אנטי גרעיני נוגדן הקרנה באמצעות הפ-2 תאים

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשתמש בבדיקה אימונו-פלואורסצנטית עקיפה כדי לסנן נוגדנים אנטי-גרעיניים. זה מושג על ידי דגירה של סרום המטופל עם שקופיות hep 2 Substrate. סרום המטופל הלא קשור נשטף מהנוגדנים האוטומטיים הקשורים לאחר מכן מודגרים עם מצומד פלואורסצאין ספציפי, והמגיב הלא קשור נשטף.

כאשר מסתכלים דרך מיקרוסקופ פלואורסצנטי, דגימות חיוביות של נוגדנים אוטומטיים יציגו פלואורסצנטיות בצבע ירוק תפוח המתאים לאזורים בתא או בגרעינים שבהם נוגדן אוטומטי נקשר בדפוס של פלואורסצנציה המעידה על נוכחות האנטיגן. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בנוכחות ארנה כדי לסייע באבחון מחלות רקמת חיבור. היתרון העיקרי של השיטה האימונופלואורסצנטית העקיפה על פני שיטות אחרות כמו אלייזה בשלב מוצק, הוא שמצע שני התאים מכיל למעלה מ-100 אנטיגנים המתבטאים בתצורה המקורית שלהם.

זה מאפשר זיהוי של כמעט כל נוגדני ה-O הרלוונטיים מבחינה קלינית, דבר שאינו אפשרי בטכניקות פנים מוצקות מכיוון שהשיטה האימונו-פלואורסצנטית העקיפה היא טכניקה מיוחדת מאוד. אנשים חדשים בשיטה זו זקוקים לזמן ותרגול כדי להיות מיומנים בהליך עיבוד השקופיות. פירוש תמונות המיקרוסקופ ולמידה לזהות דפוסים רלוונטיים היא גם מיומנות שלוקח זמן לשלוט בה.

עם הריאגנטים והכלים הנכונים, התוצאות עקביות יותר וקלות יותר לפרשנות. תדגים את ההליך קסנדרה בראיינט, טכנולוגית מהמעבדה לפיתוח אימונופלואורסצנטי אסאי. הסר ריאגנטים מהאריזה ואפשר לכל פריט להגיע לטמפרטורת החדר, הכין ריאגנטים ודלל את סרום המטופל בהתאם לכיוון שקופיות הכנסת הברקוד וניתן לשלב אותן בקלות במערכות אוטומטיות.

הליך זה ממחיש עיבוד ידני של שקופיות. עם זאת, מעבדות בתפוקה גבוהה עשויות לבחור בציוד אוטומטי לעיבוד שקופיות עם יכולות סריקת ברקוד. מכשירי Inova מחוברים באמצעות רשת חכמה מרכזית המספקת שליטה על תוצאות זרימת העבודה והדיווח.

עבור IFA. התוצאה היא זיהוי חיובי של המטופל מעיבוד וביטול של שעתוק ושגיאות קשורות. הוצא טיפה אחת של שליטה חיובית וטיפה אחת של שליטה שלילית על השקופית המתאימה.

פיפטה בארות 20 עד 25 מיקרוליטר של סרום מטופל מדולל לבארות הנותרות. עבד שקופית אחת בכל פעם. הניחו את השקופית בכלי מכתים עם מגבת נייר לחה בתחתית, כסו את המיכל ודגרו את המגלשה למשך 30 דקות.

התנאים הלחים ימנעו מהמצע להתייבש, מה שעלול לגרום להכתמה מלאכותית. במהלך תקופת הדגירה הזו, הנוגדנים האנטי-גרעיניים בסרום של המטופל ייקשרו לאנטיגנים של התאים המקובעים על כל באר. לאחר תקופת הדגירה יש לשטוף את הסרום באמצעות זרם עדין של מאגר כביסה על מנת למנוע נזק למצע.

זווית מעט את השקופית כך שהזרם לא יופנה ישירות על המצע. כיוון זה של המגלשות יסייע גם במניעת הצלבה של דגימות בין בארות. הקש על מאגר הכביסה העודף והנח את השקופית בצנצנת קופלנד המכילה מאגר כביסה.

