Name: הפקה וטיהור יעילה של רקומביננטי Murine Kindlin-3 מתאי חרקים לBiophysical לימודים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-19T14:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 52 s
Description: למדו כיצד לייצר ולטהר חלבון Kindlin-3 מרקומביננטי בכמויות מיליגרם באמצעות תאי חרקים נגועים בבקולובירוס. שיטה זו מגבירה את התפוקה פי עשרה בהשוואה לבקטריות ומאפשרת מחקרים ביופיזיקליים מעמיקים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לו Weixan לקבלת סיוע טכני בתרבות ובתחזוקה של מניות תא Sf9. LAY נתמכה על ידי מלגת לימודים לתואר שני מועצה למחקר רפואי (MRC). RJCG היה אוניברסיטת חברה מלכותית עמית מחקר. חטיבת אוקספורד לביולוגיה מבנית היא חלק ממרכז קרן Wellcome לגנטיקה אנושית, Wellcome Trust Core פרס גרנט מספר 090532/Z/09/Z.

פרוטוקול זה מבוסס על ההנחה שעכבר גן kindlin-3 (FERMT3) כבר שובט בהצלחה לתוך וקטור במורד הזרם של אמרגן P10 מאוחר מאוד וכי הווקטור בעל איגוף רצפי baculovirus להתיר רקומבינציה עם bacmid BAC10 KO: 1629 שפותח על ידי IM ג&#39;ונס ו עמיתים 28. עבור פרוטוקול זה, גן kindlin-3 שובט לתוך pOPINE 29 וניתן למצוא פריימרים והאסטרטגיה שיבוט משמשים מתוארים במקומות אחרים 12. פלסמיד מתוכנן כך שגן FERMT3 (kindlin-3) נמצא תחת השליטה של אמרגן baculoviral P10 ואת הווקטור מכיל 5 &#39;UTR/ORF603 וORF 1629 ו מקודד בטרמינל C-6-התג שלו לטיהור במורד הזרם 29. 1. תרבית תאי חרקים ותחזוקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ההגברה baculovirus רקומביננטי, תאי frugiperda Spodoptera מותאמים לתרבות השעיה (תאי Sf9) צריכיםלהיות מבוגר ומתוחזק. תאי חרקים תמיד צריכים להיות מטופל באמצעות טכניקות אספטיים במנדף ייעודי רקמת תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבויות השעיה של תאי חרקים מודגרת בSF-900 השני (SFM) מדיום נוזלי סרום ללא תוספת פניצילין 100 מיקרוגרם / מיליליטר ו100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין בצלוחיות ב27 ° C עם רועד ב100 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על טווח צפיפות תרבית תאי חרקים בין 1 x 06-01 אוקטובר x 10 7 תאים / מיליליטר על ידי פיצול ודילול תרבית התאים עם SF-900 השני תקשורת טריות. הערה: בריא תאים צריכים להיראות אחידים בגודל וצריכים להיות צורה כדורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים בנפח דגימה באמצעות hemocytometer ומיקרוסקופ אור כדי לחשב את צפיפות תאי התרבות. </li></ol> 2. דור של רקומביננטי baculovirus <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות ולשמור על תאי Sf9 בהשעיה באמצעות SF-900 השני תקשורת בתוספת 100 מיקרוגרם / מיליליטר penicillin ו100 סטרפטומיצין מיקרוגרם / מיליליטר. עבור דור baculovirus, צריכים להיות מתורבת תאי חרקים למגוון צפיפות של 5 x 10 5 - x 1 10 6 תאים / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע כ 1 x 10 6 תאי Sf9 לכל טוב של צלחת סטרילית 6 גם רקמות תרבות ב2 מיליליטר של SF-900 השני תקשורת בתוספת פניצילין 100 מיקרוגרם / מיליליטר ו100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין. השאר את תאי Sf9 ב RT במנדף לדבוק בבסיס של בארות פלסטיק ובכך יוצר שכבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע דור baculovirus רקומביננטי ידי cotransfecting DNA bacmid ופלסמיד דנ&quot;א על ​​תרבות שכבה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל transfection, לערבב 1-2 מיקרוגרם של pOPINE-mFERMT3 מטוהר, אשר ברשותה ORF1629 אלמנטי baculovirus, עם 0.5 מיקרוגרם של KO BAC10 מטוהר: 1629 בשל SF-900 השני SFM 100 μl ללא אנטיביוטיקה (פתרון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצינור נפרד, לדלל 6 μl של Cellfectin השני מגיב עם של SF-900 השני SFM 100 μl ללא אנטיbiotics עבור כל תגובת transfection (פתרון ב &#39;). &quot;תערובת הורים &#39;יכולה להיווצר כאן, לטיפול נוזל מופחת, אם transfections רבים נדרשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב את שני פתרונות (A ו-B, כ 200 μl) ו לדגור על RT עבור 20 דקות כדי ליצור מורכבות שומנים-DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את מתחמי שומנים בדם DNA עם 800 μl SF-900 השני SFM ללא אנטיביוטיקה. בזהירות לשאוב תקשורת monolayer תא Sf9 ו פיפטה בזהירות / B ותקשורת הפתרון על גבי monolayer Sf9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאי transfected בחממה humidified על 27 ° CO / N ולהוסיף עוד 1 מיליליטר של SF-900 השני SFM ללא אנטיביוטיקה לכל תרבות monolayer למחרת. דגירה תאים ב27 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים נוספים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר baculovirus רקומביננטי ישירות מהתרבות בינונית (כ -2 מיליליטר בסך הכל) ולהעביר לצינור צנטריפוגות נקי (לדוגמא צינור פלקון 15 מיליליטר). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבהיר כל debr תא Sf9הוא על ידי צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 5 דקות ב RT. מעביר את הנגיף, אשר הוא בsupernatant וכתוצאה מכך וכונה P1, לצינור וחנות נקי ב 4 ° C בחושך עד לשימוש. בשלב זה monolayer Sf9 הנותר ניתן להשתמש כדי להעריך את דור וירוס רקומביננטי על ידי הערכת הנוכחות של kindlin-3 רקומביננטי בתאי החרקים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend monolayer עם 0.5 מיליליטר PBS ולדלל מדגם 10 μl עם כמויות שווה של חיץ טעינה-SDS 2x. מחממים את הדגימות ב&gt; 95 מעלות צלזיוס למשך דקות לפחות 10. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate את המדגם עבור 1 שניות במשרעת 10% באמצעות קצה מייקר sonicator אם זה צמיג מדי לטעינת ג&#39;ל ראויה. </li></ol></li></ol> 3. הגברה של רקומביננטי baculovirus <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגברה של נגיף בהשעיה, השתמש צפיפות תאים של 1.4 x 10 6 תאים / מ&quot;ל ואת זה צריך לכבוש 1/20 מכלל נפח הבקבוק (כלומר תרבות מיליליטר 50 בבקבוק 2 ליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג ההגברה של נגיף רקומביננטי על ידי הדבקה של תרבית תאי חרקים עם מניית ויראלי P1 בריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 0.1 באמצעות הנוסחה הבאה; <img alt="" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51206/51206eq1.jpg" width="400" /> הערה: דור וירוס P1 ניתן להניח שיש כייל נגיף צפוי של 1 x 10 7 מיליליטר / pfu. עם זאת, assay פלאק יכול להתבצע לפני שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תרבות החרקים שנדבקה ב-P1 ב27 ° C עם הרועד בסל&quot;ד 100 במשך 3 ימים (72 hr). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצור את הווירוס על ידי הפרדת התאים מהתקשורת על ידי צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 5 דקות ב RT. שמור את התא גלולה וכתוצאה מכך בשלב זה לאישור לייצור וירוס רקומביננטי על ידי הערכת kindlin-3 ביטוי חלבון על ידי-SDS ומערבי סופג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את התקשורת מועשרת וירוס הבהירה לצינור נקי ולאחסן ב 4 ° C בהחושך עד לשימוש. מניית ויראלי זה מסומן כמו P2. הערה: כייל נגיף של 2 x 10 8 מיליליטר pfu / (או שיעור הגברה של 100 pfu / תא) יכול להיות צפוי. </li></ol> 4. ביטוי של kindlin-3 בSf9 Infected-baculovirus <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול בנפח מספק של תרבויות תאי Sf9 בהשעיה בSF-900 השני SFM בתוספת 100 מיקרוגרם / מיליליטר פניצילין ו100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, לפני בקנה מידה גדולה kindlin-3 ביטוי רקומביננטי לטיהור. דגירה תרבויות ההשעיה ב27 ° C עם רועד ב100 סל&quot;ד ועם סך תרבות נפח: בקבוקון יחס נפח של 1:05. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק תרבויות השעיה של Sf9 בצפיפות של 2 x 10 6 תאים / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסף תרבויות Sf9 עם ריכוז סופי של 1% (v / v) בסרום שור העוברי (FBS) אחריו עם וירוס Amplified רקומביננטי (מניית P2 ויראלית) לתת הפנים של 1. דגירה התרבויות נגועה ב27 ° C עם רועד ב100 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> recombina קצירNT kindlin-3-CHIS 6-לבטא בתאי Sf9 לאחר זיהום 72 שעות על ידי צנטריפוגה XG ב 1000 &#160; ותא גלולה וכתוצאה מכך מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש, או -80 ° C לאחסון ארוך טווח. </li></ol> 5. טיהור של רקומביננטי Kindlin-3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדורי תא חרקים הפשרה קפוא נגוע baculovirus (Sf9) להביע kindlin-3 רקומביננטי על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תא גלולה מופשר עם חיץ תמוגה (50 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 7.5 500 mM NaCl, 1% (v / v) Tween-20), בתוספת מעכבי פרוטאז קוקטייל ללא EDTA ו1,000-2,000 U של DNase1. הערה: לחלופין, פוספט שנאגרו מלוח שונה (PBS) יכול לשמש גם, שבו ריכוז NaCl מותאם ל500 מ&quot;מ כדי למנוע אינטראקציות ספציפיות בין חלבונים אנדוגניים Sf9 תא ועמודת זיקת מתכת המשותקת המשמשת לטיהור במורד הזרם (ראה להלן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse התאים על ידי דוגרים תאי resuspended עם חומר הניקוי וvortexing. Sonicate (משרעת 40%, 10 מחזורים של 10 דופק שניות אחריו 10 קירור שניות) לדוגמא עבור הפרעה תא נוספת באמבט קרח או לחלופין להשתמש homogenizer Dounce. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבהיר את lysate ידי צנטריפוגה ב48,000 XG במשך שעה 1 ב 4 ° C. טען את supernatant וכתוצאה מכך על עמודת HisTrap (5 מיליליטר עמודת נפח), טרום equilibrated עם מאגר תמוגה, על 4 מעלות צלזיוס בשיעור של 1 מיליליטר / דקה. הערה: לחלופין, lysate הבהיר ניתן הודגרו עם 1-5 מיליליטר מיטת נפח של חרוזים sepharose ניקל equilibrated מראש (למשל Ni Sepharose 6 זרימה מהירה) בשעה 4 מעלות צלזיוס למשך 1-2 שעות. טור של sepharose Ni יכול להיווצר אחרי הצעד המחייב באמצעות זרימה הכבידה עמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העמודה עם 10 כרכי טור של חיץ לשטוף (50 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 7.5 500 mM NaCl, 10 imidazole מ&quot;מ) כדי להסיר חלבונים מאוגדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בשיפוע ליניארית imidazole 10-500 מ&quot;מ בשיעור של 10 מ&quot;מ / מיליליטר (או בכרכי טור 10) באמצעות FPLC תקטע לelutekindlin-3-CHIS הכפות רקומביננטי 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Fractionate elution ל0.5-1 מיליליטר שברים באמצעות FPLC יקטע, עם אלה שברים המכילים kindlin-3-CHIS 6 בדרך כלל משחררי בריכוז imidazole של 300 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את הרכב החלבון של eluant ידי-SDS ולpurifications לראשונה לאשר ידי מערבי סופג באמצעות נוגדן אנטי-6 או אנטי עכבר נוגדן kindlin-3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכה שברים המכילים kindlin-3 וחיץ תמורה ל20 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 7.5, 200 מ&quot;מ NaCl באמצעות סדרה של דילולים לחיץ וריכוזי מדגם באמצעות רכז חלבון צנטריפוגלי עם חתוכי 50 משקל מולקולרי kDa (MWCO) ב 4 ° C. הערה: לחלופין, dialyze פתרון החלבון באמצעות Slide-A-lyzer דיאליזה קלטת עם MWCO של 30 kDa על 4 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות לO / N ל20 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 7.5, 200 מ&quot;מ NaCl. הערה: לחילוף יונים (ראה בהמשך) ריכוז נמוך יותר של NaCl, <eמ &#39;&gt; כלומר 50 מ&quot;מ, יכול להיות והיה בשימוש כבר בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליישם את הפתרון בחלבון החליף חיץ על עמודת equilibrated מראש HiTrap הפרין HP (5 מיליליטר עמודת נפח) באמצעות FPLC יקטע בשיעור של 0.5 מיליליטר / דקה. הערה: kindlin-3 כפות הוא eluted באמצעות שיפוע ליניארית NaCl (0.2 M NaCl ל1 M NaCl) באותו החיץ, גדל בקצב של 10 מ&quot;מ / מיליליטר. Kindlin-3-CHIS6 צפוי elute ב ~ 0.6 M NaCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Fractionate elution ל0.5-1 מיליליטר שברים ולהעריך את הרכב החלבון ידי-SDS ומערבי סופג, אם מתאים. הערה: אפשר לצפות טוהר חלבון של קרוב ל 95%, כפי שהוערך על ידי-SDS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שברים בריכה המכילים kindlin-3 ולהתרכז באמצעות רכז חלבון צנטריפוגות עם kDa MWCO 50 עד נפח סופי של 0.5-2 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב אחרון, למרק את החלבון המרוכז וחיץ להחליף את החלבון באמצעות כרומטוגרפיה הדרת גודל (SEC). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל החלבון מטוהר על סוperdex S200 (16/60) או (10/30) מראש equilibrated ב20 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 7.5, 200 mM NaCl, 1 mM DTT בשיעור של 1 מיליליטר / דקה או 0.5 מיליליטר / דק &#39;תלוי בגודל עמודה בשימוש. הערה: כרומטוגרפיה הדרת גודל יכולה גם להתבצע בפוספט שנאגרו מלוח (PBS) במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את החלבונים על פי גודל על ידי יישום חיץ על הטור בשיעור של 1 מיליליטר / דקה או 0.5 מיליליטר / דקה, תלוי בגודל עמודה בשימוש. הערה: חלבון משחררי מהעמודה הוא מופרד ופיקוח באמצעות הספיגה ב 280 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיא ספיגת אחת צריך להיות צפוי מ- SEC, שהוא מופרד והוערך על ידי-SDS כדי לקבוע הומוגניות, והוא בדרך כלל&gt; 95% טהורים לאחר שלב זה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתרכז מטוהר kindlin-3-CHIS 6 באמצעות רכז חלבון צנטריפוגות עם kDa MWCO 50 ל~ 15 מ&quot;ג / מיליליטר, כפי שהוערך spectrophotometrically באמצעות מקדם מחושב הכחדה (ε) של 109,320 M -1 cm -1 &lt;/ Sup&gt; (בהנחה שכל שאריות ציסטאין מופחתות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחסון ב-20 מעלות צלזיוס ואחסון לטווח ארוך ב -80 מעלות צלזיוס, aliquot החלבון לתוך צינורות PCR ופלאש להקפיא את הדגימות בחנקן נוזלי. לחלופין, את החלבון ניתן להשתמש ישירות לחקירה תוך שימוש במספר הטכניקות ביוכימיות וbiophysical. </li></ol>

