מלמטה למעלה ופרוטאומיקה Shotgun לזהות מקיף שבלול Proteome

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשיג את המספר הגדול ביותר של זיהויי חלבונים מהאפיתל החושי של השבלול באמצעות טכניקות פרוטאומיות שונות. זה מושג על ידי בידוד שבלול, אפיתל חושי מעכברים בוגרים וסוניקט במאגר ליזה כדי להשיג חלבון כשלב שני. אסטרטגיות עיכול שונות מיושמות על ליזאט שלם או על ליזאט חלבון מפוצל על מנת לשפר את כיסוי רצף הפפטידים והחלבונים.

לאחר מכן נעשה שימוש בטכניקות הפרדה שונות, כולל חילופי קטיונים חזקים וכרומטוגרפיה של פאזה הפוכה כדי להפחית את מורכבות הדגימה לפני ניתוח מפרט המסה. התוצאות מראות זיהוי של מספר רב של חלבונים ממברניים ומסיסים עבור אפיתל חושי של שבלול עכבר על ידי שימוש בגישות פרוטאומיקה מרובות וספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו מיקרו-מערך נוגדנים ואלקטרופורזה דו-ממדית של ג'ל הוא שמספר רב של חלבונים מסיסים וממברנים מזוהים, ובכך מגדיל את נתוני פרוטאום השבלול.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי סמנים ביולוגיים הקשורים לליקויי שמיעה וקריעה, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כגון זיהוי סמנים ביולוגיים הקשורים לגיל וסרטן השד או הריאות. ניתן ליישם שיטה זו גם לחקר דגימות ביולוגיות אחרות כגון דם. הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר צפינו במערך הנתונים הפרוטאומי המוגבל הזמין מהאוזן הפנימית של היונקים, ובפרט, במספר המוגבל של חלבוני הממברנה שזוהו לפני תחילת הליך זה.

יש לבודד את האפיתל החושי של השבלול מעכברים 30 ביום שלאחר הלידה. לאחר שטיפת הרקמה עם מאגר פוספט אחד, הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר ליזה לרקמה ועשה סוניקציה של התערובת למשך 30 שניות על קרח באמצעות ביתור קולי. מצננים את הליזאט על קרח למשך דקה אחת בין כל סוניקציה, ואז סוניקציה של הדגימה בסך הכל שלוש פעמים.

Centra התיכה את המתלים ב-16,000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. בסיום, שמור את הסופרנטנט לעיכול. לאחר מכן, הוסיפו תמצית חלבון שבלול של 30 מיקרוליטר ישירות למסנן ספין של 30K וערבבו עם 200 מיקרוליטר של אוריאה מולרית שמונה בצנטריפוגת Riss HCL.

התערובת בחום של 14, 000 פעמים גרם למשך 15 דקות. בסיום, יש לדלל את התרכיז ב -200 מיקרוליטר של תמיסת אוריאה שמונה טוחנת ולחזור על הצנטריפוגה באותם תנאים כמו קודם. לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטר של 10 XI אוטו אצטמיד, ו -90 מיקרוליטר של תמיסת אוריאה מולרית לתרכיז במסנן ובמערבולת למשך דקה אחת.

לאחר הנחת מסנן הסיבוב במדף מיקרו צנטריפוגה, יש לדגור במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר בחושך לאחר צנטריפוגה ב-14, 000 פעמים G למשך 10 דקות ב-0.1 מיקרוגרם למיקרוליטר של אנדו פרוטאז ly C ביחס של אחד ל-50 אנזים לחלבון, ולדגור את התערובת למשך הלילה ב-30 מעלות צלזיוס. בסיום, הוסיפו 40 מיקרוליטר של תמיסת אמוניום ביקרבונט 100 מילי-מולרית ליחידת המסנן וצנטריפוגה את התערובת ב-14,000 פעמים G למשך 10 דקות לאחר חזרה על השלב הקודם, שטפו את יחידת המסנן עם 40 מיקרוליטר של שמונה אוריאה מולארית. לאחר מכן שטפו את יחידת המסנן פעמיים עם 40 מיקרוליטר מים מילי Q.

