Name: ניתוח Craniofacial המורפוגנזה בדג הזברה שימוש 4D מיקרוסקופיה confocal (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: למד את שיטת מיקרוסקופיית confocal טווח-זמן לניתוח מורפוגנזה קרניו-פניאלית בדגי זברה. השיטה מאפשרת תצפית בזמן אמת על תנועות הקשתות הלועיות והשוואה בין עוברים פראיים למוטנטים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים למליסה גריפין וג&#39;נה Rozacky לטיפול דגי המומחה שלהם. הודות PDM EGN לכתיבת סיוע, נדיבות, וסבלנות. עבודה זו נתמכה על ידי NIH / NIDCR R01DE020884 לJKE.

1. גידול בעלי חיים וMutant אללים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל ולהרבות דג הזברה כמתואר 21. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אללים מוטציה דג הזברה השתמשו במחקר זה היו PDGFRA b1059 16, B1100 smad5 22, וb577 SMO 23. מקורות לזני דג הזברה אלה כוללים Zirc. </li></ol> 2. הכנה של פתרונות ומיישמת הערה: כל הפתרונות וכלים יכולים להתבצע מראש ולאחסן לשימוש עתידי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך תקשורת עובר (EM) כפי שתואר 21 בעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 4 גר &#39;/ ליטר MS-222 (Tricaine). לפזר 4 פוספט גרם disodium (Na 2 HPO 4) ב450 מיליליטר מים סטריליים. הוסף 2 גרם של MS-222 לפתרון. התאם ל-pH בתוך 7.0-7.2. מוסיף מים סטריליים להיקף כולל של 500 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: הפוך שמן ציפורן 4 גר &#39;/ ליטר. שוקל שמן ציפורן טהורה 0.2 גרם בצינור חרוטי 50 מיליליטר. הוספת EM להיקף כולל של 50 מיליליטר. חנות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך methylcellulo 3%se. להביא 50 מיליליטר של EM + M 0.1 HEPES לרתיחה. מסירים מאש. מערבבים ב1.5 methylcellulose גרם עד שהתמיסה אחידה. חנות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך agarose 0.2%. הוסף 0.1 agarose גרם ל50 EM מיליליטר. אביא אותם לרתיחה במיקרוגל או על פלטה חמה ולוודא כי agarose נמס. Aliquot לתוך 500 כרכי μl בmicrocentrifuge צינורות ולאחסן ב 4 ° C. הערה: ניתן להתאים כרכים בהתאם לצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך דוקרנים נימים. מניחים ירידה של דבק סופר בתוך צינור נימים מזהה 0.9 מ&quot;מ. הכנס אורך 4-5 סנטימטר של קו 6 £ מבחן monofilament דיג בתוך צינור הנימים כך שכ 3-4 מ&quot;מ של קו משתרע מעבר לקצה הצינורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע שני coverslips גישר לדגימה. Super-דבק 22 x 22-1 מכסה זכוכית על כל קצה של מכסה זכוכית 24 x 60-1 עוזבת באמצע בחינם. הפוך רווקים (1 מכסה זכוכית קטנה לסוף) לעוברים פחות מיום ישן, זוגות (2 כוסות כיסוי קטנות על גב אחד את השני לסוף) לעוברים 03:59 דays הישן, או משולשים (3 כוסות כיסוי קטנות על גב אחד את השני לסוף) לעוברים חמישה ימים ומעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאי מזרק 10 מיליליטר עם גריז ואקום גבוה. הערה: גריז אבק משמש כחומר איטום על מנת למנוע התייבשות של דגימות על פני תקופות זמן ארוכות, ויש לו פוטנציאל נמוך לרעילות בהשוואה לחומרי איטום תנודתי יותר. </li></ol> 3. עוברי דג הזברה הרכבה למיקרוסקופיה confocal (ראה איור 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום הרדמה. ממסים aliquot של agarose 0.2% על ידי במיקרוגל ב20 מרווחי שניות עד שנוזלים לחלוטין. מערבבים 8 μl של MS-222 ל192 μl של agarose 0.2% או 5 μl של שמן ציפורן 4 גר &#39;/ ליטר ל195 μl של agarose 0.2%. לשמור בבלוק חימום 42 מעלות צלזיוס. הערה: חשיפה ארוכה ל-MS-222 גורמת לעיכובים התפתחותיים חזקים יותר משמן ציפורן עושה בדג זברה עוברי 24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת צורך: ידני dechorionate עוברים מהונדסים ביצה שלא נולדו כדי להיות מנותחים רק לפני הניתוח. בעזרת מלקחיים, te לאטar סיסית פתוח עד העובר הוא שוחרר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את עוברי דג הזברה. הוסף 1 מיליליטר של מניית 4 גר &#39;/ ליטר של MS-222-24 מיליליטר של תקשורת עובר. לחלופין, להוסיף 390 μl של שמן ציפורן 4 גר &#39;/ ליטר ל24 מיליליטר מים דגים 24. הערה: מעשי שמן ציפורן לאט כל כך לבצע שלב זה לפחות 15-20 דקות לפני מיקרוסקופיה הזמן לשגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח טיפת שומן ואקום סביב מרחב מרכז coverslip גישר הפונה כלפי מעלה. לאט לאט לדחוף את גריז הוואקום מהמזרק, מה שהופך את חרוז חלק, רציף שנמצא בסמוך ולפנימי של הגשרים וקצה coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מורחים מעגל methylcellulose 4% באמצע coverslip לגישור באמצעות המוליך עץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את העובר להיות צילם. כאשר העובר הוא מורדם לצייר אותו לתוך כוס טפטפת. החזק את פיפטה בצורה אנכית על מנת לאפשר לעובר לשקוע לתחתית של הנוזל בפיפטה. הזז את פיפטה לתוך פתרון agarose ולאפשר לעובר לרדתלagarose. אל תגרש את הנוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הדגימה. צייר כמה פתרון agarose ואת העובר לתוך פיפטה. לגרש את העובר בירידה של פתרון agarose על גבי methylcellulose. השתמש בפוקר נימים לדחוף את העובר כלפי מטה על methylcellulose ולכוון את העובר כרצוי להדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום את הדגימה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים coverslip גישר אחד על גבי רכוב אחד, פונה כלפי מטה. לחול גם לחץ על שני הצדדים של את coverslips דחוק עד הגשרים ליצור קשר ישיר וחותמות ירידת agarose לשני coverslips. ודא שהעובר הוא בכיוון נכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשפשף המוליך עץ לאורך הזכוכית כדי להחליק את סדקים ופערים בחרוז גריז ואקום. למחות שומן עודף מהקצוות. </li></ol></li></ol> 4. זמן לשגות Confocal הדמיה של עוברי דג הזברה מהונדסים (פרוטוקול זה כבר מותאם למיקרוסקופ confocal Zeiss LSM 710ing תוכנת הדמיה ZEN, והוא יכול להיות שונה לשימוש עם מערכות אחרות.) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל ציוד. הפעל מיקרוסקופ confocal וכל מכשירי לייזר חיצוניים. הפעל את המחשב מחובר למיקרוסקופ confocal. תוכנת הדמיה confocal הפתוח ובחר &quot;מערכת התחל&quot; כדי להפעיל את פקדי רכישת תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הבמה מחוממת. מנמיכים את פלטפורמת האחסון הזמני של מיקרוסקופ confocal ולהעביר את העדשות אובייקטיביות מחוץ לעמדה. החלף את שלב ברירת המחדל עם במה מחוממת אלקטרונית. הפעל את הבקר לבמה המחוממת ולהגדיר את הטמפרטורה ל29.5 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את הדגימה בשדה הראייה. הנח את הדגימה רכוב על הבמה. להעביר העדשה האובייקטיבית 20X למצב ולגדל פלטפורמת הבימוי. הפעל את פולט האור הנראה ולהסתכל דרך העיני. מרכז את ראשו של העובר בשדה הראייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר הגדרות ניסוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל ערוצי הקרינה על ידי בחירהאורך גל הניאון כדי להיות מזוהה ולבחור שולחנות בדיקת צבע (LUT) עבור כל ערוץ. במידת צורך, השתמש בפקדים ידניים בתוכנה כדי להפעיל את הלייזרים הנדרשים (למשל 561 ננומטר עבור RFP). עבור כל ערוץ הקרינה, הגדר את עוצמת הלייזר ל10.0 והמתח מכפיל (HV או רווח) בין 600-700. הגדר את המיצוע עד 4 ומעט עומק ל16 קצת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המודולים סדרת Z-מחסנית וזמן. הגדר את חריר לרזולוציה-Z 5 מיקרומטר או קטן יותר, ולהגדיר את Z-המרווח למרחק האופטימלי שהציע. הערה: באופן כללי, 5 ברזולוציה Z מיקרומטר מאפשרת לכל תמונת Z-מחסנית להיות שנאספו במהירות מספקת ל&quot; צילום &quot;של העובר בנקודת זמן מסוימת גם בעת פתרון תאים בודדים. הורדת המיצוע גם מפחיתה את כמות הזמן לכל תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את מרווח הזמן הרצוי בין תמונות (בדרך כלל 10-20 דק &#39;) ואת האורך הכולל של הניסוי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר positionalמידע. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המצלמה למצב חי. התאם את המיקוד ולהגביר את עוצמת לייזר במידת צורך כדי לראות הקרינה. הגדר את הזום הדיגיטלי ל0.6 לראייה רחבה יותר, אם תרצה בכך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את הבמה באופן שכל המבנים של עניין גלויים ויש מקום בשדה הראייה לdorsally תולדה וanteriorly. תתמקד בעובר לגבולות העליונים ותחתונים של הקרינה. הגדר את העמדות הפרוסה Z-המחסנית הראשונה ואחרונים לפחות 100 מיקרומטר או יותר מעבר לגבולות אלה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייעל את עוצמת הקרינה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את LUT התצוגה לטווח מחוון. מבני ניאון אמורים להופיע כעת לבנים, ושאר שדה הראיה צריך להיות כחול (אין זיהוי) או שחורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדל HV / רווח לרמה ממש מתחת איפה רווי פיקסלים (אדום) יופיעו. במידת צורך, להתאים קיזוז כך רוב הרקע לא מזוהה (כחול). הערה: קטן יותר בקוטר חריר ועוצמת לייזר גדלה גם לשפר def תמונהinition, אבל עוצמת לייזר חייבת להישמר נמוכה כדי לשמור על רקמות חיות. HV / רווח גדל וקוטר חריר (&lt;מיקרומטר 5) הם בדרך כלל עדיפים על עוצמת לייזר מוגברת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את קוטר חריר רחב מספיק כדי לאסוף תמונות מבעוד מועד, עם ממוצע של ערכות ל4. Z-המרווח תמיד צריך להיות מוגדר למרחק האופטימלי הציע לקוטר חריר. לבצע סריקות קצרות (מיצוע = 1) עם הגדרות שונות, ולהשתמש בעוצמת הלייזר המינימלית שמשיגה רזולוציה רצויה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הניסוי לכל האורך הרצוי של זמן. לאחר מכן, להסיר את העובר מן הבמה המחוממת ולהפריד לאט coverslips. להטביע את coverslip ועובר בEM בצלחת פטרי 30 מ&quot;מ. בעזרת פיפטה זכוכית לשטוף בעדינות את העובר משל coverslip ולהסיר את coverslip מצלחת פטרי. מניחים את העובר לאינקובטור C ° 28.5 להמשיך ולפתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקלו את הצמיחה. בסוף הניסוי, תיקח ZS ​​הבודדתמונות נקודת סימון של עוברי אח רכוב agarose שהועלו באופן דומה לדגימה בתחילת הניסוי, אבל הועלו בEM בחממה 28.5 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד קשתות בלוע, במידת הצורך. ניתן לבצע מדידות בכמה חבילות תוכנת confocal. מדידות מצאו כאן בוצעו באמצעות Fiji25 ידי יבוא ו-Z-מקרין קבצים. LSM של מסגרות פרטיות. </li></ol>