<ol><li>Moser, M., Legate, K. R., Zent, R., Fassler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tail+of+integrins%2C+talin%2C+and+kindlins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The tail of integrins, talin, and kindlins.</a> Science. 895, 899(2009).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kindlin+2+forms+a+transcriptional+complex+with+%CE%B2-catenin+and+TCF4+to+enhance+Wnt+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Kindlin 2 forms a transcriptional complex with β-catenin and TCF4 to enhance Wnt signalling.</a> EMBO Rep. 13, 750-758 (2012).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kindlin+2+promotes+breast+cancer+invasion+via+epigenetic+silencing+of+the+microRNA200+gene+family%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Kindlin 2 promotes breast cancer invasion via epigenetic silencing of the microRNA200 gene family.</a> Int J Cancer. , (2013).</li>
<li>Meves, A., Stremmel, C., Gottschalk, K., Fassler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Kindlin+protein+family%3A+new+members+to+the+club+of+focal+adhesion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Kindlin protein family: new members to the club of focal adhesion proteins.</a> Trends Cell Biol. 19, 504-513 (2009).</li>
<li>Siegel, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+kindlin-1%2C+a+human+homolog+of+the+Caenorhabditis+elegans+actin-extracellular-matrix+linker+protein+UNC-112%2C+causes+Kindler+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Loss of kindlin-1, a human homolog of the Caenorhabditis elegans actin-extracellular-matrix linker protein UNC-112, causes Kindler syndrome.</a> Am. J. Hum. Genet. 73, 174-187 (2003).</li>
<li>Hart, R., Stanley, P., Chakravarty, P., Hogg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kindlin+3+PH+domain+has+an+essential+role+in+integrin+LFA-1-mediated+B+cell+adhesion+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The kindlin 3 PH domain has an essential role in integrin LFA-1-mediated B cell adhesion and migration.</a> J. Biol. Chem. , (2013).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+phosphoinositide+binding+to+Kindlin-2+pleckstrin+homology+domain+in+regulating+integrin+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural basis of phosphoinositide binding to Kindlin-2 pleckstrin homology domain in regulating integrin activation.</a> J. Biol. Chem. 286, 43334-43342 (2011).</li>
<li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kindlin-2+regulates+podocyte+adhesion+and+fibronectin+matrix+deposition+through+interactions+with+phosphoinositides+and+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Kindlin-2 regulates podocyte adhesion and fibronectin matrix deposition through interactions with phosphoinositides and integrins.</a> J. Cell Sci. 124, 879-891 (2011).</li>
<li>Yates, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+Functional+Characterisation+of+the+Kindlin-1+Pleckstrin+Homology+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural and Functional Characterisation of the Kindlin-1 Pleckstrin Homology Domain.</a> J. Biol. Chem. 287, 43246-43261 (2012).</li>
<li>Bouaouina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+lipid-binding+loop+in+the+kindlin+FERM+F1+domain+is+required+for+kindlin-mediated+%CE%B1IIb%CE%B23+integrin+coactivation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A conserved lipid-binding loop in the kindlin FERM F1 domain is required for kindlin-mediated αIIbβ3 integrin coactivation.</a> J. Biol. Chem. 287, 6979-6990 (2012).</li>
<li>Goult, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+N-terminus+of+kindlin-1%3A+a+domain+important+for+AlphaIIbBeta3+integrin+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The structure of the N-terminus of kindlin-1: a domain important for AlphaIIbBeta3 integrin activation.</a> J. Mol. Biol. 394, 944-956 (2009).</li>
<li>Yates, L. A., Fuzery, A. K., Bonet, R., Campbell, I. D., Gilbert, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+Analysis+of+Kindlin-3+Reveals+an+Elongated+Conformation+and+Maps+Integrin+Binding+to+the+Membrane-Distal+%CE%B2-Subunit+NPXY+motif%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Biophysical Analysis of Kindlin-3 Reveals an Elongated Conformation and Maps Integrin Binding to the Membrane-Distal β-Subunit NPXY motif.</a> J. Biol. Chem. 287, 37715-37731 (2012).</li>
<li>Anthis, N. J., Campbell, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tail+of+integrin+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">The tail of integrin activation.</a> Trends Biochem. Sci. 36, 191-198 (2011).</li>
<li>Harburger, D. S., Bouaouina, M., Calderwood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kindlin-1+and+-2+directly+bind+the+C-terminal+region+of+beta+integrin+cytoplasmic+tails+and+exert+integrin-specific+activation+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Kindlin-1 and -2 directly bind the C-terminal region of beta integrin cytoplasmic tails and exert integrin-specific activation effects.</a> J. Biol. Chem. 284, 11485-11497 (2009).</li>
<li>Tadokoro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Talin+binding+to+integrin+beta+tails%3A+a+final+common+step+in+integrin+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Talin binding to integrin beta tails: a final common step in integrin activation.</a> Science. 302, 103-106 (2003).</li>
<li>Garcia-Alvarez,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+determinants+of+integrin+recognition+by+talin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Structural determinants of integrin recognition by talin.</a> Mol. Cell. 11, 49-58 (2003).</li>
<li>Perera, H. D., Ma, Y. Q., Yang, J., Hirbawi, J., Plow, E. F., Qin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+binding+of+the+N-terminal+ubiquitin-like+domain+of+kindlin-2+is+crucial+for+its+regulation+of+integrin+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Membrane binding of the N-terminal ubiquitin-like domain of kindlin-2 is crucial for its regulation of integrin activation.</a> Structure. 19, 1664-1671 (2011).</li>
<li>Ussar, S., Wang, H. V., Linder, S., Fassler, R., Moser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Kindlins%3A+subcellular+localization+and+expression+during+murine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The Kindlins: subcellular localization and expression during murine development.</a> Exp. Cell Res. 312, 3142-3151 (2006).</li>
<li>Bialkowska, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+integrin+co-activator+Kindlin-3+is+expressed+and+functional+in+a+non-hematopoietic+cell%2C+the+endothelial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The integrin co-activator Kindlin-3 is expressed and functional in a non-hematopoietic cell, the endothelial cell.</a> J. Biol. Chem. 285, 18640-18649 (2010).</li>
<li>Moser, M., Nieswandt, B., Ussar, S., Pozgajova, M., Fassler, R. Kindlin-3 is essential for integrin activation and platelet aggregation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoser%2C+M+%22Nat.+Med%22">Nat. Med</a>. 14, 325-330 (2008).</li>
<li>Lefort, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+talin-1+and+kindlin-3+in+LFA-1+extension+and+affinity+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for talin-1 and kindlin-3 in LFA-1 extension and affinity regulation.</a> Blood. 119, 4275-4282 (2012).</li>
<li>Moser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kindlin-3+is+required+for+beta2+integrin-mediated+leukocyte+adhesion+to+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Kindlin-3 is required for beta2 integrin-mediated leukocyte adhesion to endothelial cells.</a> Nat. Med. 15, 300-305 (2009).</li>
<li>Schmidt, S., Nakchbandi, I., Ruppert, R., Kawelke, N., Hess, M. W., Pfaller, K., Jurdic, P., Fassler, R., Moser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kindlin-3-mediated+signaling+from+multiple+integrin+classes+is+required+for+osteoclast-mediated+bone+resorption%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Kindlin-3-mediated signaling from multiple integrin classes is required for osteoclast-mediated bone resorption.</a> J. Cell Biol. 192, 883-897 (2011).</li>
<li>Malinin, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+point+mutation+in+KINDLIN3+ablates+activation+of+three+integrin+subfamilies+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A point mutation in KINDLIN3 ablates activation of three integrin subfamilies in humans.</a> Nat. Med. 15, 313-318 (2009).</li>
<li>Svensson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+adhesion+deficiency-III+is+caused+by+mutations+in+KINDLIN3+affecting+integrin+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Leukocyte adhesion deficiency-III is caused by mutations in KINDLIN3 affecting integrin activation.</a> Nat. Med. 15, 306-312 (2009).</li>
<li>Liu, Y., Zhu, Y., Ye, S., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+kindlin-2+PH+domain+reveals+a+conformational+transition+for+its+membrane+anchoring+and+regulation+of+integrin+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of kindlin-2 PH domain reveals a conformational transition for its membrane anchoring and regulation of integrin activation.</a> Protein Cell. 3, 434-440 (2013).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+phosphoinositide+binding+to+kindlin-2+protein+pleckstrin+homology+domain+in+regulating+integrin+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural basis of phosphoinositide binding to kindlin-2 protein pleckstrin homology domain in regulating integrin activation.</a> J. Biol. Chem. 286, 43334-43342 (2011).</li>
<li>Zhao, Y., Chapman, D. A., Jones, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+baculovirus+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Improving baculovirus recombination.</a> Nucleic Acids Res. 31, (2003).</li>
<li>Berrow, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+ligation-independent+cloning+method+suitable+for+high-throughput+expression+screening+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A versatile ligation-independent cloning method suitable for high-throughput expression screening applications.</a> Nucleic Acids Res. 35, 45 (2007).</li>
<li>Nettleship, J. E., Assenberg, R., Diprose, J. M., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+production+of+proteins+in+insect+and+mammalian+cells+for+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the production of proteins in insect and mammalian cells for structural biology.</a> J Struct. Biol. 172, 55-65 Forthcoming.</li>
<li>Wasilko, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+titerless+infected-cells+preservation+and+scale-up+%28TIPS%29+method+for+large-scale+production+of+NO-sensitive+human+soluble+guanylate+cyclase+%28sGC%29+from+insect+cells+infected+with+recombinant+baculovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">The titerless infected-cells preservation and scale-up (TIPS) method for large-scale production of NO-sensitive human soluble guanylate cyclase (sGC) from insect cells infected with recombinant baculovirus.</a> Protein Expr. Purif. 65, 122-132 (2009).</li>
<li>Yates, L. A., Fleurdépine, S., Rissland, O. S., De Colibus, L., Harlos, K., Norbury, C. J., Gilbert, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Basis+for+the+activity+of+a+cytoplasmic+RNA+terminal+uridylyl+transferase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural Basis for the activity of a cytoplasmic RNA terminal uridylyl transferase.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 782-787 (2012).</li>
<li>Sainsbury, S., Ren, J., Saunders, N. J., Stuart, D. I., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+CrgA%2C+a+LysR-type+transcriptional+regulator+from+pathogenic+Neisseria+meningitidis+MC58%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+Sect.+F.+Struct.+Biol.+Cryst.+Commun%22%5BJournal%5D)">Crystallization and preliminary X-ray analysis of CrgA, a LysR-type transcriptional regulator from pathogenic Neisseria meningitidis MC58.</a> Acta Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. 64, 797-801 (2008).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cell+adhesion+and+migration+by+Kindlin-3+cleavage+by+calpain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of cell adhesion and migration by Kindlin-3 cleavage by calpain.</a> J. Biol. Chem. 287, 40012-40020 Forthcoming.</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