לאחר שיחידת המסנן נשטפה שלוש פעמים עם 100 מיקרוליטר של תמיסת אמוניום ביקרבונט של 50 מילי-מולרית הוסף 0.4 מיקרוגרם למיקרוליטר טריפסין ביחס של 1 ל-100 אנזים לחלבון, ודגירה על התערובת למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, יש להוציא את הפפטידים הטריפטיים על ידי הוספת 40 מיקרוליטר של תמיסת אמוניום ביקרבונט של 50 מילי-מולרית ליחידת המסנן ולצנטריפוגה של התערובת ב-14,000 פעמים G למשך 10 דקות. לאחר מכן חזור על שלב זה פעם נוספת.

בשלב זה, הזרקו 50 עד 100 מיקרוגרם של דגימת חלבון מעוכלת על עמודת חילופי קטיון חזקה בגודל 200 על 2.1 מילימטר וחמישה מיקרומטר כדי להפריד את הפפטידים, עקוב אחר שברי הפפטיד ב-280 ננומטר ואסוף את השברים במרווחים של שתי דקות. בעזרת אספן שברים, ואז יבש את השברים ברכז ואקום. בסיום, יש לאחסן את השברים המיובשים במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שהם מוכנים לשימוש לכרומטוגרפיה נוזלית.

ניתוח ספקטרומטריית מסה טנדם. בגישה אחרת, נעשה שימוש בפיצול ללא ג'ל כדי להפריד את תערובת החלבון. לאחר שחלבון השבלול הסופרנטנט הותפזר על ידי משקעי אצטון, הוסף 30 מיקרוליטר של מאגר דגימה של חמישה x לחלבון המומלח שהושעה בעבר ב-112 מיקרוליטר של מי Milli Q.

לאחר מכן, הוסיפו שמונה מיקרוליטרים של DTT מולארי אחד וחממו את התערובת בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות כדי להפחית את קשרי החלבון דיסולפיד. לאחר החימום הניחו לתערובת להתקרר. הוסף שמונה מיליליטר של מאגר רץ למאגר האנודה, 150 מיקרוליטר של מאגר רץ לתא איסוף הדגימות, ושישה מיליליטר של מאגר רץ למאגר הקתודה.

לאחר עומס זה, 150 מיקרוליטר מתערובת חלבון השבלול לתוך תא טעינת הדגימה, באמצעות מחסנית טריס אצטט של 8% עם טווח מסה של 3.5 עד 150 קילודלטון. לאחר תחילת הריצה, אסוף את הדגימה מתא איסוף הדגימות בכל מרווח הפסקה במכשיר באמצעות פיפטה והוסף לצינור מיקרו מתויג טרי. לאחר מכן שטפו את תא האיסוף פעמיים עם 150 מיקרוליטר של מאגר רץ והשליכו.

בעקבות אלקטרופורזה של ג'ל 1D של השברים ללא ג'ל. הוסף כל שבר בודד ישירות ליחידת סינון 30 K. לאחר מכן מערבבים כל שבר עם 200 מיקרוליטר של שמונה אוריאה מולרית ב-tris HCL לאחר צנטריפוגה ב-14,000 פעמים G למשך 25 דקות, מוסיפים 10 מיקרוליטר של 10 XI oto אצטמיד בתמיסת אוריאה לתרכיז בכל יחידת סינון ומערבולת למשך דקה אחת.

לאחר הנחת מסנני הסיבוב במדף מיקרו צנטריפוגה, דגרו את הדגימות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר מכן, הוסף 0.1 מיקרוגרם למיקרוליטר של LY C ליחס אנזים לחלבון של אחד עד 50 ליחידות הסינון לאחר דגירה לילית ב-30 מעלות צלזיוס, הוסף 40 מיקרוליטר של תמיסת אמוניום ביקרבונט 100 מילי-מולרית למסנני הספין וצנטריפוגה את הדגימות ב-14,000 פעמים G למשך 10 דקות לאחר חזרה על השלב הקודם פעם אחת, שטפו את מסנני הספין שלוש פעמים עם 100 מיקרוליטר של תמיסת אמוניום ביקרבונט של 50 מילי-מולרית הוסיפו 0.4 מיקרוגרם למיקרוליטר טריפסין ביחס של אחד ל -100 אנזים לחלבון לאחר הכביסה הסופית. לאחר הדגירה של הדגימות למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס, יש להוציא את פפטידי הטריפטיכון מכל יחידת סינון על ידי הוספת 40 מיקרוליטר של תמיסת אמוניום ביקרבונט 50 מילי-מולרית וצנטריפוגה, הדגימות ב-14,000 פעמים G למשך 10 דקות.

