הפקה וטיהור יעילה של רקומביננטי Murine Kindlin-3 מתאי חרקים לBiophysical לימודים

המטרה הכוללת של הניסויים הבאים היא לייצר ביעילות כמויות של מיליגרמים של Miran Kinlin three בתרבית תאי חרקים, אשר לא ניתן לייצר במאכסני ביטוי אחרים. הדבר מושג על ידי COT transecting, וקטור העברה של KINLIN three יחד עם bao virus back mid מהונדס כדי ליצור bao virus רקומביננטי הנושא את הגן KINLIN three. כשלב שני, הנגיף מורבה בתוך תאי חרקים כדי לייצר כמות מספקת של ויריונים לשלבים הבאים.

בשלב הבא, תאי חרקים מודבקים כדי להפיק כמויות גדולות של חלבון Kinlin three, על מנת לאפשר לנו ביצוע טיהור באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית מהירה. התוצאות שהתקבלו מראות כי ניתן להפיק Kinlin three תפקודי בדרגת טהרה גבוהה בכמויות של מיליגרמים, על בסיס אנליזת SDS page וכרומטוגרפיית הדרכה של גודל (size exclusion chromatography). היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ביטוי של Kinlin three בחיידקים, הוא שביטוי בתאי חרקים המודבקים בנגיף baculovirus מגדיל את תנובת החלבון הרקומביננטי פי עשרה.

תאי ה-SF nine עבור פרוצדורה זו תורגשו ונשמרו בסספנסיה באמצעות מצע SF 902 המועשר ב-100 µg/mL פניצילין ו-100 µg/mL סטרפטומייסין. ליצירת נגיף bao, יש לתרגש את התאים עד לטווח צפיפות של 5×10⁵ עד 1×10⁶ תאים ל-mL. כדי להכין את תאי ה-SF nine לטרנספקציה, זרקו כ-1×10⁶ תאים לבאר בתוך פלטת תרבית רקמות סטרילית של שש בארות, בשני mL של מצע SF 902 המועשר בפניצילין ובסטרפטומייסין. השאירו את תאי ה-SF nine למשך כ-20 דקות בטמפרטורת החדר בתוך מ常用的 מנדף כימי כדי שיידבקו לבסיס הבארות הפלסטיות ובכך יצרו שכבה אחת (monolayer). יצירת נגיף balo רקומביננטי מושגת על ידי קו-טרנספקציה של DNA פלסמידי ו-BMid DNA לתוך תרבית של תאי SF nine בשכבה אחת.

וקטור הביטוי papine neuron firm T three מכיל את הגן KINLIN three של עכבר בגרסה firm T three. הוא נמצא תחת בקרתו של הקידום הויראלי P 10 BAO וכולל רצפים ויראליים של bao בצדדיו כדי לאפשר רקומבינציה עם ה-back mid, ומקודד לתג hiss six בקצה ה-C לצורך טיהור בהמשך. עבור כל טרנספקציה, מערבבים 1-2 µg של MFI T three מטוהר עם 0.5 µg של B mid מטוהר ו-100 µL של SF 902 SFM ללא אנטיביוטיקה. זהו תמיסה A. במבחנה נפרדת, מדללים 6 µL של cell effect in two reagent ב-100 µL של SF 902 SFM ללא אנטיביוטיקה.

עבור כל תגובת טרנספקציה, ניתן להכין כאן תערובת מאסטר (master mix) כדי לצמצם את הטיפול בנוזלים אם נדרשות טרנספקציות רבות. זהו תמיסה B. ערבבו את שתי התמיסות A ו-B תוך שימוש בכ-200 µl מכל אחת לכל טרנספקציה, והדגרירו בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות ליצירת קומפלקסים של ליפיד-DNA. לאחר 20 דקות, דללו את קומפלקסי הליפיד-DNA עם 800 µl לכל טרנספקציה של SF 902 SFM ללא אנטיביוטיקה. לאחר מכן, שאבו בזהירות את המצע של מונושכבת תאי SF nine והעבירו בזהירות באמצעות פיפט את תערובת תמיסות AB והמצע על גבי מונושכבת SF nine.