מערכות ביטוי baculovirus הופכות פופולרית יותר ויותר ומהווה כלי חשוב לייצור של כמויות מיליגרם של חלבון רקומביננטי לאפיון חלבונים באמצעות מחקרי biophysical, כולל קריסטלוגרפיה באמצעות קרן רנטגן. למרות היותו יותר בניסוי דורש מערכות ביטוי baculovirus מציעות מספר יתרונות על פני א coli שהאחד מהם היא סביבה כמעט טבעית לחלבונים ממוצא אוקריוטים למשל הנוכחות של מלווים והזדמנות לשינוי שלאחר translational המתאימים. במסגרת המאמצים שלנו כדי להביע את kindlin-3, מארחים ביטוי חלופיים שימשו כוללים תא קווי יונקים וזני ביטוי חיידקים (תצפיות לא פורסמו). באופן כללי, א &#39;רבות coli זנים שנבדקו הפיקו כמויות קטנות מאוד של kindlin-3 רקומביננטי (~ 0.5 מ&quot;ג / ליטר של תרבות; תצפיות לא פורסמו). עם זאת, הביטוי מונע baculovirus בתאי חרקים היה יעיל במיוחד, ובשיתוףmparison לביטוי חולף בתאי יונקים, נוחים יותר ליצירת ביומסה הגדולה הנדרשת לבידוד מיליגרם של חלבונים רקומביננטיים cytoplasmic (תצפיות לא פורסמו). אנו משערים כי המלווים אוקריוטים הנוכחות עשויים לאפשר ייצור יעיל של kindlin-3. Baculoviridae להדביק תאי חרקים ולביטוי חלבונים רקומביננטיים baculovirus המשמש בעבודה זו מבוסס על Autographa californica וירוס polyhedrosis גרעיני (AcNPV). בטבע AcNPV, אשר מדביק californica Autographa (lopper אספסת) זחלי חרקים, דורש חלבון polyhedrin כדי ליצור חסימות לפי virons כמוסות במטריצת גבישי חלבון ובכך לספק את ההגנה הנדרשת לשחרורם. בתאים בתרבית היווצרות של גופי חסימה אינה נדרשת לשכפול ולכן הוא מיותר. במקרה של ביטוי חלבונים זרים גן חלבון polyhedrin יכול להיות replaced בAcNPV רקומביננטי עם הגן לחלבון של עניין. AcNPV יכול להדביק מיני Lepidopteron אחרים ולמטרות של frugiperda Spodoptera תולעת צבא ביטוי חלבון רקומביננטי תאי השחלה גלמים משמשים. בגישה שתוארה כאן, bacmid AcNPV (BAC10) מתוכנן כך שגן חיוני נגיפי, ORF1629, הוא מומת על ידי ההחדרה של transferase אצטיל כלורמפניקול וכתוצאה מכך bacmid עקום החוצה (BAC10: KO 1629), כך שזה לא מסוגל ליצור baculovirions זיהומיות 28. Cotransfection של תאי Sf9 עם BAC10 ינארית: KO 1629 ו תיקוני וקטור ההעברה FERMT3 המכיל ORF1629 פעיל, באמצעות טרנספוזיציה, וכתוצאה מהגנום קיימא שגם שילב את גן FERMT3 תחת השליטה של אמרגן polyhedrin 28. אנו מתארים פרוטוקול טיהור לבידוד של עכבר רקומביננטי טהור מאוד kindlin-3 דרך threגישת chromatographic צעד דואר. השיטות המשמשות כאן בקלות יכולה להיות מיושמות על חלבונים מתויגים-אחרים. אנחנו עובדים צעד חילוף יונים לטהר kindlin-3 נוסף אך אנו מאמינים כי מדובר בצעד פסאודו זיקה נוספת כמו kindlin-3 הוא בעל מספר גדול של שאריות בסיסיות, כוללים מתיחת poly-ליזין בתחום F1 שלה. בנוסף, kindlin-3 נחשב להיקשר ולאינטראקציה עם הפנים cytoplasmic של קרום הפלזמה, שבו הוא מתפקד, ולכן אנו צופים כי באשכולות של שאריות בסיסיות יאפשר את החלבון כדי לסתור את הממברנה הטעונה השלילי. המאגרים מתוארים בפרוטוקולים הטיהור נחשבים סטנדרטיים ומשמשים לעתים קרובות בביולוגיה מבנית. Assay thermofluor (איור 5) מראה כי kindlin-3 הוא יציב ברוב תנאי חיץ מעל pH 6.0. זה היה שימושי במיוחד וחשוב ליידע הניסויים שלנו כאשר לומדים kinldin-3: β1אינטראקציה זנב על ידי תמ&quot;ג, אשר הניב ספקטרום מצוין ב-pH 6.1 עם ריכוזים נמוכים של 12 NaCl. לפני שניתן יהיה התחייב כל מחקר biophysical, חשוב על מנת להוכיח כי החלבון מטוהר של עניין הוא אכן נכון מקופל והוא מבחינה תפקודית פעיל. בפרסום קודם הראינו כי kindlin-3 רקומביננטי הביע ומטוהר בשיטה זו הייתה מונומר וmonodispersed בפתרון, כפי שהוערך על ידי כרומטוגרפיה גודל הדרה, פיזור אור דינאמי, ultracentrifugation אנליטיים ופיזור קרני רנטגן בזווית קטן, והיה גם מסוגל מחייב והכרת NPxY קרום דיסטלי ואשכול סרין / תראונין במעלה הזרם של זנבות cytoplasmic 1A β 14, ובכך אישר כי הוא מתנהג כמו חלבון ילידים, אשר עולים בקנה אחד עם מחקרים סלולריים ופיסיולוגיים קודמים 14,20,22. שימוש assay יציבות תרמית הוא דרך נוספת של מציע הדואר קיפול נכון של חלבון של עניין, כמו חלבון מקופל בצורה לא נכונה יגרום רקע הקרינה גבוה בשל שאריות הידרופובי חשופות. משפחת kindlin של חלבונים הייתה במוקד תשומת לב רב מאז תפקידם בלתי צפוי כמו coactivators החיוני של integrins in vivo התגלה. זה מופעל מאמץ רב כדי לבטא אותם recombinantly ולפתור המבנים שלהם. עד כה הצלחה מוגבלת כבר דיווחה בהבעת כמויות מיליגרם של חלבון רקומביננטי באורך מלא, אבל יש לנו כאן תאר את השימוש במערכת baculovirus המאפשרת ביטוי בקנה מידה גדולה ברמות שבו המחקרים מבניים הפכו אפשריים. על ידי יצירת כמויות גדולות של kindlin-3 רקומביננטי אנו צופים כי זה יסייע במחקרים נוספים של חלבון זה. העבודה בשיטה וטיהור מונע baculovirus המתואר כאן לkindlin-3 עכבריים רקומביננטי יכול לשמש גם כדי להביע ולטהר isoforms kindlin האחר, שגם הם קשים להביע וגם להחזיק משתרעים poly-ליזין, ועשוי להיות מותאם יותר לחלבוני cytoplasmic אחרים, כגון חלבונים מחייבים חומצות גרעין, שאינם מצליחין לבטא בזני חיידקים.