לאחר חזרה על זה, שלב אחד פעם, נתח את הדגימות על ידי ספקטרומטריית מסה טנדם של כרומטוגרפיה נוזלית. נעשה שימוש בשני הליכי עיכול כפולים. הראשון היה עיכול טריפטיכון, ואחריו עיכול שני עם טריפסין, אשר אוחדו בחלוקה על עמודת חילופי קטיון חזקה ל-18 שברים, ונותחו על ידי ספקטרומטריית מסה טנדם של כרומטוגרפיה נוזלית ננו.

בסך הכל זוהו 1,485 חלבונים עם FDR של 1% בעת ביצוע ספקטרומטריית מסה טנדם של כרומטוגרפיה נוזלית בהפעלה אחת. שימוש בגישה ניסיונית זו. מבין החלבונים שזוהו, 324 ו-258 חלבונים סווגו במיטוכונדריון ובממברנת הפלזמה, בהתאמה.

הליך העיכול הכפול השני כלל עיכול ליס C, ואחריו עיכול טריפסין. כל תקציר נטען בנפרד והופרד בעמודת חילופי הקטיונים החזקים ל-18 שברים, ונותח על ידי ספקטרומטריית מסה טנדם של כרומטוגרפיה נוזלית ננו. תוצאות העיכול של LY C וטריפסין הניבו בסך הכל 3,503 חלבונים עם 1% FDR.

בנוסף, 605 ו-617 חלבונים סווגו במיטוכונדריון ובממברנת הפלזמה בהתאמה. גישה זו סיפקה את המספר הגדול ביותר של מזהי חלבונים הקשורים לממברנה. ניתוח כפול של ה- LY C והטריפסין.

שברים הראו שיותר מ-65 מהחלבונים שזוהו חולקו בין הניסויים. עם זאת, היו גם חלבונים שזוהו לאחרונה בניתוח השכפול. הפפטידים והחלבונים הנוספים זוהו עקב שינויים קטנים בכרומטוגרפיה, ולכן הובילו לפפטידים שונים לפיצול.

ג'ל כתם כסף הוכן כדי להמחיש את התוצאות מפיצול ללא ג'ל כפי שמוצג באיור. כאן, הג'ל הראה הפרדת חלבון על ידי הגדלת המשקל המולקולרי עבור כל שבר עוקב. לכן, 12 השברים הנוזליים נטולי הג'ל עוכלו בשתי גישות עיכול רב-פנים שונות ונותחו על ידי ספקטרומטריית מסה טנדם של כרומטוגרפיה נוזלית.

גישת העיכול הראשונה בוצעה באמצעות עיכול טריפסין כפול, שהוביל לזיהוי של 2,165 חלבונים עם FDR של 1% בעת ביצוע ספקטרומטריית מסה טנדם של כרומטוגרפיה נוזלית בהפעלה אחת. בניסוי זה, 516 ו-399 חלבונים סווגו במיטוכונדריון ובממברנת הפלזמה בהתאמה. גישת העיכול השנייה בוצעה באמצעות אנדו פרוטאינאז ly C ואחריו עיכול טריפסין, כרומטוגרפיה נוזלית חד-פעמית.

ניתוח ספקטרומטריית מסה טנדם זיהה 2,211 חלבונים עם 1% FDR. גישה זו הראתה מספר דומה של חלבונים הקשורים לממברנה כמו בעת שימוש בגישת טריפסין טריפסין, נתוני הפרוטאומיקה של ספקטרומטריית המסה הופקדו בקונסורציום חילופי הפרוטאומים עם מזהה מערך הנתונים PXD 0 0 0 2 3 1. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להימנע מזיהום בכל שלב ולשמור על הרקמה על קרח בעת ביצוע מיצוי חלבון כדי למנוע פירוק חלבון.