אנטי גרעיני נוגדן הקרנה באמצעות הפ-2 תאים

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשתמש בבדיקה של אימונופלורסצנציה עקיפה כדי לסרוק נוגדנים אנטי-גרעיניים. דבר זה מושג על ידי דגירה של סרום של מטופל עם שקפיות תשתית של תאי Hep-2. הסרום של המטופל שלא נקשר נשטף, והנוגדנים העצמיים שנקשרו מדגרים לאחר מכן עם קונג'וגט ספציפי המסומן בפלואורסצאין, ולאחר מכן נשטף הריאגנט שלא נקשר.

בבדיקה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה, דגימות חיוביות לנוגדנים עצמיים יראו פלואורסצנציה בצבע ירוק-תפוח המתאימה לאזורים בתא או בגרעין שבהם נקשרו הנוגדנים העצמיים, בדפוס פלואורסצנציה המעיד על נוכחות האנטיגן. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בנוכחות של arna כדי לסייע באבחנה של מחלות רקמת חיבור. היתרון המרכזי של שיטת האימונופלואורסצנציה העקיפה על פני שיטות אחרות, כגון Solid Phase ELISA, הוא שמצע תאי ה-Hep 2 מכיל למעלה מ-100 אנטיגנים המובעים בקונפיגורצייתם הטבעית.

דבר זה מאפשר זיהוי של כמעט כל הנוגדנים מסוג O הרלוונטיים מבחינה קלינית, דבר שאינו אפשרי בטכניקות של פני שטח מוצקים, שכן שיטת האימונופלואורסצנציה העקיפה היא טכניקה מיוחדת מאוד. אנשים שאינם מכירים את השיטה זקוקים לזמן ולתרגול כדי להגיע למיומנות בהליך עיבוד השקופיות. גם פרשנות תמונות המיקרוסקופ ולמידה כיצד לזהות תבניות רלוונטיות היא מיומנות שדורשת זמן כדי להגיע לשליטה מלאה.

בעזרת הריאגנטים והכלים המתאימים, התוצאות יהיו עקביות יותר וקלות יותר לפירוש. את הפרוצדורה תדגים Cassandra Bryant, טכנולוגית ממעבדת פיתוח בדיקות אימונופלואורסצנטיות. הוציאו את הריאגנטים מהאריזה והמתינו שכל פריט יגיע לטמפרטורת החדר, הכינו את הריאגנטים ודללו את סרום המטופל בהתאם להוראות המצורפות; השקופיות הן עם ברקוד וניתן לשלב אותן בקלות במערכות אוטומטיות.

הליך זה מדגים עיבוד ידני של סליידים. עם זאת, מעבדות בעלות תפוקה גבוהה עשויות לבחור בציוד אוטומטי לעיבוד סליידים עם יכולות סריקת ברקוד. מכשירים של Inova מחוברים דרך רשת חכמה מרכזית המספקת שליטה על תוצאות זרימת העבודה והדיווחים.

עבור IFA. דבר זה מבטיח זיהוי חיובי של המטופל מהעיבוד ומסיר טעויות תעתוק וטעויות דומות. טפטפו טיפה אחת של בקרת חיובי וטיפה אחת של בקרת שלילי על השקופית המתאימה.

טפטפו באמצעות פפט 20 עד 25 µL של סרום מטופל מדולל לשאר הבארים. עבדו שקופית אחת בכל פעם. הניחו את השקופית בתוך מיכל צביעה עם נייר סופג לח בתחתיתו, כסו את המיכל והדגירו את השקופית לדגירה למשך 30 דקות.

התנאים הלחים ימנעו את התייבשות התשתית, מה שעלול להוביל לצביעה מלאכותית (artifactual staining). במהלך תקופת אינקובציה זו, הנוגדנים האנטי-גרעיניים בסרום של המטופל ייקשרו לאנטיגנים של התאים המקובעים בכל באר. לאחר תקופת האינקובציה, שטפו את הסרום באמצעות זרם עדין של בופר שטיפה כדי למנוע פגיעה בתשתית.

הטה את השקופית מעט כך שהזרם לא יפנה ישירות אל התשתית. אוריינטציה זו של השקופיות תסייע גם למנוע מעבר של דגימות בין הבארים. הקש להסרת עודפי תמיסת השטיפה והנח את השקופית לתוך צנצנת קופלנד (Copeland jar) המכילה תמיסת שטיפה.