חלבונים ממשפחת kindlin הם מרכיב חיוני של הרכבה הידבקות מוקד, ולכן חיוני לחיים מורכבים. Kindlins, אשר יש 3 isoforms ביונקים (kindlin-1, kindlin-2, וkindlin-3), נחשב coactivators של integrins קולטנים תאי לצד ילין 1. הידבקות תא בתיווך Integrin מחברת את תא השטח למטריצה ​​תאית (ECM) באאוקריוטים גבוהים יותר. זהו תהליך קריטי ונפוץ בשפע של תופעות פיסיולוגיות, הכוללות שלמות רקמות, עובר, מטבוליזם של עצם, עצירת דימום, וחסינות. הידבקות תא בתיווך Integrin מופעלת באמצעות מבפנים החוצה הולכים אותות באמצעות הקשירה של תלין וkindlin לזנבות β-למקטע integrin cytoplasmic (CTS) במוטיבי NPxY שימור שלהם. החשיבות של חלבונים ביו kindlin משתרעת עם זאת ככל הגרעין, שבי kindlin-2 הוכח בכמה דיווחים אחרונים להיות מעורבים בשעתוקאל לשלוט 2,3. Kindlins הם חלבוני multidomain של כ 75 kDa, בסימן החזקה של Ferm bipartite טרמינל C-(4.1 להקה, ezrin, radixin, moesin) תחום, שנקטע על ידי הומולוגיה pleckstrin תחום (PH) במרכזה של משנה F2 4,5. מחקרים של תחומים kindlin-2 וkindlin-3 PH הראו כי הוא נקשר לphosphatidylinositol-(3,4,5)-trisphosphate וphosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate 6-8 השליחים שני שומנים בדם. עם זאת, מחקרים של תחום PH kindlin-1 מראים כי הוא נקשר לPtdIns P (3,4,5) 3 עם זיקה הרבה יותר נמוכה, שיכול להיות מוסבר בkindlin-1 על ידי גשר מלח איזופורם ספציפי מניעת שומנים מלהיקשר 9. בנוסף, יש לולאה ~ 100 חומצת אמינו מוכנסת לתוך תחום F1 של kindlins שצפוי להיות פרש אבל נקשר phosphatidylserine בעלון הפנימי של קרום הפלזמה 10,11. Ferm kindlinתחום נחשב הומולוגי לתחום Ferm ילין, אם כי תחום Ferm ילין לא מחזיק תחום הומולוגיה pleckstrin. kindlins ונלין גם אינטראקציה עם מוטיבים NPxY על β-זנבות integrin דרך אזור F3 של תחום Ferm, אבל kindlin נקשר למוטיב דיסטלי הקרום, בעוד תלין מטרות הפרוקסימלי קרום אחד 12-16. Kindlins וילין שני בנוסף יש תחום F0 N-מסוף עם קיפול כמו היוביקוויטין-כי הוא לא נמצא בחלבוני Ferm אחרים 11,17. מחקרים על תחום F0 של kindlin-2 הראו כי הוא באופן עצמאי נקשר לממברנות מועשרים phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate 17. Kindlins מפגין דפוסי paralogue ספציפי רקמות ביטוי ופונקציות פיסיולוגיות nonredundant. Kindlin-1 בא לידי ביטוי בעיקר באפידרמיס, אלא גם במידה פחותה יותר במעי הגס, קיבה והכליות; kindlin-2 מתבטאים בכל מקום באבל מרוכזת במפוספס וחלקשרירים והם kindlin רק בא לידי ביטוי בהתפתחות עוברית 4; וkindlin-3 באו לידי ביטוי ברקמות hematopoietic עם הריכוז הגבוה ביותר של kindlin-3 נמצא בmegakaryocytes 18. עם זאת, מחקרים מאוחרים יותר הראו כי חלבון פונקציונלי באו לידי ביטוי, כמו גם 19 ברקמות האנדותל. Kindlin-3 הוא עניין רפואי אקוטי בשל התפקיד הפיזיולוגי החשוב שלה בדם. זה קריטי לאגרגציה של טסיות דם ומתפשט במהלך היווצרות פקיק 20, מתגלגל לויקוציטים בתגובה לזיהום ודלקת 21,22 והיווצרות podocyte osteoclast בספיגת עצם 23. יתר על כן, דלדול של kindlin-3 בבני האדם מוביל לויקוציטים הידבקות מחסור מסוג III - מחלה המאופיינת על ידי הפרעות דימום מסכני חיים וזיהומים חיידקיים חוזרים 20,24,25. מחקרים עקום החוצה Kindlin-3 בעכברים גילו את הפונקציה חיונית של החלבון בתא הידבקות KIND3 -. / - עכברים להציג פנוטיפים שונים, כגון דימום חמור בשל integrins פעילה טסיות דם, osteopetrosis החמור, והידבקות לויקוציטים לקויה 20,22, שמזכירים תסמינים בבני אדם חסרי kindlin-3. נתונים מבניים ברזולוציה גבוהה על kindlins, עד כה, הוגבל לתחומי משנה בודדים כגון ההומולוגיה pleckstrin תחום (PH) של kindlin-1 9 וkindlin-2 26,27 ותחום F0 של kindlin-1 11 וkindlin -2 17. רוב תחומי המשנה של כל פוליפפטיד kindlin יש אולם התנגד לשיבוט וניתוח מבני (ייטס וגילברט, תצפיות לא פורסמו), ומחקרים של החלבונים באורך מלא שהתעכבו בשל הקושי להביע וטיהור כמויות מספיקות באמצעות E. coli (תצפיות לא פורסמו וHarburger et al. 14). יש עניין רפואי רב בkindlin-3 ופו שלהnction, לצד שני בני משפחה האחרים, ולאחרונה נוצרו כמויות מיליגרם שלו על ידי ביטוי רקומביננטי בתאי frugiperda Spodoptera מונעים על ידי זיהום baculovirus 12. לפיכך, אנו כאן מתארים שיטות לייצור כמויות מיליגרם של kindlin-3 עכבר רקומביננטי בתרבית תאי חרקים, מתאימות למחקרים מבניים מקיפים וניתוח ביוכימי. בפרוטוקול זה אנו עושים שימוש bacmid מהונדס נוקאאוט (BAC10 KO: 1629) כלומר, לבד, לא מסוגל לייצר ויריונים קיימא 28. ה-DNA הנגיפי הוא חולץ ובכך על ידי רקומבינציה עם וקטור העברה כי במקרה זה כולל גם את גן kindlin-3 (FERMT3) ותוצאות בגן FERMT3 החלפת הווירוס מאוחר מאוד גן, אשר בא לידי ביטוי מאוד אבל מיותר, וכתוצאה מכך רקומביננטי וירוס שמבטא kindlin-3 העכבר כחלק ממחזור החיים של נגיף 28. זיהינו זהשיטה לייצור kindlin-3 לאחר הניסיונות להביע ולטהר אותו במארחי ביטוי אחרים היו קשים להחריד (תצפיות לא פורסמו), אלא גם בשל צדדיות של חבילת וקטור pOPIN, שבו השתמשה לשיבוט ושניתן לפרוס בביטוי רבים מארח 29.