דגרו את התאים שעברו טרנספקציה באינקובטור לח בטמפרטורה של 27 degrees Celsius למשך לילה, על מנת ליצור סביבה לחה שתמנע את התייבשות התאים. הניחו את צלחת שש-הבארים בתוך מכל פלסטיק עם מכסה, לצד נייר סופג לח. למחרת, הוסיפו 1 mL נוסף של SF 900 to SFM ללא אנטיביוטיקה לכל תרבית בשכבה אחת (monolayer), ודגרו את התאים בטמפרטורה של 27 degrees Celsius למשך חמישה ימים נוספים.

לאחר חמישה ימים, קצרו את נגיף ה-bao הרקומביננטי ישירות מתווך התרבית והעבירו אותו לשפופרת צנטריפוגה נקייה. הסִירו שאריות תאי SF nine באמצעות צנטריפוגציה ב-1000 Gs למשך חמש דקות. בטמפרטורת החדר, העבירו את הנגיף, שנמצא בעיקר (supernatant) שהתקבל ומסומן כ-P1, לשפופרת נקייה. ניתן להניח כי לדור הנגיף P1 יהיה תיתר נגיפי צפוי של 1 × 10⁷ PFU למילליליטר.

למרות שניתן לבצע SA של פלאקים במידת הצורך, יש לאחסן את מלאי הנגיפים של P one בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס בחושך עד לשימוש. תאי SF nine המשמשים להגברה של נגיף balo רקומביננטי בתרחיף צריכים להיות בריכוז של 1.4 × 10⁶ תאים למיליליטר, והתרבית צריכה לתפוס אחת מ-20 מהנפח הכולל של הבקבוק. לדוגמה, 50 מיליליטר בבקבוק של שני ליטר. באופן כללי, לצורך הגברה אופטימלית של נגיף vao וייצור חלבונים, תאי SF nine צריכים להיות אחידים בגודלם ובעלי צורה כדורית.

הדביקו את תרבית תאי ה-SF nine במלאי נגיפי P one בריבוי הדבקה (multiplicity of infection) או MOI של 0.1 באמצעות הנוסחה הבאה. דגרו את תרבית החרקים המודבקת ב-P one בטמפרטורה של 27 °C עם ניעור במהירות של 100 RPM למשך 72 שעות. לאחר שלושה ימים, קצרו את הנגיף על ידי הפרדת התאים מהמצע באמצעות סנטריפוגציה ב-1000 Gs למשך חמש דקות.

בטמפרטורת החדר, העבירו את המדיום המועשר בנגיפים המזוקק למבחנה נקייה. מלאי נגיפים זה מסומן כ-P2 והטרה הנגיפית הצפויה היא 2×10⁸ PFU למילליליטר. אחסנו מלאי נגיפים זה ב-4°C בחושך עד לשימוש, ושמרו את משקעי התאים שהתקבלו ב-20°C- לצורך אישור מאוחר יותר של ייצור נגיף רקומביננטי.

כדי להתחיל בהליך זה, גדלו נפח מספיק של תרביות תאי SF nine בסספנסיה ובמדיום SF 902 s fm, בתוספת 100 µg/mL פניסילין ו-100 µg/mL סטריפטומייסין. היחס בין הנפח הכולל של התרבית לנפח הבקבוק צריך להיות 1:5.

דגרו את תרביות הסספנסיה בטמפרטורה של 27 °C עם ניעור במהירות של 100 RPM עד שיגיעו לצפיפות תאים של 2×10⁶ תאים למילליליטר. כאשר תרביות ה-SF9 נמצאות בצפיפות של 2×10⁶ תאים למילליליטר, הן מוכנות להדבקה בנגיף ה-Balo. הוסיפו לתרביות סרום עגל עד לריכוז סופי של 1% ומיד לאחר מכן הוסיפו את מלאי הנגיף מדור P2.