זמן הדגירה עבור שלב השטיפה צריך להיות כחמש דקות. הוציאו את השקופיות מתוך תמיסת השטיפה והקישו עליהן בעדינות. להסרת שאריות תמיסת השטיפה, טפטפו טיפה אחת של הצמדה פלואורסצנטית לכל באר.

לבדיקת NA, מומלץ להשתמש בצמידה (conjugate) ספציפית ל-IgG FC. דגרו את השקופיות למשך 30 דקות בתוך מכל מלחח, והקפידו להחזיר את כיסוי הצביעה. הצמידה רגישה לאור, והכיסוי יגן על השקופיות מחשיפה לאור.

במהלך תקופת דגירה זו, התצמיד נקשר לנוגדנים אנטי-גרעיניים של המטופל שנקשרו לאנטיגנים של התא. קישור תצמיד זה גורם להופעת פלואורסצנציה בבארות לאחר הדגירה. שטפו את השקף עם תמיסת שטיפה.

כמו קודם לכן, הניחו זכוכית כיסוי על נייר סופג ומרחו מדיום קיבוע בקו רציף לאורך הקצה התחתון של זכוכית הכיסוי. הוציאו כל סלייד מתוך תמיסת השטיפה והקישו עליו בעדינות. כדי להסיר את עודפי תמיסת השטיפה, הניחו את הקצה התחתון של הסלייד במגע עם קצה זכוכית הכיסוי.

הנח בעדינות את העששיה על זכוכית הכיסייה באופן שבו תוכל חומר ההטמעה שעל זכוכית הכיסייה לזרום אל הקצה העליון של העששייה ללא היווצרות בועות אוויר. הגעה לכמות האופטימלית של חומר ההטמעה היא טכניקה הדורשת תרגול כדי להגיע לשליטה מלאה. צפה בעששיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הממוקם בחדש חשוך; יש לבצע סריקה של כל הבאר באמצעות עדשה של 20x או 25x. כדי להעריך את התפלגות התאים ואת אחידות הפלואורסצנציה, ע przejה לעדשה של 40x.

כדי לקבוע את הפרשנות הסופית בנוגע לחיוביות ולדפוס, יש לבחון את הביקורות החיוביות והשליליות. ייתכן שהביקורת השלילית לא תיראה כהה לחלוטין, אך לרוב היא תציג פלואורסצנציה לא ספציפית ברמה נמוכה. הביקורת החיובית תציג פלואורסצנציה בצבע ירוק-תפוח בהיר בגרעין.

ניתן לדרג את החיוביות באמצעות סולם דירוג תגובתיות מפלוס אחת עד פלוס ארבע. בנוסף לפירוש ידני, ניתן להטעין ולסרוק את השמורות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה אוטומטי. אין צורך בחדר חשוך.

לאחר יצירת פרויקט באמצעות בחירת סוג השקופית המתאים, המכשיר רוכש ומאחסן תמונות דיגיטליות ברזולוציה גבוהה של תאים בכל באר. בנוסף, Nova view מודד את עוצמת האור הפלואורסצנטי, מסווג את התוצאות כחיוביות או שליליות ומספק זיהוי תבניות עבור דגימות חיוביות. התמונות נסקרות על ידי המפעיל במסך מחשב ברזולוציה גבוהה, מה שמאפשר פרשנות סופית, תיקון ואישור של ה-Nova View.

ניתן להפיק דוחות תוצאות על בסיס תוצאות מאושרות. קישור של נוגדנים עצמיים למבני החלבונים המרכיבים את הגרעין מוביל לחמישה דפוסים גרעיניים עיקריים, הכוללים דפוס הומוגני, מנומש, צנטרומרי, נוקלאולרי ונקודתי גרעיני. כדי לזהות דפוס הומוגני כפי שמוצג כאן, זהו תאים במצב מיטוזה או תאים הנחלקים.

תאים במצב של מיטוזה מראים פלואורסצנציה אחידה וסולידית, שלרוב בולטת יותר מאשר בתאי מנוחה. גרעיני תאי המנוחה צריכים להיות אחידים עם צביעה דיפוזית. תבנית מאפיינת זו היא ככל הנראה תוצאה של נוגדנים עצמיים ל-DNA דו-גלגלי.

מאפיין מרכזי של התבנית הנקודית הוא המראה הדמוי חריץ מטבע של תאי המיטוזה בשלב המטפאזה. האזור הכרומוזומלי של תאים אלו הוא שלילי. תאים במצב מנוחה מציגים תבנית נקודית לאורך הגרעינים.