<ol><li>Trainor, P. A., Melton, K. R., Manzanares, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+plasticity+of+neural+crest+cells+and+their+roles+in+jaw+and+craniofacial+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Origins and plasticity of neural crest cells and their roles in jaw and craniofacial evolution.</a> Int. J. Dev. Biol. 47, 541-553 (2003).</li>
<li>Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Hedgehog+signaling+from+neural+to+oral+epithelium+organizes+anterior+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development.</a> Development. 133, 1069-1077 (2006).</li>
<li>Wada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+is+required+for+cranial+neural+crest+morphogenesis+and+chondrogenesis+at+the+midline+in+the+zebrafish+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull.</a> Development. 132, 3977-3988 (2005).</li>
<li>Roessler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+human+sonic+hedgehog+gene+cause+holoprosencephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in the human sonic hedgehog gene cause holoprosencephaly.</a> Nat. Genet. 14, 357-360 (1996).</li>
<li>Jeong, J., Mao, J., Tenzen, T., Kottmann, A. H., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+in+the+neural+crest+cells+regulates+the+patterning+and+growth+of+facial+primordia%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling in the neural crest cells regulates the patterning and growth of facial primordia.</a> Genes Dev. 18, 937-951 (2004).</li>
<li>Hu, D., Marcucio, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SHH-responsive+signaling+center+in+the+forebrain+regulates+craniofacial+morphogenesis+via+the+facial+ectoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A SHH-responsive signaling center in the forebrain regulates craniofacial morphogenesis via the facial ectoderm.</a> Development. 136, 107-116 (2009).</li>
<li>Cordero, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+perturbations+in+sonic+hedgehog+signaling+elicit+the+spectrum+of+holoprosencephaly+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Temporal perturbations in sonic hedgehog signaling elicit the spectrum of holoprosencephaly phenotypes.</a> J. Clin. Invest. 114, 485-494 (2004).</li>
<li>Westphal, H., Beachyr, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclopia+and+defective+axial+patterning+in+mice+lacking+Sonic+hedgehog+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cyclopia and defective axial patterning in mice lacking Sonic hedgehog gene function.</a> Nature. 383, 3(1996).</li>
<li>Moore-Scott, B. A., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+Sonic+hedgehog+along+the+anterior-posterior+axis+regulates+patterning+of+pharyngeal+pouch+endoderm+and+pharyngeal+endoderm-derived+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential expression of Sonic hedgehog along the anterior-posterior axis regulates patterning of pharyngeal pouch endoderm and pharyngeal endoderm-derived organs.</a> Dev. Biol. 278, 323-335 (2005).</li>
<li>Swartz, M. E., Nguyen, V., McCarthy, N. Q., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hh+signaling+regulates+patterning+and+morphogenesis+of+the+pharyngeal+arch-derived+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Hh signaling regulates patterning and morphogenesis of the pharyngeal arch-derived skeleton.</a> Dev. Biol. 369, 65-75 (2012).</li>
<li>Balczerski, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Sphingosine-1-phosphate+signaling+mutants+reveals+endodermal+requirements+for+the+growth+but+not+dorsoventral+patterning+of+jaw+skeletal+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Sphingosine-1-phosphate signaling mutants reveals endodermal requirements for the growth but not dorsoventral patterning of jaw skeletal precursors.</a> Dev. Biol. , (2011).</li>
<li>Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+signalling+in+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">BMP signalling in craniofacial development.</a> Int. J. Dev. Biol. 50, 511-521 (2006).</li>
<li>Alexander, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+roles+for+BMPs+and+Endothelin+1+in+patterning+the+dorsal-ventral+axis+of+the+craniofacial+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Combinatorial roles for BMPs and Endothelin 1 in patterning the dorsal-ventral axis of the craniofacial skeleton.</a> Development. 138, 5135-5146 (2011).</li>
<li>Zuniga, E., Rippen, M., Alexander, C., Schilling, T. F., Crump, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gremlin+2+regulates+distinct+roles+of+BMP+and+Endothelin+1+signaling+in+dorsoventral+patterning+of+the+facial+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Gremlin 2 regulates distinct roles of BMP and Endothelin 1 signaling in dorsoventral patterning of the facial skeleton.</a> Development. 138, 5147-5156 (2011).</li>
<li>Swartz, M. E., Sheehan-Rooney, K., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+a+palatogenic+gene+program+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Examination of a palatogenic gene program in zebrafish.</a> Dev. Dyn. 240, 2204-2220 (2011).</li>
<li>Eberhart, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+Mirn140+modulates+Pdgf+signaling+during+palatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis.</a> Nat. Genet. 40, 290-298 (2008).</li>
<li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PDGF+alpha+receptor+is+required+for+neural+crest+cell+development+and+for+normal+patterning+of+the+somites%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The PDGF alpha receptor is required for neural crest cell development and for normal patterning of the somites.</a> Development. 124, 2691-2700 (1997).</li>
<li>Tallquist, M. D., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+autonomous+requirement+for+PDGFRalpha+in+populations+of+cranial+and+cardiac+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cell autonomous requirement for PDGFRalpha in populations of cranial and cardiac neural crest cells.</a> Development. 130, 507-518 (2003).</li>
<li>Ho, L., Symes, K., Yordan, C., Gudas, L. J., Mercola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+PDGF+A+and+PDGFR+alpha+mRNA+in+Xenopus+embryos+suggests+signalling+from+neural+ectoderm+and+pharyngeal+endoderm+to+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Localization of PDGF A and PDGFR alpha mRNA in Xenopus embryos suggests signalling from neural ectoderm and pharyngeal endoderm to neural crest cells.</a> Mech. Dev. 48, 165-174 (1994).</li>
<li>Liu, L., Korzh, V., Balasubramaniyan, N. V., Ekker, M., Ge, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-derived+growth+factor+A+%28pdgf-a%29+expression+during+zebrafish+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Platelet-derived growth factor A (pdgf-a) expression during zebrafish embryonic development.</a> Dev. Genes Evol. 212, 298-301 (2002).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3B+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Brachydanio+rerio%29%22">The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio)</a>. , (1993).</li>
<li>Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Lovely, C. B., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmp+and+Shh+Signaling+Mediate+the+Expression+of+satb2+in+the+Pharyngeal+Arches%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Bmp and Shh Signaling Mediate the Expression of satb2 in the Pharyngeal Arches.</a> PloS one. 8, e59533(2013).</li>
<li>Varga, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+smoothened+functions+in+ventral+neural+tube+specification+and+axon+tract+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish smoothened functions in ventral neural tube specification and axon tract formation.</a> Development. 128, 3497-3509 (2001).</li>
<li>Grush, J., Noakes, D. L. G., Moccia, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficacy+of+clove+oil+as+an+anesthetic+for+the+zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The efficacy of clove oil as an anesthetic for the zebrafish, Danio rerio.</a> 1, 46-53 (2004).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Crump, J. G., Maves, L., Lawson, N. D., Weinstein, B. M., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+for+Fgfs+in+endodermal+pouch+formation+influences+later+craniofacial+skeletal+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An essential role for Fgfs in endodermal pouch formation influences later craniofacial skeletal patterning.</a> Development. 131, 5703-5716 (2004).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+derive+from+the+more+apical+daughter+in+asymmetric+divisions+in+the+zebrafish+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube.</a> Nat. Neurosci. 13, 673-679 (2010).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