כדי להגיע ל-MOI של 1, דגרו את התרביות המודבקות בטמפרטורה של 27 °C עם ניעור ב-100 RPM. 72 שעות לאחר ההדבקה, אספו את תאי ה-SF nine המבטאים lin three רקומביננטי עם תג poly histamine על ידי סרכוז ב-1000 ×g למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. שמרו את משקע התאים שהתקבל בטמפרטורה של 20- °C עד לשימוש, או בטמפרטורה של 80- °C לאחסון לטווח ארוך. הליך זה מתחיל בהפשרה על קרח.

המשקעים הקפואים של תאי SF nine שהודבקו בנגיף vao ומבטאים kinlin three רקומביננטי, וריספנסיה (Resus) של המשקעים באמצעות בופר ליזיס. לאחר דגירה של התאים שבוצע להם ריספנסיה עם בופר הליזיס למשך 5 עד 10 דקות, יש לבצע וורטקס עד להשגת תמיסת ריספנסיה הומוגנית לצורך פירוק תאים נוסף. יש לבצע סוניקציה לדגימה בתוך אמבט קרח.

יש להבהיר את הליזאט באמצעות סנטריפוגציה ב-48,000 GS למשך שעה אחת בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. יש להעמיס את הסופרנטנט שיתקבל על עמודת hist trap בנפח של חמישה מיליליטר, שהושרתה מראש בבופר ליזיס בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, בקצב של מיליליטר אחד לדקה. שלבים עוקבים של אלוציה של החלבון, החלפת בופר וריכוז החלבון לא יודגמו כאן, אך הם מפורטים בכתב היד הנלווה.

לאחר קבלת תמיסת החלבון שעברה החלפת באפר, יש להעביר אותה לעמודת high trap heparin HP בנפח של 5 mL שעברה שיווי משקל מוקדם, באמצעות מערכת ACTA FPLC, בקצב של 0.5 mL לדקה. KINLIN 3 הקשור נשטף באמצעות גרדיאנט ליניארי של sodium chloride באותו באפר, העולה בקצב של 10 mM ל-mL recombinants histamine tags. KINLIN 3 צפוי להשתחרר (elute) בריכוז של כ-0.6 M sodium chloride. לאחר ריכוז החלבון, השלב האחרון הוא החלפת באפר של החלבון באמצעות כרומטוגרפיית הפרדה לפי גודל (size exclusion chromatography); יש להעביר את החלבון המטוהר לעמודת SUEx S 210 30, ולטהר את החלבונים לפי גודלם על ידי הזרמת באפר לעמודה בקצב של 0.5 mL לדקה.

החלבון המופק מהעמודה עובר הפרדה לשברים (fractionated) ומנוטר באמצעות בליעה ב-280 nanometers. הצלחתו של ייצור הנגיף הרקומביננטי אומתה על ידי הערכת נוכחותו של Kinlin three רקומביננטי בתאי SF nine שעברו טרנספקציה (COT TRANSFECTED) באמצעות SDS page ואנליזת Western, כפי שניתן לראות ב-Western blot מייצג של שש תרביות SF nine בקנה מידה קטן תוך שימוש בנוגדן anti hiss six. פס רחב וברור המתאים לחלבון עם תג hiss במשקל 75 kilodalton היה נראה בכל דגימה לאחר שהנגיף הורבה ושימש להדבקת תאי SF nine בניסויים בקנה מידה גדול. KINLIN three רקומביננטי טוהרה חלקית באמצעות כרומטוגרפיית ספיחה של מתכת מאובלנית (immobilized metal affinity chromatography).