זמן הדגירה לשלב הכביסה צריך להיות כחמש דקות. הסר את השקופיות ממאגר הכביסה והקש בעדינות. כדי להסיר את מאגר הכביסה העודף, יש למרוח טיפה אחת של מצומד פלואורסצנטי על כל באר.

לבדיקת NA, מומלץ להשתמש במצומד ספציפי ל-IgG FC. דגרו את השקופיות למשך 30 דקות במיכל הלח והקפידו להחליף את מכסה הצביעה. המצומד רגיש לאור והכיסוי יגן על המגלשות מפני חשיפה לאור.

במהלך תקופת הדגירה הזו, המצומד ייקשר לנוגדנים האנטי-גרעיניים של המטופל שנקשרו לאנטיגנים של התא. קשירה מצומדת זו מביאה לנוכחות פלואורסצנטיות בבארות לאחר הדגירה. שטפו את השקופית עם מאגר כביסה.

כמו קודם, הניחו פתק כיסוי על מגבת נייר ומרחו מדיום הרכבה בקו רציף על הקצה התחתון של החלקת הכיסוי. הסר כל שקופית ממאגר הכביסה והקש על המגלשה בעדינות. כדי להסיר את מאגר הכביסה העודף, גע בקצה התחתון של השקופית לקצה החלקת הכיסוי.

הורד בעדינות את המגלשה על החלקת הכיסוי בצורה כזו שאמצעי ההרכבה על החלקת הכיסוי יזרום לקצה העליון של המגלשה מבלי שמכסה בועות האוויר יחליק, כולל הכמות האופטימלית של אמצעי ההרכבה היא טכניקה שלוקחת את התרגול לתמונה מושלמת. שקופיות עם מיקרוסקופ פלורסנט הממוקם בחדר חשוך, יש לבצע סריקה של הבאר כולה עם מטרה של 20 x או 25 x. כדי להעריך את התפלגות התאים ואחידות הקרינה עבור למטרה של פי 40.

כדי לקבל את הפרשנות הסופית לגבי חיוביות ודפוס, הסתכלו על הבקרות החיוביות והשליליות. ייתכן שהבקרה השלילית לא תיראה כהה לחלוטין, אך לרוב תציג פלואורסצנטיות לא ספציפית ברמה נמוכה. הבקרה החיובית תציג פלואורסצנטיות ירוקה תפוח בהירה בגרעין.

ניתן לדרג חיוביות על ידי שימוש בסולם דירוג תגובתיות מאחד פלוס לארבע פלוס. בנוסף לפרשנות ידנית, ניתן לטעון ולסרוק שקופיות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטי. אין צורך בחדר חשוך.

לאחר יצירת פרויקט על ידי בחירת סוג השקופית המתאים, המכשיר רוכש ומאחסן תמונות דיגיטליות ברזולוציה גבוהה של תאים בכל באר. בנוסף, תצוגת נובה מודדת את עוצמת האור הפלואורסצנטי ומסווגת את התוצאות כחיוביות או שליליות ומספקת זיהוי דפוסים לדגימות חיוביות. התמונות נצפות על ידי המפעיל על צג מחשב ברזולוציה גבוהה, מה שמאפשר פרשנות סופית, תיקון ואישור של Nova View.

ניתן להפיק דוחות תוצאות על תוצאות מאושרות. קשירת נוגדנים עצמית על מבני החלבון המרכיבים בתוך הגרעין מביאה לחמישה דפוסים גרעיניים עיקריים, כולל צנטרומר הומוגני, מנומר, נוקלאולרי ונקודה גרעינית. כדי לזהות דפוס הומוגני כפי שמוצג כאן, זהה תאים מיטוטיים או מתחלקים.

תאים מיטוטיים מראים פלואורסצנטיות אחידה מוצקה, שלעתים קרובות בולטת יותר מאשר בתאים במנוחה. גרעיני התאים במנוחה צריכים להיות אחידים עם צביעה מפוזרת. דפוס אופייני זה הוא ככל הנראה תוצאה של נוגדנים עצמיים ל-DNA דו-גדילי.