<table><tbody><tr><td>Sf-900 II מדיה ללא סרום (SFM) 1x נוזל</td><td>Life Technologies</td><td>10902-096</td><td>חנות ב-4 מעלות; C ולחמם ל-RT לפני השימוש</td></tr><tr><td>Cellfectin II Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>10362-100</td><td>לחלופין, ניתן להשתמש במגיב טרנספקציה של GeneJuice (EMD)</td></tr><tr><td>סטרפטומיצין סולפט (מוצק)</td> <td>מסנן עיקור Melford</td><td>S0148</td> (<td>0.22 &mu; מסנן m) לפני השימוש</td></tr><tr><td>פניצילין G, מלח אשלגן (מוצק)</td> <td>מסנן עיקור מלפורד</td><td>P0580</td><td>(0.22 &mu; מסנן m) לפני השימוש</td></tr><tr><td>CELLSTAR סטרילי 6-well Culture Plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10100-147</td><td></td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז</td><td>Sigma</td><td>P8849</td><td>זהירות: מעכבי פרוטאז מומסים ב-DMSO</td></tr><tr><td>לבלב בקר דאוקסיריבונוקלאז (Dnase) I&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>HisTrap FF (5 מ"ל)</td><td>GE Heathcare</td><td>17-5286-01</td><td>דורש &Auml; מכונת KTA FPLC</td></tr><tr><td>HiTrap Heparin (5 מ"ל)</td><td>GE Heathcare</td><td>17-0407-01</td><td>דורש &Auml; מכונת KTA FPLC</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 יחידות סינון צנטריפוגליות (עם קרום Ultracel-50)</td><td>Millipore</td><td></td><td>UFC905024 קיבולת של 15 מ"ל ו-MWCO של רכז חלבון 50 kDa</td></tr></tbody></table>

הפקה וטיהור יעילה של רקומביננטי murine kindlin-3 מתאי חרקים לbiophysical לימודים

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins הוא coactivators חיוני, עם תלין, של integrins קולטני תא השטח וגם להשתתף בintegrin מחוץ-באיתות, והבקרה של שעתוק הגנים בגרעין התא. Kindlins הם ~ 75 חלבוני multidomain kDa ולהיקשר למוטיב NPxY ואשכול T / S במעלה הזרם של זנב cytoplasmic β-למקטע integrin. איזופורם hematopoietically החשוב kindlin, kindlin-3, הוא קריטי לאגרגציה של טסיות דם במהלך היווצרות פקיק, ויקוציטים מתגלגלים בתגובה לזיהום ודלקת והיווצרות podocyte osteoclast בספיגת עצם. התפקיד של Kindlin-3 בתהליכים אלה הביא למחקרים סלולריים ופיסיולוגיים רבים. עם זאת, יש צורך בשיטה יעילה של רכישת כמויות מיליגרם באיכות גבוהה של החלבון למחקרים נוספים. פיתחנו פרוטוקול, שתואר כאן, לביטוי והטיהור יעילים של kindlin-3 העכברי רקומביננטי על ידי שימוש בbaculovirus-dמשוסע מערכת ביטוי בתאי Sf9 מניב כמויות מספיקות של חלבון באורך מלא גבוה טוהר כדי לאפשר אפיון biophysical. אותה הגישה יכולה להילקח במחקר של isoforms kindlin יונקים האחר.

