ניתוח Craniofacial המורפוגנזה בדג הזברה שימוש 4D מיקרוסקופיה confocal

המטרה הכוללת של הליך זה היא להתבונן ולאפיין את תנועות קשת הלוע בראש דג הזברה המתפתח. זה מושג על ידי הטמעה ראשונה של עובר דג זברה טרנסגני בג'ל אקרוסט הרדמה. השלב השני הוא להרכיב את העובר המוטבע באגרוז בטיפה של מתיל צלולוז על שקופית מיקרוסקופ.

לאחר מכן, העובר נאטם בין שתי שקופיות מיקרוסקופ עם שומן ואקום. בסופו של דבר, מיקרוסקופיה קונפוקלית של זמן-lapse משמשת כדי להראות הבדלים בין סוג בר לדג זברה מוטנטי ואת התנועות המורפוגנטיות של קשתות הלוע. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות הדמיה סטטיות הוא שהיא לוכדת את התפתחות קשת הלוע בזמן אמת, ומאפשרת לחוקר להתבונן ישירות בתנועות הרקמה הקריטיות למורפוגנזה.

כדי לגרום להחלקת כיסוי מגושר, דבק סופר, כיסוי בגודל 22 על 22 על כל קצה של זכוכית כיסוי בגודל 24 על 60. משאירים את האמצע פנוי. הכינו רווקים לעוברים בני פחות מיום.

כפול לעוברים בני יום עד ארבעה ימים או משולש לעוברים, חמישה ימים ומעלה. ועבור כל דגימה, השתמש בשני פתקי כיסוי מגושר. כעת מלאו מזרק של 10 מיליליטר בשומן ואקום גבוה.

הכינו חומר הרדמה טרי בנוזל 0.2% ושמרו על בלוק חימום של 42 מעלות צלזיוס. כדי לפרק ידנית את העוברים הטרנסגניים שלא בקעו, קרעו לאט את הקוריאן עד לשחרור העובר. כעת העבירו את העוברים המצופים למדיה נקייה המכילה MS 2 22 ואסתטית.

להכנת החלקת כיסוי מגושרת דחף לאט את שומן הוואקום החוצה מהמזרק, ויוצר חרוז רציף חלק הצמוד ובתוך הגשרים וקצה הכיסוי מחליק. מורחים עיגול של 4% מתיל צלולוז באמצע הגשר כדי לכסות החלקה. כאשר העובר מורדם, משוך אותו לתוך פיפטה מזכוכית.

החזק את הפיפטה למעלה בצורה אנכית כדי לאפשר לעובר לשקוע לתחתית הנוזל בפיפטה. לאחר מכן העבירו את הפיפטה לתמיסת האגרו ואפשרו לעובר ליפול לתוך הארוס מבלי להוציא את הנוזל. משוך תמיסת אגרו ואת העובר לתוך הפיפטה.

לאחר מכן הוציאו את העובר בטיפה של תמיסת ארו. על גבי המתיל צלולוז. דחוף את העובר כלפי מטה על המתיל צלולוז וכוון את העובר כרצונך להדמיה כדי לאטום את הדגימה.

הנח החלקת כיסוי מגושרת אחת על גבי המותקן הפונה כלפי מטה. הפעל לחץ אחיד על שני צידי החלקות הכיסוי הסנדוויץ' עד שהגשרים יוצרים מגע ישיר ואטמי טיפת האגרוס לשתי החלקות הכיסוי. ודא שהעובר מכוון כראוי.

שפשפו מוליך עץ לאורך הזכוכית כדי להחליק סדקים ופערים במהירות שומן הוואקום. נגב את כל השומן העודף מהקצוות. הפעל את המיקרוסקופ הקונפוקלי וכל מכשירי לייזר חיצוניים.

הפעל גם את המחשב המחובר למיקרוסקופ הקונפוקלי ובחר מערכת הפעלה ותוכנת הדמיה קונפוקלית. לאחר מכן, הורד את פלטפורמת ההיערכות של המיקרוסקופ הקונפוקלי והזיז את עדשות האובייקט ממקומן. החלף את ברירת המחדלtagה באלקטרוני מחומם stagה.

הפעל את הבקר לחימום stagהגדר את הטמפרטורה ל -29.5 מעלות צלזיוס. הנח את הדגימה המותקנת על הבמה המחוממת. הזז את עדשת האובייקט של 20x למקומה והרם את פלטפורמת ההיערכות.

לאחר מכן הפעל את פולט האור הנראה ומרכז את ראש העובר בשדה הראייה. כדי להפעיל את ערוצי הקרינה, בחר את אורך הגל הפלואורסצנטי שיש לזהות ובחר טבלאות חיפוש צבע עבור כל ערוץ. עבור כל ערוץ פלואורסצנטי, הגדר את עוצמת הלייזר ל-10.0 ואת מתח מכפיל הצילום בין 600 ל-700.

