי קרח.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביוכימיה
- קריוביולוגיה
- כימיה של חלבונים
רקע
- חלבוני נוגדי קיפאון מונעים צמיחת קרח על ידי קישור למישורי קרח ספציפיים.
- טכניקות מבוססות פלואורסצנציה משפרות את הוויזואליזציה של אינטראקציות אלו.
- המחקר עושה שימוש בשיטת תגיית קרח (ice-etching) משופרת לצורך אנליזה.
- הבנת AFPs עשויה להיות בעלת הש implies בתחומים שונים, כולל שימור מזון וקריו-שימור.
מטרת המחקר
- להדמיות של קישור AFPs למישורי קרח.
- לשיפור ההבנה של התפקוד של AFP.
- לניצול פלואורסצנציה לצורך דימות משופר של גבישי קרח.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- גידול גבישי קרח בודדים עבור קישור AFP.
- שימוש במקטבים מצולבים לקביעת אוריינטציית הגביש.
- סמיגת גבישי קרח על גבי "אצבע קרה" (cold finger) עם בקרת טמפרטורה.
- טבילה של הגבישים בתמיסת AFP פלואורסצנטית לצורך קישור.
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של מישורי קרח הקשורים ל-AFPs.
- הדגמת יעילות הפלואורסצנציה בדימות.
- מתן תובנות לגבי מנגנוני הקישור של AFPs.
- חשיפת המאפיינים המבניים של קרח הקשור ל-AFP.
מסקנות
- המחקר מאשר את התועלת של טכניקות מבוססות פלואורסצנציה בביולוגיה של הקפאה (cryobiology).
- הממצאים משפרים את ההבנה של אינטראקציות של חלבוני נוגדי קיפאון.
- יישומים פוטנציאליים לשיפור שיטות של שימור בהקפאה (cryopreservation).
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למקבלי החלטות
הבנת סגוליות הקישור של חלבוני נוגד קיפאון (AFP) למישורי קרח מספקת תובנות מכניסטיות לתכנון חומרי הגנה מפני קיפאון (cryoprotectants) ביישומים ביו-פארמצבטיים. מדידת זיקה למישורי קרח מבוססת פלואורסצנציה (FIPA) מאפשרת ויזואליזציה מהירה וברזולוציה גבוהה של אינטראקציות בין חלבונים לקרח, ובכך תומכת בתיקוף מטרות בביולוגיה של הסתגלות לקור. גישה זו מסייעת בהפחתת סיכונים בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי הבהרת קשרי מבנה-תפקוד החיוניים להנדסת חלבונים וליציבות הפורמולציה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של מנגנוני קישור קרח של AFP כדי לתקף היפותזות לגבי פני השטח הקושרים קרח.
- ערך תפעולי: משתמש בסימון פלואורסצנטי לניטור בזמן אמת של ספיחת חלבונים מבלי לשנות את ספציפיות הקישור.
- ערך חיזוי: תומך בניתוח השוואתי של מספר איזופורמים של AFP על גבי גביש קרח בודד להערכת כפילות תפקודית או התמחות.
פיתוח ובדיקת סריקה של מערך בדיקה
- ערך מדעי: יוצר תבניות קישור כמותיות עם רזולוציה מרחבית עבור מועמדים ל-AFP תחת תנאי התגבשות מבוקרים.
- ערך תפעולי: מפיק תמונות ברורות יותר בזמן קצר יותר בהשוואה לשיטות תג' ice-etching מסורתיות, ובכך משפר את תפוקת הבדיקה ואת השחזוריות שלה.
- יכולת הרחבה (Scalability): מאפשר השוואה מקבילית של AFPs עם תיוגים שונים, כדי להנחות את בחירת המועמדים המובילים בסריקות של קריו-פרוטקטורים מבוססי חלבון.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקשר בין מצבי הקישור של AFP לפעילות של עיכוב התגבשות מחדש של קרח, ובכך מספק מידע לחיזוי יעילות פרה-קלינית.
- ערך תפעולי: מאפשר הכנה של גבישי קרח עם שליטה על האוריינטציה לצורך סטנדרטיזציה של הערכות קישור בין סדרות ניסויים שונות.
- המשכיות תרגומית: תומך באופטימיזציה של AFPs המונחית על ידי מבנה, לשימוש בתהליכי קריו-שימור של תאים ורקמות.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
FIPA משתלבת ברצף הגילוי החל מאימות המטרה ועד לאופטימיזציה של תרכובות מובילות, ובמיוחד עבור תכשירים ביולוגיים הדורשים יציבות בשרשרת קירור או ויסות של אינטראקציות עם קרח.
- ביולוגיה של גילוי: בוחן היפותזות טיפוליות הנוגעות לספציפיות של AFP וזיהוי מישור הקרח באמצעות הדמיה ישירה.
- מוכנות הבדיקה: מספק תוצרים כמותיים הדירים בנוגע לתפוסת מישור הקשירה, לתמיכה בהחלטות go/no-go בהנדסת חלבונים.
- אנליטיקה: מספק מדדי עוצמת פלואורסצנציה והתפלגות מרחבית להשוואה בין וריאנטים של AFP בתנאים זהים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין אפיון אתר הקשירה לתוצאות פונקציונליות בעיכוב צמיחת קרח, דבר הרלוונטי לפיתוח פורמולציות.
- שימוש חוזר ארגוני: מכונן פלטפורמה סטנדרטית להערכת מועמדים ל-AFP במסגרת פרויקטים מרובים המתמקדים במנגנוני קריו-הגנה או באינטראקציה עם קרח.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתפקוד AFP על ידי הפחתת העמימות בהקצאת אתרי קשירה.
- ערך תפעולי: מייצב את פרוטוקולי הכנת הדגימות והדימיג כדי להבטיח הדירות בין מעבדות.
- ערך אסטרטגי: מאיץ את זיהוי המועמדים המובילים על ידי אפשרות להשוואה מהירה של איזופורמים של AFP, ובכך מקצר את הזמן להשגת תובנות בשלבי הגילוי המוקדמים.
- השפעה על פורטפוליו: מספק בסיס לתיעדוף מותאם סיכונים של מועמדים מבוססי AFP, בהסתמך על מעורבות מטרה מאומתת והפחתת סיכונים מנגנונית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בסימון פלואורסצנטי של חלבונים, צמיחת גבישי קרח ומיקרוסקופיה באור מקוטב.
- תלוי בציוד עם בקרת טמפרטורה, מערכות ואקום ומערכות דימוי UV-visible עם מסננים מתאימים.
- מחייב סטנדרטיזציה של כיוון גבישי הקרח ויצירת חצי-כדור לצורך הערכות קישור השוואתיות.
- כולל אופטימיזציה של ריכוז ה-AFP וזמן האינקובציה כדי למנוע ספיחה לא ספציפית או רוויית אות.
- מוגבל לחלבונים המסומנים פלואורסצנטית; יש לתקף אמפירית את בחירת הסימון כדי להבטיח שאינה משבשת את התנהגות הקישור הטבעית.