מיקרוסקופיה confocal זמן לשגות היא כלי רב עוצמה לניתוח של התפתחות. הנה, אנחנו מדגימים את התועלת של השיטה בלימוד המורפוגנזה קשת בלוע בדג זברה שהן מוטציה למסלולי איתות חשובות באמצעות מהונדס כי תוויות בתאי רכס עצביים. בנוסף לרמת רקמת ניתוחים, ניתוחי זמן לשגות תקפים גם לניתוח בקנה מידה סלולרית 28. יכולות גם להיות משולבות שיטות דג הזברה בשימוש נרחבת רבות לניסויים במיקרוסקופיה הזמן לשגות, כולל microinjection של morpholinos, mRNAs, או בונה מהונדס, כמו גם השתלות בין עוברים. נית...

המורפוגנזה Craniofacial היא תהליך רב שלבים מורכב הדורש אינטראקציות מתואמות בין סוגי תאים מרובים. רוב שלד craniofacial נגזר מתאי רכס עצביים, שרבים מהם חייבים לעבור מ הצינור העצבי הגבי למבנים ארעיים שנקראים קשתות בלוע 1. כמו ברקמות רבות, המורפוגנזה של שלד craniofacial היא יותר מסובכת ממה יכול להיות מובן על ידי תמונות סטטיות של עוברים בנקודות זמן ההתפתחותי ספציפיות. למרות שזה הוא לבצע זמן רב, in vivo מיקרוסקופיה זמן לשגות מספקת מבט מתמשך בתאים של עובר המתפתח ורקמות. כל תמונה בסדרת הזמן לשגות מעניקה הקשר לאחרים, ומסייעת למהלך חוקר לכיוון של הסקה מדוע תופעה מתרחשת ולא הסיק את מה שמתרחש באותו זמן. בתחום ההדמיה vivo הוא אפוא כלי תיאורים רב עוצמה לגישות ניסיוניות ללפרק את המסלולים המנחים המורפוגנזה. Rerio Danio דג הזברה הוא מודל גנטי פופולרי של התפתחות עוברית של בעלי החוליות, והוא מתאים במיוחד גם בתחום ההדמיה vivo של המורפוגנזה. מודרני, שיטות נוחים לtransgenesis ושינוי גנומי הן מתקדמות במהירות מספר הכלים העומדים לרשות חוקרי דג הזברה. כלים אלה לשפר את השיטות חזקות כבר למניפולציה ומיקרוסקופיה גנטיות. בvivo הדמיה של כמעט כל רקמה בכמעט כל קשר גנטי רצוי היא קרובה יותר למציאות מאשר לדמיון. תנועות morphogenetic של קשתות בלוע הם מודרכים על ידי איתות אינטראקציות בין הרכס העצבי והאפיטל הסמוך, שניהם האאקטודרם והאנדודרם. ישנן מולקולות רבות איתות שהביעו האפיטל כי יש צורך לנהוג המורפוגנזה של אלמנטי שלד craniofacial. בין מולקולות האיתות הללו, סוניק קיפוד (ששש) הוא f החשובה באופן קריטיאו פיתוח craniofacial 2-8. ששש מתבטאים בשני האאקטודרם הפה ובלוע האנדודרם 2,6,9,10. הביטוי של ששש בהאנדודרם מסדיר תנועות morphogenetic של הקשתות 10, דפוסים של רכס עצבי בתוך הקשתות 10, וצמיחה של שלד craniofacial 11. איתות bmp היא גם חשובה באופן קריטי לפיתוח craniofacial 12 ועשויה לשנות המורפוגנזה של קשתות בלוע. איתות bmp מסדירה גב / הגחון דפוסים של רכס בתוך קשתות בלוע 13,14. שיבוש של smad5 בדג הזברה גורם למומי חיך קשים וכישלון של סחוסים של המקלה הפתיל כראוי על קו האמצע 15. בנוסף, מוטציות גם להציג ירידות ואיחוי באלמנטי סחוס הגחון, עם nd 2, 3 rd, ולפעמים אלמנטי קשת בלוע 4 ה התמזגו בקו האמצע 15. שילובים אלו ממליצים כי איתות Bmp מכוונת המורפוגנזה של אלמנטי בלוע אלה. איתות PDGF היא הכרחית להתפתחות craniofacial, אבל יש לו תפקידים ידועים בהמורפוגנזה קשת בלוע. עכבר ומוטציות PDGFRA דג הזברה לשניהם יש clefting midfacial העמוק 16-18. לפחות בדג הזברה clefting midfacial זאת בשל כישלונה של נדידת תאי רכס עצביים תקינה 16. תאי רכס עצביים ממשיכים להביע PDGFRA אחרי שהם נכנסו לקשתות בלוע. בנוסף, ligands PDGF באים לידי ביטוי על ידי epithelia פנים ובתוך קשתות בלוע 16,19,20, ובכך איתות PDGF יכולה גם לשחק תפקיד בהמורפוגנזה של קשתות בלוע בעקבות הגירה. עם זאת, ניתוח של המורפוגנזה של קשתות בלוע במוטנטים PDGFRA לא בוצעו. הנה, אנחנו מדגימים במיקרוסקופיה confocal vivo של pharyngulבשלב דג הזברה מהונדס ולתאר את המורפוגנזה של קשתות בלוע בתוך תקופה זו. בנוסף, אנו מראים התנהגויות רקמה שמושפעות על ידי מוטציות המשבשות את BMP, PDGF, ומסלולי איתות ששש.