הביטוי בקנה מידה הגדולה של kindlin-3 עכבר רקומביננטי באמצעות תאים שנדבקו ב-Sf9 baculovirus יכול לקחת פחות משבועיים כדי להשיג כמויות מיליגרם, כפי שמודגם באיור 1 א סכמטי ודורש רק כמות קטנה מאוד של ה-DNA פלסמיד מערכת QIAprep Miniprep, עבור ירושלים. הדור של baculovirus רקומביננטי מושגת על ידי cotransfecting תאי Sf9 עם עכבר kindlin-3 (FERMT3) המכיל פלסמיד יחד עם מהונדס bacmid היא לינארית (BAC10: KO 1629) וקציר ויריונים שהוקמו אחרי 5-7 ימים, כפי שמוצג באיור 1 א. שיטה זו של תוצאות דור baculovirus בוירוסי רקומביננטי 100% ובעצם מוותרת על הצורך ב28,30 טיהור פלאק. תרבות נציג בקנה מידה קטנה (2 monolayer מיליליטר) תפיק פתרון המכיל וירוס רקומביננטי עם כייל צפוי ויראלי של יוצרי יחידות 1 x 10 7 פלאק (pfu) לכל מיליליטר שלתרבות. אחד יכול לבצע assay פלאק כדי לקבוע את כייל הנגיף בפועל אבל זה אולי גם עתיר עבודה, כאשר מספר גבוה של מבנים, נבחן צורך במחקרים מבניים. ההצלחה של צעד דור וירוס ניתן להעריך באמצעות פלסמיד המכיל eGFP במקביל, או, לkindlin-3 מבנה זה, monolayer Sf9 ניתן resuspended ב PBS והוערך על ידי SDS-PAGE ומערבי סופג, אשר בדרך כלל מדגים להקה ברורה המקביל לחלבון שלו מתויג 75 kDa, כפי שמוצג באיור 1. הווירוס מוגבר לאחר מכן לייצר כמויות מספיקות עבור בקנה מידה גדולה (כרכי ליטר) זיהום תא חרק ובידוד חלבון רקומביננטי. הווירוס השני המעבר (P2) נוצר על ידי הדבקה של תרבויות השעיה עם משרד הפנים משוער של 0.1 (ראה פרוטוקול). זה חיוני כי תרבות ההשעיה ההגברה Sf9 תופסת רק עשרים בסך הכל הבקבוק בנפח. אוורור נוסף זו מבטיח כי vir כתוצאהמדיה מכילה, שנקטפו לאחר 3 ימים (72 שעה) לאחר פגיעה, תפיק כמויות מספיקות של kindlin-3 בתרבות הביטוי לאחר מכן. המניה מוגברת הווירוס (P2) הנחה היא להחזיק כייל נגיף צפוי של 2 x 10 8 מיליליטר / pfu מבוססים על הערכה שמרנית של 100 pfu / תא באמצעות צפיפות תאים של 2 x 10 6 תאים / מיליליטר ביום 31 בהגברה. באופן כללי, לייצור הגברה baculovirus אופטימלית וחלבון, תאי Sf9 צריכים להיות אחידים בגודלם וכדורי, כפי שמוצגים באיור 1 ג. בנוסף, ביטוי הגברה וחלבון נגיפי הוא מקסימאלי ב72 לאחר זיהום משאבי אנוש, ושניהם מופחתים באופן משמעותי ב96 לאחר זיהום משאבי אנוש. ברגע שוירוס כבר מוגבר ונהג להדביק תאי Sf9 בניסויים בקנה מידה גדולים kindlin-3 רקומביננטי הוא מטוהר באופן חלקי מכוח chro המהונדס בטרמינל C-6-התג באמצעות משותק זיקת מתכתmatography, כפי שמוצג באיור 2. חשוב לבצע את הטיהור על 4 מעלות צלזיוס וכי מעכבי פרוטאז מספיק נוספו כדי למנוע proteolysis. Kindlin-3 באופן חלקי המטוהר מטוהר נוסף להומוגניות קרובה על ידי כרומטוגרפיה חילוף יונים (IEC) באמצעות טור הפרין, כפי שמוצג באיור 3. אנחנו עובדים על השימוש בטור הפרין במקום עמודת מטבע יונית קונבנציונלית, כפי שחזינו כי המספר הגדול של שאריות בסיסיות, כולל מתיחת poly-ליזין בתוך תחום F1 kindlin-3, הייתי אינטראקציה חזקה עם מטען השלילי קבוצות סולפט של העמודה. אסטרטגיה זו היא שימושית במיוחד עבור ה-DNA וחלבונים קושרי RNA עם תיקונים מחייבים חומצות גרעין בסיסיים, למשל המסוף מחייב RNA uridylyltransferase Cid1 32. לבסוף kindlin-3 טוהר הוא &quot;מלוטש&quot; על ידי כרומטוגרפיה הדרת גודל להסיר אגרגטים ולהשיג הומוגניות, כפי שמוצג באיור 4. המאגרים שצוינו בפרוטוקולים הם מאגרים סטנדרטיים המשמשים לעתים קרובות בטיהור חלבונים לניתוח מבני. באופן כללי, מאגרים על בסיס פוספט, הם נמנעו לטיהור חלבונים למחקרים מבניים, במיוחד הקרנת התגבשות עקב היווצרות של גבישי פוספט בטיפי ההתגבשות (במיוחד עבור ניסויים על 4 מעלות צלזיוס). עם זאת, ביצענו assay משמרת תרמי מבוססת Thermofluor כדי לקבוע אילו מאגרים היו ייצוב לkindlin-3, כפי שמוצג באיור 5. בקצרה, פתרון חלבון מטוהר מדולל למאגרים שמכסים טווח של ריכוזי כלוריד pH ונתרן, ולכן יוצר מסך 2 ממדים. ההיתוך של החלבון נמדד על ידי התבוננות את הקרינה מצבע Sypro הכתומה (בדיקות מולקולריות), שנקשר לשאריות הידרופובי בתוך ליבת החלבון המקופלת, מעל C ° 20-95 טווח טמפרטורות (293-368 K). טמפרטורת נקודת האמצע שבו בהחלבון דואר נפרש (טמפרטורת מעבר, T מ &#39;) חושב באמצעות תוכנת Opticon הצג והוא מתוארת במקומות אחרים 33. Kindlin-3 נצפה להיות יציבים בריכוזים גבוהים של נתרן כלורי (500 מ&quot;מ) בטווח pH 7.0-9.0, עם טמפרטורה עקבית מעבר (T מ) 55 ° C. כמו כן, ציין כי מ &#39;T של Kindlin-3 היה כ 55 ° C בטווח pH 7.0-7.5 ללא קשר לריכוז נתרן כלורי. מצאנו שיש proteolysis המוגבל של kindlin-3 במהלך הטיהור אבל SDS-PAGE ניתוח של חלבון מרוכז מאוד (~ 15 מ&quot;ג / מיליליטר) הראה זיהום מוגבל עם שני פוליפפטידים נוספים של עוצמה שווה. באופן מוזר, עם זאת אין כל אינדיקציה של מינים נוספים של כרומטוגרפיה הדרת גודל, כפי שמוצג באיור 4. וכך הוא חשב כי חלבון חתוכות ידי פרוטאזות אך נשאר מקופל וhydrodynאין להבחין amically מחלבון באורך מלא. מעניין, calpain הוא פרוטאז ידוע כי דבק kindlin-3 בTyrosine373, שהוא בלולאת β1-β2 של ההומולוגיה pleckstrin תחום (PH) 34 ועשויים להסביר את התצפיות שלנו. יתר על כן, מערבי סופג מגלה כי אחד מכפילויות פוליפפטיד בעל טרמינל C-התג שלו והמשקל המולקולרי לכאורה של כפיל, כאשר סיכמו, שווה 75 kDa, אותו המשקל מולקולרי של החלבון המקורי. התשואה של kindlin-3 המטוהרים רקומביננטי לליטר של תאי Sf9 (~ משקל תא 2 ז) היא, במקרה הטוב, 5 מ&quot;ג. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig1.jpg" /> איור 1. סקירת סקירה של ביטוי חלבון Heterologous נגוע baculovirus תאי חרקים. () schematized של generatio baculovirusn וביטוי של kindlin-3 בתאי Sf9. בשרטוטי וקטור ה-DNA, 5&#39;UTR / ORF603 הוא בצבע באדום, ORF1629 הוא בצבע ירוק וב, את הגן של החלבון של עניין (POI) הוא בצבע כחול. (ב) כתם מערבי, באמצעות נוגדן 6 נגדו, של שש תרבויות (2 monolayer מיליליטר) בקנה מידה קטנה (נתיבים מסומנים בהתאם לתרבות) של תאי Sf9 הפקת baculovirus רקומביננטי וkindlin-3 העכברי רקומביננטי. (C) תמונת מיקרוסקופ אור של תאי Sf9 בריאים גדלו בהשעיה בSF-900 השני SFM בתוספת אנטיביוטיקה והועברה לצלחת 35 מ&quot;מ תרבית רקמה היטב (ראה פרוטוקול). תמונה היא בהגדלה 20X. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig2.jpg" /> איור 2. Represeטיהור ntative של kindlin-3 על ידי כרומטוגרפיה משותקת זיקת מתכת (IMAC). SDS-PAGE של זיקת ניקל מטוהר רקומביננטי עכברי kindlin-3 הביע בbaculovirus תאים הנגועים Sf9 (~ משקל תא 2 גר &#39;). חלבון Adsorbed היה eluted באמצעות שיפוע imidazole (המוצג לעיל ג&#39;ל). נתיבים מסומנים כדלקמן: MW, סמן משקל מולקולרי; ליס, lysate התא כולו; FT, לזרום דרך (מאוגד); WI, לשטוף 1; WII, לשטוף 2. ניתוח כתם מערבי (להלן) בוצע גם באמצעות השברים elution כדי לאשר את קיומו של מהונדס התג שלו על חלבון רקומביננטי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51206/51206fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig3.jpg" /> איור 3. Repreפרופיל Elution טיהור sentative של kindlin-3 על ידי הפרין זיקה כרומטוגרפיה. () נצפה ב280 ננומטר (כחול) בו מוצגות שיא סימטרי אחת משחררי תחת שיפוע נתרן כלוריד ליניארי (ירוק) שימוש בטווח ריכוז NaCl של .05-1.0 מ &#39;( B) SDS-PAGE ניתוח של elution המופרד מפגין את נוכחותו של חלבון kDa 75, kindlin-3 (K3 שכותרת). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51206/51206fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig4.jpg" /> איור 4. נציג כרומטוגרפיה סינון ג&#39;ל ומרוכז kindlin-3. פרופיל elution סינון ג&#39;ל (א) לkindlin-3 המטוהרים באמצעותS200 Superdex (16/60) בטריס-HCl, pH 7.5, 150 מ&quot;מ NaCl ו1 מ&quot;מ DTT ב20 ° C. בהתבסס על elution הנפח, kindlin-3 נודד כצפוי לחלבון kDa 75, מה שמרמז שזה בעיקר monomeric. (B)-SDS של מרוכז מאוד מטוהר kindlin-3 רקומביננטי ב14.5 מ&quot;ג / מיליליטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51206/51206fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig5.jpg" /> Assay Shift תרמי מבוסס Thermofluor איור 5. להצפת הקרנה. Kindlin-3 היה מדולל למאגרים שונים המרכיבים מסך דו ממדים של ה-pH לעומת ריכוז נתרן כלורי. טמפרטורות מעבר (טמפרטורת אמצע נקודות) נצפו על ידי הקרינה שלצבע קשור hydrophobically, כתום Sypro (בדיקות מולקולריות) ומחושב באמצעות תוכנת Opticon הצג. (א) היסטוגרמה 3D של טמפרטורות המעבר היא להתוות יחד עם (ב) השינוי בטמפרטורת מעבר מהממוצע המחושב של 50.4 ° ​​C. לשם בהירות הברים נצבעים בהתאם לטווח של טמפרטורות שבה הם מתאימות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51206/51206fig5highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Kindlins הוא יסוד להידבקות תא דרך integrins אך מחקרים שלהם כבר הקשו על ידי הקושי שנתקל בביטוים recombinantly במארחי חיידקים. אנו מתארים כאן שיטות לייצור היעילה שלהם בתאי חרקים שנדבקו ב-baculovirus.