ניתן להגדיר את התבנית הנקודית (speckling) כגסה או עדינה. תבנית נקודית גסה היא תוצאה של נוגדנים עצמיים ל-SM ו-RNP. תבנית נקודית עדינה יכולה לנבוע מנוגדנים עצמיים ל-S-S-A-S-S-B וכן ל-RNA polymerase.

תבנית ה-DFS מכונה "דחוסה, עם נקודות עדינות" (dense, fine speckled), והיא מעידה על נוכחות של אוטו-נוגדנים ל-DFS 70. תאים במצב מיטוטי מראים צביעה מנקודתית, בעוד שתאים במצב מנוחה מציגים נקודות עדינות המפוזרות באופן אחיד ברחבי הגרעין. במקרים אלו, יש לבצע בדיקות אישור, מאחר שאוטו-נוגדנים ל-DFS 70 נפוצים בקרב אנשים בריאים בהשוואה לחולים עם מחלות רקמת חיבור.

כדי לזהות את דפוס הצנטרומרים, סרקו את הבארות וזהו תאי מיטוזה או תאים הנמצאים בחילוק. לתאים המתחלקים ישנם נקודות בודדות רבות בצמידות זו לזו, המכונות לעיתים קרובות "פס המטפאזה" (metaphase bar). תאים במצב מנוחה מראים כ-40 עד 60 נקודות בודדות המפוזרות ברחבי הגרעין.

דפוס הצנטרומרה מקושר לנוגדנים עצמיים לחלבוני הצנטרומרה עם הדפוס הנוקלאולרי. צביעה של האזור הכרומוסומלי בתאים פתומיים (במיטוזה) היא משתנה. הדפוס הנוקלאולרי מקושר לצביעה הומוגנית או מנוקדת של הגרעינים, יחד עם צביעה חלשה, מנוקדת או הומוגנית של הנוקלאופלזמה של גרעיני תאים במצב מנוחה.

תבנית זו קשורה לנוגדי-נוגדנים (autoantibodies) ל-RNA polymerase three fibrillin ולנוגדי PM SCL. תבנית הנקודות הגרעינית (nuclear dot pattern) קשורה למטפאזה שלילית, לתאים מיטוטיים ולנקודות בודדות ומובחנות בגרעיני תאים במצב מנוחה. תבנית אופיינית זו היא לעיתים קרובות תוצאה של נוגדי-נוגדנים ל-SP 100 PML או P 80 colan.

נוגדנים אלו קשורים לשחמת מרה ראשונית (primary biliary cirrhosis) ולדלקת כבד אוטואימונית. בתמונה המוצגת, דפוס הנקודות הגרעיני מראה צביעה ציטופלזמית הנובעת מנוגדנים עצמיים לאנטיגנים מיטוכונדריאליים. זיהוי נוגדנים גרעיניים (Anti-nuclear antibody) וזיהוי הדפוס שלהם משמשים ככלי חשוב לסיוע באבחון מטופלים.

הבנת החשיבות של תבניות שונות מאפשרת לקליניקאים ולצוותי המעבדה לבצע בדיקות מעקב מתאימות. הגורמים החשובים ביותר לזיהוי נכון של תבניות נוגדי גרעין (anti-nuclear antibody) הם בחירת תשת תאי (cell substrate) באיכות גבוהה ועיבוד השקופיות בטכניקה עקבית וטובה. קריאת השקופיות מבוצעת באופן מסורתי באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בחדרים חשוכים, ונעשית על ידי טכנולוגים מיומנים המכירים את התבניות השונות בהקשר של מחזור התא ומורפולוגיית התא.

בשנים האחרונות פותחו מערכות דימות דיגיטליות לקריאה אוטומטית של סרטים (slides), מכשירים אלו הופכים את זרימת העבודה לאוטומטית ומשפרים את העקביות של הקריאה והפירוש. יתרה מכך, שימוש בסרטים עם ברקוד מאפשר מעקב אחר הדגימות לאורך התהליך, ובכך מבטל טעויות העתקה פוטנציאליות ומשפר את שלמות הנתונים ואת בטיחות המטופל. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של אופן ביצוע כל שלב בפרוצדורה של אימונופלואורסצנציה עקיפה, וכן כיצד לזהות תבניות של נוגדנים גרעיניים (antinuclear antibody) בעלות רלוונטיות קלינית.