<table><tbody><tr><td>6 lb קו מונופילמנט מבחן</td><td>Cortland Line Company</td><td>SLB16</td><td></td></tr><tr><td>Agarose I</td><td>Amresco</td><td>0710</td><td></td></tr><tr><td>Argon laser</td><td>LASOS Lasertechnik GmbH</td><td>LGN 3001</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלוריד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>צינורות נימיים, 100 מ"מ, 0.9 מ"מ ID</td><td>FHC</td><td>30-31-0</td><td></td></tr><tr><td>שמן ציפורן</td><td>Hilltech קנדה בע"מ</td><td>HB-102</td><td></td></tr><tr><td>גריז ואקום גבוה</td><td>דאו קורנינג</td><td>2021846-0807</td><td></td></tr><tr><td>חממת אמבטיה יבשה איזוטמפ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>2050FS</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סריקת לייזר</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>LSM 710</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום סולפט הקסהידרט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית כיסוי מיקרוסקופ, 22 x 22-1</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית כיסוי מיקרוסקופ, 24 x 60-1</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-545-M</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>M-11321</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט דו-בסיסי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>M-11624</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>TempController 2000-2</td><td>PeCon GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tricaine-S</td><td>Western Chemical, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח craniofacial המורפוגנזה בדג הזברה שימוש 4d מיקרוסקופיה confocal

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

זמן לשגות הדמיה היא טכניקה המאפשרת תצפית הישירה של תהליך המורפוגנזה, או הדור של צורה. בשל הבהירות האופטית שלהם ורמת מוכנות למניפולציה גנטית, עובר דג הזברה הפך אורגניזם מודל פופולרי שבה לביצוע ניתוח הזמן לשגות של המורפוגנזה בעוברי חיים. ההדמיה confocal של עובר דג הזברה לחיות דורשת כי רקמה של עניין היא שכותרתו בהתמדה עם סמן פלואורסצנטי, כגון transgene או צבע שהוחדר. התהליך דורש כי העובר הוא הרדים ושנערך במקום בצורה כזאת, שהתפתחות בריאה ממשיכה כרגיל. פרמטרים להדמיה חייבים להיות מוגדרים חשבון לצמיחה תלת ממדים וכדי לאזן את הדרישות של פתרון תאים בודדים תוך קבלת תמונות מהירות של פיתוח. התוצאות שלנו מראות את היכולת לבצע לטווח ארוך בתחום ההדמיה vivo של עוברי דג הזברה שכותרתו הקרינה ולזהות התנהגויות רקמה מגוונות בהרכס עצבי הגולגולת שגורמים למומי craniofacial. עיכובים התפתחותיים הנגרמים על ידי הרדמה והרכבה הם מינימאליים, והם עוברים ללא פגע על ידי התהליך. ניתן להחזיר עובר זמן לשגות הדמיה למדיום נוזלי ולאחר מכן צילם או קבוע בנקודות מאוחרות יותר בהתפתחות. עם שפע הולך וגדל של קווים מהונדסים דג הזברה ומיפוי גורל מאופיין היטב וטכניקות השתלה, הדמיה כל רקמה רצויה אפשרית. ככזה, זמן לשגות בתחום ההדמיה vivo משלב עוצמה עם שיטות גנטיות דג הזברה, כוללים ניתוחים של עוברים שעברו מוטציה וmicroinjected.