מאפיין מרכזי של הדפוס המנומר הוא מראה חריץ המטבע של התאים המיטוטיים של המטפאזה. האזור הכרומוזומלי של תאים אלה שלילי. התאים במנוחה מציגים דפוס כתמים בכל הגרעינים.

ניתן להגדיר את הכתמים כגסים או דקים. כתמי קורס הם תוצאה של נוגדנים אוטומטיים ל-SM ו-RNP. כתמים עדינים יכולים לנבוע מנוגדנים אוטומטיים ל-S-S-A-S-S-B כמו גם RNA פולימראז.

דפוס DFS מכונה מנומר צפוף ועדין, והוא מעיד על נוגדנים אוטומטיים ל-DFS 70. תאים מיטוטיים מראים כתמים מנומרים בעוד שתאים במנוחה מציגים כתמים עדינים מפוזרים באופן אחיד בכל הגרעין. במקרים אלה, יש לבצע בדיקות אישור מכיוון שנוגדנים עצמיים DFS 70 נפוצים אצל אנשים בריאים לעומת חולים עם מחלת רקמת חיבור.

כדי לזהות את דפוס הצנטרומר, סרוק את הבארות וזהה תאים מיטוטיים או מתחלקים. לתאים המתחלקים יש כתמים דיסקרטיים רבים הקשורים זה לזה, המכונים לעתים קרובות סרגל המטאפאזה. התאים במנוחה מראים כ-40 עד 60 כתמים בדידים המפוזרים ברחבי הגרעין.

דפוס הצנטרומר קשור לנוגדנים עצמיים לחלבוני צנטרומר עם דפוס הגרעין. צביעה של האזור הכרומוזומלי בתאים מיטוטיים משתנה. דפוס הגרעין קשור לצביעה הומוגנית או מנומרת של הגרעינים, יחד עם צביעה חלשה, מנומרת או הומוגנית של הנוקלאופלזמה של גרעיני התא במנוחה.

דפוס זה קשור לנוגדנים עצמיים לנוגדנים RNA פולימראז, שלושה פיברילין ו-PM SCL. דפוס הנקודה הגרעינית קשור למטפאזה שלילית, תאים מיטוטיים ומעט נקודות נפרדות בגרעיני התאים במנוחה. דפוס אופייני זה הוא לרוב תוצאה של נוגדנים עצמיים ל-SP 100 PML או P 80 קולן.

נוגדנים אלה קשורים לשחמת מרה ראשונית ודלקת כבד אוטואימונית. בתמונה המוצגת, דפוס הנקודה הגרעינית מציג צביעה ציטופלזמית עקב נוגדנים אוטומטיים לאנטיגנים מיטוכונדריאליים. זיהוי נוגדנים אנטי-גרעיניים וזיהוי דפוסים משמשים ככלי חשוב לסיוע באבחון המטופלים.

הבנת המשמעות של דפוסים שונים מאפשרת לקלינאים ולאנשי מעבדה לבצע בדיקות מעקב מתאימות. הגורמים החשובים ביותר לזיהוי נכון של דפוסי נוגדנים אנטי-גרעיניים הם בחירת מצע תאים באיכות גבוהה ועיבוד השקופיות בטכניקה טובה עקבית. קריאת שקופיות מבוצעת באופן מסורתי על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בחדרים חשוכים ונעשית על ידי טכנולוגים מיומנים המכירים את הדפוסים השונים בהקשר של מחזור התא ומורפולוגיה של התא.

בשנים האחרונות פותחו מערכות הדמיה דיגיטליות לקריאה אוטומטית של השקופיות, מכשירים כאלה הופכים את זרימת העבודה לאוטומטית ומגבירים את עקביות הקריאה והפרשנות. יתרה מכך, עם שימוש בשקופיות ברקוד, עקיבות הדגימה לאורך התהליך מבטלת שגיאות תמלול פוטנציאליות ומגבירה את שלמות הנתונים ובטיחות המטופל. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע כל שלב בהליך האימונופלואורסצנטי העקיף וכיצד לזהות דפוסי נוגדנים אנטי-גרעיניים רלוונטיים מבחינה קלינית.