תמונת הג'ל הראשית באיור זה מציגה SDS page של kinlin three רקומביננטי של עכבר, שעבר טיהור באפיניות לניקל והובע בתאי SF nine שהודבקו בנגיף BAO. החלבון שנספח נאלוט באמצעות מדרג של imidazole כפי שמוצג מעל לתמונת הג'ל. MW מציין סממן של משקל מולקולרי, LYS הוא ליזאט של תא שלם, FT הוא השטוף (flow through), WI הוא שטיפה אחת ו-WII הוא שטיפה שתיים. ניתוח Western blot בוצע גם עבור פראקציות האלוציה כדי לאשש את נוכחותו של תג ה-his ההנדסי בחלבון הרקומביננטי.

בשלב הבא, KINLIN three המטוהר חלקית טוהר עוד יותר עד לרמה של כמעט הומוגניות באמצעות כרומטוגרפיית חילוף יונים בעזרת עמודת heparin. פאנל זה מציג את פרופיל האלוציה שנצפה ב-280 nanometers בכחול, המראה שיא סימטרי יחיד המאלוא בגרדיאנט ליניארי של sodium chloride המסומן בירוק, תוך שימוש בטווח ריכוזים של sodium chloride בין 0.05 molar ל-1.0 molar. הפאנל התחתון מציג את תוצאות ניתוח ה-SDS page של האלוציה המופרדת, המדגימות את נוכחותו של החלבון Kinlin three בעל המשקל המולקולרי 75 kilodalton.

כשלב סופי, טהרת ה-KINLIN three שופרה באמצעות כרומטוגרפיית הפרדה לפי גודל (size exclusion chromatography) כדי להסיר אגרגטים ולהשיג הומוגניות. פרופיל אלוציית ג'ל פילטרציה מייצג זה הוא של Kinlin three מטוהרה באמצעות SUEx S 200 ב-Tris HCL pH 7.5, 150 millimolar sodium chloride ו-one millimolar DTT בטמפרטורה של 20 degrees Celsius. בהתבסס על נפח האלוציה, KINLIN three נדוד כפי שצפוי עבור חלבון של 75 kilodalton, מה שמעיד על כך שהוא בעיקר מונומרי.

האיור הבא מציג תוצאות של SDS page של קינלין 3 רקומביננטי מטוהר בריכוז גבוה, המסומן כ-K3, בריכוז של 14.5 mg/mL. ייצור של כמויות של מיליגרמים של קינלין 3 מלא מאושח של עכבר בדרגת טוהר גבוהה בתרבית תאי חרקים יאפשר מחקרים מבניים נרחבים ואנליזה ביוכימית של החלבון. במחקר זה בוצע גם Thermo shift assay מבוסס Thermo Fluor כדי לקבוע אילו באפרים מייצבים את קינלין 3.

KINLIN three דולל למספר באפרים שונים, המהווים סריקה דו-ממדית של pH לעומת ריכוז נתרן כלוריד. הפאנל העליון הוא היסטוגרמה תלת-ממדית של טמפרטורות המעבר, והפאנל התחתון מראה את השינוי בטמפרטורת המעבר ביחס לממוצע המחושב של 50.4 °C. העמודות צבועות בהתאם לטווח הטמפרטורות שאליו הן מקושרות.

נצפה כי KINLIN three יציב בריכוזים גבוהים של sodium chloride בטווח PA של 7.0 עד 9.0, עם טמפרטורת מעבר עקבית של 55 °C. כמו כן, נצפה כי טמפרטורת המעבר של Kinlin three הייתה כ-55 °C בטווח PA של 7.0 עד 7.5, ללא קשר לריכוז ה-sodium chloride.

לאחר צפייה בסרטון זה, תגמרו עם הבנה טובה של אופן הפקתו של kindling רקומביננטי פונקציונלי ברמת טוהר גבוהה, לצורך אפיון ביופיזיקלי מעמיק ובדיקות נוספות. ניתן להשתמש בגישות דומות עבור דגימות חלבון אחרות שקשה להכין, ואנו ממליצים על יישומן במקרים אלו.