בעוברי wild-type, בעקבות אוכלוסיית רכס עצבית, קשתות בלוע להאריך לאורך צירי הגחון קדמי / אחורי וגב / תוך כדי התנועה בכיוון מקורי (סרט 1). ב30 שעות לאחר הפריה (hpf), האורך קדמי / האחורי של קשת בלוע הראשונה הוא בין 1.8-1.9 פעמים הגבי / גובה גחונה. גב / התארכות הגחון ממשיכה בהתמדה, מהר יותר מאשר הארכה קדמית / אחורי עד 36.5 hpf. מכאן, גב / מישורים גובה הגחון סביב 104 מיקרומטר באמצעות 48 hpf. הרחבה קדמית / אחורית ממשיכה דרך 48 hpf, עם אורך קדמי / אחורי הכולל הגדלת מתחת ...

confocal הדמיה זמן לשגות היא טכניקה רבת עוצמה שימושית לאפיון התפתחות עוברית. כאן, אנו מתארים את המתודולוגיה ולאפיין המורפוגנזה craniofacial בסוג פראי, כמו גם PDGFRA, smad5, וSMO עוברים שעברו מוטציה.

ניתוח Craniofacial המורפוגנזה בדג הזברה שימוש 4D מיקרוסקופיה confocal

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לצפות ולאפיין תנועות של קשתות הלוע בראשו של דג זברה בהתפתחות. זאת על ידי הטמעה ראשונית של עובר דג זברה טרנסגני בג'ל אקרוסט (acrost gel) מאלחש. השלב השני הוא קיבוע של העובר המוטמע באגרוז בטיפה של Methylcellulose על שקופית של מיקרוסקופ.בשלב הבא, העובר נחתם בין שתי זכוכיות מיקרוסקופ באמצעות גריס ואקום. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית בשיטת time-lapse כדי להראות הבדלים בין דגי זבב מסוג wild type לבין מוטנטים, ואת התנועות המורפוגנטיות של הקשתות הלועיות. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות דימוי סטטיות הוא שהיא לוכדת את התפתחות הקשתות הלועיות בזמן אמת, ומאפשרת לחוקר לצפות באופן ישיר בתנועות הרקמה הקריטיות למורפוגנזה.כדי להכין כיסוי זכוכית מגשר, הדביקו בעזרת דבק מהיר (super glue) זכוכית כיסוי בגודל 22 על 22 לכל אחד מקצותיה של זכוכית כיסוי בגודל 24 על 60, תוך השארת החלק המרכזי פתוח. הכינו דגימות בודדות עבורו עבור עוברים בני פחות מיום.כפולים עבורו עוברי גיל יום אחד עד ארבעה, או משולשים עבורו עוברי גיל חמישה ימים ומעלה. ועבור כל דגימה, השתמשו בשתי זכוכיות כיסוי מגשרות. כעת מלאו מזרק של 10 milliliter בגריז ואקום גבוה.הכינו חומר הרדמה טרי ב-0.2% liquid aros ושמרו אותו בבלוק חימום בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס. כדי להסיר ידנית את המעטפת מהעוברים התורשתיים שטרם בקעו, קרעו לאט את ה-Corian עד לשחרור העובר. כעת, העבירו את העוברים בעלי המעטפת למצע נקי המכיל MS 2 22 וחומר הרדמה.כדי להכין כיסוי זכוכית מגשר, דחפו באיטיות את ג'ל הוואקום מתוך המזרק, תוך써 יצירת פס רציף וחלק הצמוד לגשרים ולשולי כיסוי הזכוכית ובתוכם. מרחו עיגול של 4% Methylcellulose במרכז השטח שבין הגשר לכיסוי הזכוכית. כאשר העובר מורדם, שאבו אותו לתוך פיפטה מזכוכית.החזיקו את הפפט במצב אנכי כדי לאפשר לעובר לשקוע לתחתית הנוזל בתוך הפפט. לאחר מכן, העבירו את הפפט אל תוך תמיסת ה-agro ואפשרו לעובר לנפול לתוך ה-aros מבלי להשריץ את הנוזל. שאבו כמות קטנה מתמיסת ה-agro ואת העובר אל תוך הפפט.לאחר מכן, העבירו את העובר לטיפת תמיסת aro. מעל למתילצלולוז (methylcellulose). דחפו את העובר כלפי מטה אל תוך המתילצלולוז וכווןו לפי הרצונכם לצורך הדמיה כדי לאטום את הדגימה.הנח כיסוי זכוכית מגשר אחד מעל הכיסוי המותקן, כשהוא פונה כלפי מטה. הפעל לחץ אחיד על שני צידי כיסויי הזכוכית הסנדוויץ' עד שהגשרים יבואו במגע ישיר וטיפת האגרוס תיחתם לשני כיסויי הזכוכית. ודא שהעובר מכוון כראוי.שפשפו מapplicator עץ לאורך הזכוכית כדי להחליק סדקים ומרווחים בשכבת גריז הוואקום. נגבו שאריות גריז מהשוליים. הפעילו את מיקרוסקופ הקונפוקלי ואת כל התקני הלייזר החיצוניים.בנוסף, הדליקו את המחשב המחובר למיקרוסקופ הקונפוקלי ובחרו ב-"start system" ובתוכנה לדימות קונפוקלי. לאחר מכן, הורידו את פלטפורמת הבמה של המיקרוסקופ הקונפוקלי והזיזו את עדשות העדשה הרחבה מהמיקום. החליפו את הבמה הסטנדרטית בבמה אלקטרונית מחוממת.הפעילו את הבקר של הבמה המחוממת והגדירו את הטמפרטורה ל-29.5 °C. הניחו את הדגימה המורכבת על הבמה המחוממת. העבירו את העדשה של העדיפה עם הגדלה של 20x למיקומה והגביהו את פלטפורמת הבמה.