הפקה וטיהור יעילה של רקומביננטי Murine Kindlin-3 מתאי חרקים לBiophysical לימודים

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

המטרה הכוללת של הניסויים הבאים היא לייצר ביעילות כמויות של מיליגרמים של Miran Kinlin three בתרבית תאי חרקים, אשר לא ניתן לייצר במאכסני ביטוי אחרים. הדבר מושג על ידי COT transecting, וקטור העברה של KINLIN three יחד עם bao virus back mid מהונדס כדי ליצור bao virus רקומביננטי הנושא את הגן KINLIN three. כשלב שני, הנגיף מורבה בתוך תאי חרקים כדי לייצר כמות מספקת של ויריונים לשלבים הבאים.בשלב הבא, תאי חרקים מודבקים כדי להפיק כמויות גדולות של חלבון Kinlin three, על מנת לאפשר לנו ביצוע טיהור באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית מהירה. התוצאות שהתקבלו מראות כי ניתן להפיק Kinlin three תפקודי בדרגת טהרה גבוהה בכמויות של מיליגרמים, על בסיס אנליזת SDS page וכרומטוגרפיית הדרכה של גודל (size exclusion chromatography). היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ביטוי של Kinlin three בחיידקים, הוא שביטוי בתאי חרקים המודבקים בנגיף baculovirus מגדיל את תנובת החלבון הרקומביננטי פי עשרה.תאי ה-SF nine עבור פרוצדורה זו תורגשו ונשמרו בסספנסיה באמצעות מצע SF 902 המועשר ב-100 µg/mL פניצילין ו-100 µg/mL סטרפטומייסין. ליצירת נגיף bao, יש לתרגש את התאים עד לטווח צפיפות של 5×10⁵ עד 1×10⁶ תאים ל-mL. כדי להכין את תאי ה-SF nine לטרנספקציה, זרקו כ-1×10⁶ תאים לבאר בתוך פלטת תרבית רקמות סטרילית של שש בארות, בשני mL של מצע SF 902 המועשר בפניצילין ובסטרפטומייסין. השאירו את תאי ה-SF nine למשך כ-20 דקות בטמפרטורת החדר בתוך מ常用的 מנדף כימי כדי שיידבקו לבסיס הבארות הפלסטיות ובכך יצרו שכבה אחת (monolayer). יצירת נגיף balo רקומביננטי מושגת על ידי קו-טרנספקציה של DNA פלסמידי ו-BMid DNA לתוך תרבית של תאי SF nine בשכבה אחת.וקטור הביטוי papine neuron firm T three מכיל את הגן KINLIN three של עכבר בגרסה firm T three. הוא נמצא תחת בקרתו של הקידום הויראלי P 10 BAO וכולל רצפים ויראליים של bao בצדדיו כדי לאפשר רקומבינציה עם ה-back mid, ומקודד לתג hiss six בקצה ה-C לצורך טיהור בהמשך. עבור כל טרנספקציה, מערבבים 1-2 µg של MFI T three מטוהר עם 0.5 µg של B mid מטוהר ו-100 µL של SF 902 SFM ללא אנטיביוטיקה. זהו תמיסה A. במבחנה נפרדת, מדללים 6 µL של cell effect in two reagent ב-100 µL של SF 902 SFM ללא אנטיביוטיקה.עבור כל תגובת טרנספקציה, ניתן להכין כאן תערובת מאסטר (master mix) כדי לצמצם את הטיפול בנוזלים אם נדרשות טרנספקציות רבות. זהו תמיסה B. ערבבו את שתי התמיסות A ו-B תוך שימוש בכ-200 µl מכל אחת לכל טרנספקציה, והדגרירו בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות ליצירת קומפלקסים של ליפיד-DNA. לאחר 20 דקות, דללו את קומפלקסי הליפיד-DNA עם 800 µl לכל טרנספקציה של SF 902 SFM ללא אנטיביוטיקה. לאחר מכן, שאבו בזהירות את המצע של מונושכבת תאי SF nine והעבירו בזהירות באמצעות פיפט את תערובת תמיסות AB והמצע על גבי מונושכבת SF nine.דגרו את התאים שעברו טרנספקציה באינקובטור לח בטמפרטורה של 27 degrees Celsius למשך לילה, על מנת ליצור סביבה לחה שתמנע את התייבשות התאים. הניחו את צלחת שש-הבארים בתוך מכל פלסטיק עם מכסה, לצד נייר סופג לח. למחרת, הוסיפו 1 mL נוסף של SF 900 to SFM ללא אנטיביוטיקה לכל תרבית בשכבה אחת (monolayer), ודגרו את התאים בטמפרטורה של 27 degrees Celsius למשך חמישה ימים נוספים.לאחר חמישה ימים, קצרו את נגיף ה-bao הרקומביננטי ישירות מתווך התרבית והעבירו אותו לשפופרת צנטריפוגה נקייה. הסִירו שאריות תאי SF nine באמצעות צנטריפוגציה ב-1000 Gs למשך חמש דקות. בטמפרטורת החדר, העבירו את הנגיף, שנמצא בעיקר (supernatant) שהתקבל ומסומן כ-P1, לשפופרת נקייה. ניתן להניח כי לדור הנגיף P1 יהיה תיתר נגיפי צפוי של 1 × 10⁷ PFU למילליליטר.למרות שניתן לבצע SA של פלאקים במידת הצורך, יש לאחסן את מלאי הנגיפים של P one בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס בחושך עד לשימוש. תאי SF nine המשמשים להגברה של נגיף balo רקומביננטי בתרחיף צריכים להיות בריכוז של 1.4 × 10⁶ תאים למיליליטר, והתרבית צריכה לתפוס אחת מ-20 מהנפח הכולל של הבקבוק. לדוגמה, 50 מיליליטר בבקבוק של שני ליטר. באופן כללי, לצורך הגברה אופטימלית של נגיף vao וייצור חלבונים, תאי SF nine צריכים להיות אחידים בגודלם ובעלי צורה כדורית.הדביקו את תרבית תאי ה-SF nine במלאי נגיפי P one בריבוי הדבקה (multiplicity of infection) או MOI של 0.1 באמצעות הנוסחה הבאה. דגרו את תרבית החרקים המודבקת ב-P one בטמפרטורה של 27 °C עם ניעור במהירות של 100 RPM למשך 72 שעות. לאחר שלושה ימים, קצרו את הנגיף על ידי הפרדת התאים מהמצע באמצעות סנטריפוגציה ב-1000 Gs למשך חמש דקות.בטמפרטורת החדר, העבירו את המדיום המועשר בנגיפים המזוקק למבחנה נקייה. מלאי נגיפים זה מסומן כ-P2 והטרה הנגיפית הצפויה היא 2×10⁸ PFU למילליליטר. אחסנו מלאי נגיפים זה ב-4°C בחושך עד לשימוש, ושמרו את משקעי התאים שהתקבלו ב-20°C- לצורך אישור מאוחר יותר של ייצור נגיף רקומביננטי.כדי להתחיל בהליך זה, גדלו נפח מספיק של תרביות תאי SF nine בסספנסיה ובמדיום SF 902 s fm, בתוספת 100 µg/mL פניסילין ו-100 µg/mL סטריפטומייסין. היחס בין הנפח הכולל של התרבית לנפח הבקבוק צריך להיות 1:5.דגרו את תרביות הסספנסיה בטמפרטורה של 27 °C עם ניעור במהירות של 100 RPM עד שיגיעו לצפיפות תאים של 2×10⁶ תאים למילליליטר. כאשר תרביות ה-SF9 נמצאות בצפיפות של 2×10⁶ תאים למילליליטר, הן מוכנות להדבקה בנגיף ה-Balo. הוסיפו לתרביות סרום עגל עד לריכוז סופי של 1% ומיד לאחר מכן הוסיפו את מלאי הנגיף מדור P2.כדי להגיע ל-MOI של 1, דגרו את התרביות המודבקות בטמפרטורה של 27 °C עם ניעור ב-100 RPM. 72 שעות לאחר ההדבקה, אספו את תאי ה-SF nine המבטאים lin three רקומביננטי עם תג poly histamine על ידי סרכוז ב-1000 ×g למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. שמרו את משקע התאים שהתקבל בטמפרטורה של 20- °C עד לשימוש, או בטמפרטורה של 80- °C לאחסון לטווח ארוך. הליך זה מתחיל בהפשרה על קרח.המשקעים הקפואים של תאי SF nine שהודבקו בנגיף vao ומבטאים kinlin three רקומביננטי, וריספנסיה (Resus) של המשקעים באמצעות בופר ליזיס. לאחר דגירה של התאים שבוצע להם ריספנסיה עם בופר הליזיס למשך 5 עד 10 דקות, יש לבצע וורטקס עד להשגת תמיסת ריספנסיה הומוגנית לצורך פירוק תאים נוסף. יש לבצע סוניקציה לדגימה בתוך אמבט קרח.יש להבהיר את הליזאט באמצעות סנטריפוגציה ב-48,000 GS למשך שעה אחת בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. יש להעמיס את הסופרנטנט שיתקבל על עמודת hist trap בנפח של חמישה מיליליטר, שהושרתה מראש בבופר ליזיס בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, בקצב של מיליליטר אחד לדקה. שלבים עוקבים של אלוציה של החלבון, החלפת בופר וריכוז החלבון לא יודגמו כאן, אך הם מפורטים בכתב היד הנלווה.לאחר קבלת תמיסת החלבון שעברה החלפת באפר, יש להעביר אותה לעמודת high trap heparin HP בנפח של 5 mL שעברה שיווי משקל מוקדם, באמצעות מערכת ACTA FPLC, בקצב של 0.5 mL לדקה. KINLIN 3 הקשור נשטף באמצעות גרדיאנט ליניארי של sodium chloride באותו באפר, העולה בקצב של 10 mM ל-mL recombinants histamine tags. KINLIN 3 צפוי להשתחרר (elute) בריכוז של כ-0.6 M sodium chloride. לאחר ריכוז החלבון, השלב האחרון הוא החלפת באפר של החלבון באמצעות כרומטוגרפיית הפרדה לפי גודל (size exclusion chromatography); יש להעביר את החלבון המטוהר לעמודת SUEx S 210 30, ולטהר את החלבונים לפי גודלם על ידי הזרמת באפר לעמודה בקצב של 0.5 mL לדקה.החלבון המופק מהעמודה עובר הפרדה לשברים (fractionated) ומנוטר באמצעות בליעה ב-280 nanometers. הצלחתו של ייצור הנגיף הרקומביננטי אומתה על ידי הערכת נוכחותו של Kinlin three רקומביננטי בתאי SF nine שעברו טרנספקציה (COT TRANSFECTED) באמצעות SDS page ואנליזת Western, כפי שניתן לראות ב-Western blot מייצג של שש תרביות SF nine בקנה מידה קטן תוך שימוש בנוגדן anti hiss six. פס רחב וברור המתאים לחלבון עם תג hiss במשקל 75 kilodalton היה נראה בכל דגימה לאחר שהנגיף הורבה ושימש להדבקת תאי SF nine בניסויים בקנה מידה גדול. KINLIN three רקומביננטי טוהרה חלקית באמצעות כרומטוגרפיית ספיחה של מתכת מאובלנית (immobilized metal affinity chromatography).תמונת הג'ל הראשית באיור זה מציגה SDS page של kinlin three רקומביננטי של עכבר, שעבר טיהור באפיניות לניקל והובע בתאי SF nine שהודבקו בנגיף BAO. החלבון שנספח נאלוט באמצעות מדרג של imidazole כפי שמוצג מעל לתמונת הג'ל. MW מציין סממן של משקל מולקולרי, LYS הוא ליזאט של תא שלם, FT הוא השטוף (flow through), WI הוא שטיפה אחת ו-WII הוא שטיפה שתיים. ניתוח Western blot בוצע גם עבור פראקציות האלוציה כדי לאשש את נוכחותו של תג ה-his ההנדסי בחלבון הרקומביננטי.בשלב הבא, KINLIN three המטוהר חלקית טוהר עוד יותר עד לרמה של כמעט הומוגניות באמצעות כרומטוגרפיית חילוף יונים בעזרת עמודת heparin. פאנל זה מציג את פרופיל האלוציה שנצפה ב-280 nanometers בכחול, המראה שיא סימטרי יחיד המאלוא בגרדיאנט ליניארי של sodium chloride המסומן בירוק, תוך שימוש בטווח ריכוזים של sodium chloride בין 0.05 molar ל-1.0 molar. הפאנל התחתון מציג את תוצאות ניתוח ה-SDS page של האלוציה המופרדת, המדגימות את נוכחותו של החלבון Kinlin three בעל המשקל המולקולרי 75 kilodalton.כשלב סופי, טהרת ה-KINLIN three שופרה באמצעות כרומטוגרפיית הפרדה לפי גודל (size exclusion chromatography) כדי להסיר אגרגטים ולהשיג הומוגניות. פרופיל אלוציית ג'ל פילטרציה מייצג זה הוא של Kinlin three מטוהרה באמצעות SUEx S 200 ב-Tris HCL pH 7.5, 150 millimolar sodium chloride ו-one millimolar DTT בטמפרטורה של 20 degrees Celsius. בהתבסס על נפח האלוציה, KINLIN three נדוד כפי שצפוי עבור חלבון של 75 kilodalton, מה שמעיד על כך שהוא בעיקר מונומרי.האיור הבא מציג תוצאות של SDS page של קינלין 3 רקומביננטי מטוהר בריכוז גבוה, המסומן כ-K3, בריכוז של 14.5 mg/mL. ייצור של כמויות של מיליגרמים של קינלין 3 מלא מאושח של עכבר בדרגת טוהר גבוהה בתרבית תאי חרקים יאפשר מחקרים מבניים נרחבים ואנליזה ביוכימית של החלבון. במחקר זה בוצע גם Thermo shift assay מבוסס Thermo Fluor כדי לקבוע אילו באפרים מייצבים את קינלין 3.KINLIN three דולל למספר באפרים שונים, המהווים סריקה דו-ממדית של pH לעומת ריכוז נתרן כלוריד. הפאנל העליון הוא היסטוגרמה תלת-ממדית של טמפרטורות המעבר, והפאנל התחתון מראה את השינוי בטמפרטורת המעבר ביחס לממוצע המחושב של 50.4 °C. העמודות צבועות בהתאם לטווח הטמפרטורות שאליו הן מקושרות.נצפה כי KINLIN three יציב בריכוזים גבוהים של sodium chloride בטווח PA של 7.0 עד 9.0, עם טמפרטורת מעבר עקבית של 55 °C. כמו כן, נצפה כי טמפרטורת המעבר של Kinlin three הייתה כ-55 °C בטווח PA של 7.0 עד 7.5, ללא קשר לריכוז ה-sodium chloride.לאחר צפייה בסרטון זה, תגמרו עם הבנה טובה של אופן הפקתו של kindling רקומביננטי פונקציונלי ברמת טוהר גבוהה, לצורך אפיון ביופיזיקלי מעמיק ובדיקות נוספות. ניתן להשתמש בגישות דומות עבור דגימות חלבון אחרות שקשה להכין, ואנו ממליצים על יישומן במקרים אלו.