כדי להקטין את הרקע ולהגדיל את המידע הפלואורסצנטי שנאסף, הגדר את הממוצע לשניים או ארבעה ואת עומק הסיביות ל-16 סיביות. הפעל את מודולי מחסנית ZS וסדרות זמן. כוונן את חור הסיכה במידת הצורך.

הגדר את מרווח הזמן ואת אורך הניסוי. סובב את המצלמה למצב חי. כוונן את המיקוד והגבר את עוצמת הלייזר במידת הצורך.

לראות פלואורסצנטיות. הגדר את הזום הדיגיטלי ל-0.6 לתצוגה רחבה יותר. אם תרצה.

מקם את הבמה כך שכל המבנים המעניינים נראים לעין ויש מקום בשדה הראייה לצמיחה. מיקוד גבי וקדמי דרך העובר לגבולות העליונים והתחתונים של הקרינה. הגדר את מיקומי פרוסת הזאק הראשונה והאחרונה לפחות 100 מיקרומטר או יותר מעבר לגבולות אלה.

לאחר מכן, הגדר את טבלת חיפוש התצוגה למחווני טווח כך שהמבנים הפלואורסצנטיים יופיעו בגוון אפור ושאר השדה צריך להיות כחול או שחור. במידת הצורך, הגדל את מתח מכפיל הצילום לרמה ממש מתחת למקום שבו מופיעים פיקסלים אדומים רוויים. אם מבנים פלואורסצנטיים נראים אדומים, הפחיתו את עוצמת הלייזר או את הרווח עד שהם הופכים לגוון אפור.

במידת הצורך, התאם את ההיסט. אז אזורים מחוץ לדגימה הם כחולים. הגדר את הקוטר הקטן ביותר המאפשר לאסוף תמונות בזמן.

יש להגדיר תמיד את מרווח ה-Z למרחק האופטימלי המוצע עבור קוטר חור הסיכה, לבצע סריקות קצרות כדי לבדוק את ההגדרות, תמיד תוך שימוש בעוצמת הלייזר הנמוכה ביותר האפשרית. כעת הפעל את הניסוי למשך הזמן הרצוי. לאחר מכן, הסר את העובר מהשלב המחומם והפריד לאט את החלקות הכיסוי, טבל את המכסה, החליק והעובר בצלחת פטרי של 30 מילימטר.

בעזרת פיפטה מזכוכית, שטפו בעדינות את העובר מהחלקה של הכיסוי והסירו את פתק הכיסוי מצלחת הפטרי. הכניסו את העובר לאינקובטור של 28.5 מעלות צלזיוס כדי להמשיך להתפתח. בסוף הניסויים, צלמו תמונות זאק בודדות של עוברים אחים רכובים על אגרוס שהיו בשלבים דומים לדגימה בתחילת הניסויים, אך גודלו באינקובטור EM ו-28.5 מעלות צלזיוס.

מדוד את קשתות הלוע לפי הצורך באמצעות תוכנה קונפוקלית או תוכנת עיבוד הדמיה אחרת בעוברים מסוג בר. בעקבות אוכלוסיית פסגת העצבים, קשתות הלוע מתארכות לאורך AEs הגחוניים האחוריים והגביים הקדמיים תוך כדי תנועה בכיוון הרוסטרלי. בקצה הקדמי שלה, קשת הלוע הראשונה יוצרת תחומים מקסילריים ולסת תחתונה המופרדים על ידי התנועות המורפוגנטיות המרכזיות של אקטודרם הפה מופרעות מאוד במוטציות מוחלקות.

כאן קשת הלוע השביעית לא מצליחה לנדוד כדי לחפוף עם קשתות קדמיות יותר עד 48 שעות לאחר ההפריה. לדג הזברה SM חמש מוטציות יש פגמים רבים בפנים הגולגולת. בתמונות קונפוקליות סטטיות אלה.

איחויים בתחומי הגחון של הקשת השנייה והשלישית ניכרים עד 32 שעות לאחר ההפריה. באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של זמן-lapse, אנו מנתחים את המורפוגנזה של קשתות הלוע. בסמד חמישה איחוי מוטאנטים בין הקשת השנייה והשלישית מופיעים ראשונים 32 שעות לאחר ההפריה.

עקבי עם הניתוח הסטטי. בעוד שהביטוי של בני משפחת PDGF מרמז על כך שהוא עשוי להיות מעורב באופן נרחב במורפוגנזה של קשת הלוע, תנועת הקשתות האחוריות נראית תקינה. במוטציות P-D-G-F-R-A, המורפוגנזה של קשת הלוע הראשונה היא שנראית משובשת במיוחד.

הליך זה מתאים לטכניקות נפוצות אחרות של דג זברה כגון הזרקת מורפו או יצירת פסיפסים גנטיים. ניתוחי זמן-lapse מאפשרים ניתוח ישיר של ההשלכות של מניפולציות אלה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע הדמיית זמן lapse in vivo של עוברי דג זברה טרנסגניים על ידי הרדמה והרכבה נכונה של דגימות וקביעת פרמטרים אידיאליים למיקרוסקופיה קונפוקלית.