לאחר מכן, הפעילו את פולט האור הנראה ומרכזו את ראשו של העובר בשדה הראייה. כדי להפעיל את ערוצי הפלואורסצנציה, בחרו את אורך גל הפלואורסצנציה שברצונכם לזהות ובחרו טבלאות התבדרות צבעים (lookup tables) עבור כל ערוץ. עבור כל ערוץ פלואורסצנציה, הגדירו את עוצמת הלייזר ל-10.0 ואת מתח מכפיל הפוטו-אלקטרונים בין 600 ל-700.כדי להפחית את הרקע ולהגדיל את כמות המידע הפלואורסצנטי הנאסף, הגדירו את הממוצע (averaging) לשניים או ארבעה ואת עומק הביט ל-16 bit. הפעילו את המודולים של ZS stack ושל סדרות זמן (time series). כווןו את הפינהול (pinhole) במידת הצורך.הגדירו את מרווחי הזמן ואת משך הניסוי. העבירו את המצלמה למצב צפייה חיה (live mode). כווןנו את המוקד והגבירו את עוצמת הלייזר במידת הצורך.לצפייה בפלואורסצנציה, הגדירו את הזום הדיגיטלי ל-0.6 כדי לקבל שדה ראייה רחב יותר, במידת הצורך.מקם את השולחן כך שכל המבנים המעניינים יהיו גלויים ויהיה מקום בשדה הראייה לצמיחה. בצע פוקוס גביתי וקדמי דרך העובר עד לגבולות העליונים והתחתונים של הפלואורסצנציה. קבע את מיקומי פרוסות ה-Zack הראשונה והאחרונה במרחק של 100 micrometers לפחות או יותר מעבר לגבולות אלה.בשלב הבא, הגדירו את לוח המעקב של התצוגה (display lookup table) למדדי טווח, כך שהמבנים הפלואורסצנטיים יופיעו בגוון אפור ושאר השדה יופיע בכחול או בשחור. במידת הצורך, הגבירו את מתח מכפיל הפוטו-אלקטרונים לרמה שנמצאת ממש מתחת לסף שבו מופיעים פיקסלים אדומים רוויים. אם המבנים הפלואורסצנטיים מופיעים באדום, הפחיתו את עוצמת הלייזר ו/או את ההגבר (gain) עד שיהפכו לגוון אפור.במידת הצורך, התאימו את ההיסט (offset), כך שהאזורים שמחוץ למדגם יהיו כחולים. הגדירו את הקוטר הקטן ביותר המאפשר איסוף תמונות בפרק זמן סביר.יש להגדיר את מרווח ה-Z תמיד למרחק האופטימלי המומלץ עבור קוטר ה-pinhole, ולבצע סריקות קצרות לבדיקת ההגדרות, תוך שימוש תמידי בעוצמת הלייזר הנמוכה ביותר האפשרית. כעת הרץ את הניסוי למשך הזמן הרצוי. לאחר מכן, הוצא את העובר מהבמה המחוממת והפרד באיטיות את לוחות הכיסוי, טבול את לוח הכיסוי ואת העובר בתוך צלחת פטרי בנפח 30 מילימטר.בעזרת פיפטה מזכוכית, שטפו בעדינות את העובר מהכיסוי (cover slip) והסירו את הכיסוי מתוך פטריית הפטרי. העבירו את העובר לאינקובטור בטמפרטורה של 28.5 degree Celsius כדי להמשיך להתפתח. בסיום הניסויים, צלמו תמונות Zack בודדות של עוברים אחים המותקנים ב-agar ושהיו בשלב התפתחותי דומה לזה של הדגימה בתחילת הניסויים, אך גודלו בתוך אינקובטור בטמפרטורה של 28.5 degree Celsius.מדדו את קשתות הלוע לפי הצורך באמצעות תוכנת קונפוקל או תוכנה אחרת לעיבוד תמונות בעוברים מסוג wild type. בעקבות התגששות תאי הרכס העצבי, קשתות הלוע מתארכות לאורך הצירים האנטרו-פוסטריורי (anterior posterior) והדורסו-ונטרלי (dorsal ventral) תוך תנועה בכיוון רוסטרלי. בקצית הקדמי של קשת הלוע הראשונה נוצרים התחומים המקסילריים והמנדיבולריים המופרדים על ידי האקטודרמה הפהית; תנועות מורפוגנטיות מרכזיות אלו משובשות באופן ניכר במוטנטים של smoothened.כאן, הקשת הלועית השביעית אינה נודדת כראוי כדי לחפוף לקשתות קדמיות יותר עד 48 שעות לאחר ההפריה. למוטנטים של Zebrafish SM five ישנם פגמים קרניו-פציאליים רבים. בתמונות קונפוקאליות סטטיות אלו.היתוכים בתחומים הוונטרליים של הקשתות השנייה והשלישית ניכרים 32 שעות לאחר ההפריה. באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של צילומי רצף (time-lapse), אנו מנתחים את המורפוגנזה של הקשתות הבלעומיות. במוטנטים של Smad five, היתוכים בין הקשת השנייה לשלישית מופיעים תחילה 32 שעות לאחר ההפריה.בסגנון הניתוח הסטטי. בעוד שהבעתם של חברי משפחת PDGF מרמזת כי ייתכן שהם מעורבים באופן נרחב במורפוגנזה של הקשתות הלועיות, תנועת הקשתות האחוריות נראית תקינה. במוטנטים של P-D-G-F-R-A, המורפוגנזה של הקשת הלועית הראשונה היא זו שנראית מופרעת באופן ספציפי.הליך זה ניתן להשמה בטכניקות נפוצות אחרות של דגי zebrafish, כגון הזרקת morpho או יצירת פסיפסים גנטיים. ניתוחי time lapse מאפשרים ניתוח ישיר של תוצאות מניפולציות אלו. לאחר צפייה בסרטון זה, תגמירו להבנה טובה של אופן ביצוע דימוי in vivo בשיטת time lapse של עוברים טרנסגניים של zebrafish, על ידי הרדמה והרכבה נכונה של הדגימות וקביעת פרמטרים אופטימליים למיקרוסקופיה קונפוקלית.