efficient-production-purification-recombinant-murine-kindlin-3-from

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטה להכנת תאים חרקים להדביק אותם עם baculovirus לצורך הייצור של proteinand רקומביננטי mCD1d יצירת tetramers mCD1d.

שיטה לייצור של חלבון רקומביננטי mCD1d בתוך תאים חרקים.

בעידן שאחרי האדם הגנומיקה, הזמינות של חלבונים רקומביננטיים של תצורות המקומיים הוא חיוני למחקר מבנית, תפקודית טיפולית ופיתוח. כאן אנו מתארים מבחן רחב היקף של ביטוי חלבונים מערכת עובריים אנושיים לתאי כליה 293T, שניתן להשתמש בהם כדי לייצר מגוון של חלבונים רקומביננטיים.

פלטפורמת ביטוי נוח כללי לייצור חלבונים המופרשים מ תאים אנושיים

הסרטון מסביר את תהליך ייצור הנוגדנים בתאי המאכסן של יונקים, משלב ביטוי הגנים ועד להפרשה. זה כרוך בתמלול, תרגום, זיהוי אותות, קיפול נכון, ובסופו של דבר שחרור לתוך התווך החוץ תאי באמצעות שלפוחיות הפרשה.

ייצור וטיהור נוגדנים רקומביננטיים מתאי יונקים

ביטוי חלבונים רקומביננטיים על ידי מערכות יונקים הופך לשיטה אטרקטיבית לייצור קומפלקסים של חלבונים לביולוגיה מבנית. כאן אנו מציגים מערכת ביטוי פשוטה אך יעילה ביותר המשתמשת בתאי יונקים שגדלו בתרחיף לטיהור קומפלקסים של חלבונים למחקרים מבניים.

ביטוי חלבון רקומביננטי לביולוגיה מבנית בתאי ההשעיה HEK 293F: רומן וגישה נגישה

זהו פרוטוקול מהיר וחסכוני לייצור חלבוני יונקים מופרשים ומסוכררים וטיהור חד-שלבי לאחר מכן עם תפוקות מספיקות של חלבון הומוגני לקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן ומחקרים ביופיזיקליים אחרים.

ביטוי יעיל יונקים ניידים וטיהור חד צעד של תאי גליקופרוטאינים להתגבשות

קינאז IκB 1/α (IKK1/α CHUK) הוא חלבון Ser/חמישי קינאז מעורב מספר עצום של פעילויות הסלולר בעיקר באמצעות הפעלה של גורמי שעתוק NF-κB. כאן, אנו מתארים את השלבים העיקריים הדרושים כדי להפוך את ייצור מכשור לקביעת קשיות ומבנה הגביש של חלבון זה.

מדריך הייצור, התגבשות ונחישות מבנה של IKK1 האנושי/α

כאן, אנו מציגים פרוטוקול בייצור המוני של ג'ין להחרשת תאי NK מאתר באמצעות מערכת בידול נטולת מזין עבור המחקר מכניסטית חוץ גופית בתוך ו ויוו.

הרומן מזין ללא מערכת לייצור המוני של תאים רוצח טבעי מאתר במבחנה

רקומביננטי BDNF המכיל רצף Avi (Bdnפאבאני) מופק בתאים HEK293 באופן חסכוני ומטוהר על ידי כרומטוגרפיה של זיקה. לאחר מכן BDNFavi באופן ישיר מונו-biotinylated עם בירה אנזים בשפופרת. Bdn, ו מונו-biotinylbdni שמירה על הפעילות הביולוגית שלהם בהשוואה BDNF זמין מסחרית.

פרוטוקול משופר כדי לטהר ו מונו ישירות-Biotinylate BDNF בתוך צינור ללימודי סחר בתאי הסלולר בנוירונים

טיהור התג שלו, דיאליזה, והפעלה מועסקים כדי להגדיל את התשואות של מסיס, מטריצה פעילה metalloproteinase-3 ביטוי חלבון תחום קטליטי בחיידקים. שברי חלבון מנותחים באמצעות ג'ל SDS-PAGE.

ביטוי חיידקי וטיהור של מטריקס אנושי Metalloproteinase-3 באמצעות כרומטוגרפיה זיקה

פרוטוקול זה מתאר את ייצור ריבנוקלאז SLFN14 הרקומביננטי האנושי ואת ניתוחו הסטוכיומטרי באמצעות פוטומטריית מסה.<br...

ייצור מהיר של SLFN14 ריבונוקלאז רקומביננטי וניתוח סטויכיומטרי באמצעות פוטומטריית מסה

למדו כיצד לייצר ולטהר חלבון Kindlin-3 מרקומביננטי בכמויות מיליגרם באמצעות תאי חרקים נגועים בבקולובירוס. שיטה זו מגבירה את התפוקה פי עשרה בהשוואה לבקטריות ומאפשרת מחקרים ביופיזיקליים מעמיקים.

הפקה וטיהור יעילה של רקומביננטי Murine Kindlin-3 מתאי חרקים לBiophysical לימודים

גלה סרטונים נוספים