analyzing-craniofacial-morphogenesis-zebrafish-using-4d-confocal

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון הזה, אנחנו מראים שיטה שבאמצעותה לנתח את המוח חוליות עוברי דג הזברה מתפתח לחיות ברזולוציה של תא בודד על ידי מיקרוסקופיה confocal. זה כולל את השיטה שבאמצעותה אנו מזריקים את העובר מתא בודד דג הזברה ולאחר מכן הר התמונה במוח המתפתח.

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

הדמיה של כלי דם במוח בפיתוח דג הזברה זחל הוא תאר. טכניקות כדי להקל על ההדמיה 3D ולשנות התפתחות כלי דם במוח באמצעות טיפולים כימיים גם מסופקות.

הדמיה ו3D שחזור של מבני כלי דם במוח בעוברי דג הזברה

ויזואליזציה של נתונים ניסיוניים הפכה מרכיב מרכזי בהצגת תוצאות לקהילה המדעית. דור של הקלטת הזמן לשגות חי של עוברים גובר תורם למצגת טובה יותר והבנה של תהליכים התפתחותיים מורכבים. פרוטוקול זה הוא מדריך צעד אחר צעד לתיוג תא באמצעות photoconversion חלבון קאאד של דג הזברה.

ויזואליזציה של Craniofacial פיתוח בsox10: קאאד מהונדס דג הזברה הקו באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופיה confocal

ארגון תא של עצמות craniofacial כבר שיערו ארוך אבל אף פעם לא דמיין ישירות. תיוג תא Multi-רפאים ובשידור חי vivo   הדמיה מאפשרת הדמיה של התנהגות הדינמית של תאים בלסת תחתונה דג הזברה. כאן, אנו פירוט הפרוטוקול לתמרן Zebrabow דג מהונדס וישירות להתבונן עיבור תא ושינויים מורפולוגיים של כונדרוציטים בסחוס של מקל.

ויזואליזציה של הכונדרוציטים עיבור וכיוונית למניעת הפצת נשק באמצעות ניתוח תא משובט Zebrabow בסחוס של העוברית מקל

כאן, אנו מציגים שיטת הרכבה רב-תכליתית המאפשרת הדמיה ארוכת טווח של התפתחות הגוף האחורי של עוברי דג זברה חיים מבלי להפריע להתפתחות תקינה.

שיטת הרכבה צדדית עבור Long Term הדמיה של פיתוח דג זברה

שילוב של טכניקות אופטי מתקדם של סריקת מיקרוסקופ עם זמן עירור קרינה פלואורסצנטית פוטון מרובה אורך גל לייזר בוצע כדי ללכוד דימות ברזולוציה גבוהה, תלת מימדי, בזמן אמת של הרכס העצבי הגירה ב Tg (sox10:EGFP) ו- Tg (foxd3:GFP) דג זברה עוברי.

פוטון רב זמן לשגות הדמיה כדי להמחיש את התפתחות בזמן אמת: ויזואליזציה של העברת תאי הרכס העצבי עוברי דג זברה

ב vivo הדמיה היא כלי רב עוצמה שניתן להשתמש בו כדי לחקור את המנגנונים הסלולריים בבסיס פיתוח מערכת העצבים. כאן אנו מתארים טכניקה לשימוש מיקרוסקופיה מיקוד הזמן כדי להמחיש מספר גדול של המוח ססגוניות באמצעות התווית בזמן אמת בתוך מערכת העצבים דג זברה המתפתח.

מדמיין את המוח המתפתח בחיים דגים באמצעות הברקשת וזמן-הדמיה קונמיקוד

פרוטוקול זה מתאר גישה לתיוג תותוג טומוטו והדמיה רב ממדית של התפתחות עיניים מוקדמות של דגי זברה. אנו מתארים תיוג, הטמעה והדמיה בארבעה ממדים (4D) באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית לסריקת לייזר, ושיקולים למיטוב רכישת ערכות נתונים לניתוח מנגנונים של מורפוגנזה של אופטית.

הדמיה תלת מימדית של מורפוגנזה של גביע זברה אופטי

הפרוטוקול המתואר כאן מציג הליך פשוט וקל לביצוע לצביעה וניתוח סחוסי גולגולת פנים בזחל דג זברה בן 5 ימים. בעזרתו ניתן לחקור את האנטומיה, הצורה והגודל של מבנים אלה בתנאי התפתחות שונים.

דיסקציה של רקמות הגולגולת של דג הזברה לאחר צביעה בכחול אלציאני

עבודה זו מתארת פרוטוקול לכימות צורת הסחוס הקרניופציאלי באמצעות תוכנה חופשית (tpsDigs2, MorphoJ ו-PAST) למדידת שינויים במבנה הפנים של זחלי דגי זברה.

ניתוחים מורפומטריים של צורה: ארגז כלים לתוכנת ניתוח לכימות צורת קרניופנים בדגי זברה

למד את שיטת מיקרוסקופיית confocal טווח-זמן לניתוח מורפוגנזה קרניו-פניאלית בדגי זברה. השיטה מאפשרת תצפית בזמן אמת על תנועות הקשתות הלועיות והשוואה בין עוברים פראיים למוטנטים.

ניתוח Craniofacial המורפוגנזה בדג הזברה שימוש 4D מיקרוסקופיה confocal

גלה סרטונים נוספים