פלטפורמת microfluidic למדידת נויטרופילים Chemotaxis מדם מלא לא מעובד

טכנולוגיה מיקרופלואידית זו שואפת למדוד את התפקוד של נויטרופילים אנושיים ישירות מטיפת דם אחת על פלטפורמה שניתן להפוך למולטיפלקסית. תא הטעינה המרכזי משמש כמקור לדם מלא וכן ככיור עבור מדרגי החומרים המושכים כימולקטיים (chemo attractant gradients) הנוצרים ב-16 תאי הכימוטקסיס המוקדיים. סינון מכני ייחודי של תאי דם אדומים מאפשר לבחון את תפקוד הנויטרופילים בהקשר הטבעי של הדם, הכולל רכיבים תאיים וביוכימיים.

הפיצול בין תעלה המובילה לתא הכימוטקסי המוקדי לבין תעלה היוצאת מהמכשיר מאפשר כימות וויסות של הכיווניות של נויטרופילים נודדים. כך, התוצאות יכולות להדגים כיצד נויטרופילים הנודדים באופן פעיל עוברים בקלות על פני תאי דם אדומים כלואים ונערמים במספרים לאורך זמן. מאפיין ייחודי אחד של המכשירים המיקרופלואידיים שלנו הוא שהם קלים מאוד לייצור ולהקמה.

הם מורכבים משכבת PDMS שיוצקה על גבי פרוסת סיליקון (wafer) שיוצרה במיקרו-פבריקציה, אותה אנו מאגחים לתחתית זכוכית של פלטה בעלת באר אחת או מספר בארות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא דורשת רק טיפה אחת של דם מלא. ניתן להשתמש במכשירים אלו עם פיפטות סטנדרטיות, אין להם חלקים נעים, והם אינם דורשים צינוריות או משאבות מזרק חיצוניות.

להשלכות של טכניקה זו יש השפעה על יישומים קליניים בהשוואה למה שנדרש בטכניקות מסורתיות. בגישה שלנו, הזמן מרגע איסוף הדם ועד לבדיקות נדידת הנויטרופילים נמשך דקות ספורות. מסרקי סינון תאי הדם האדומים החדשניים מונעים מתאי דם אדומים לחסום את הנדידה הפעילה של הנויטרופילים, ובכך מבדילים שיטה זו משיטות מיקרופלואידיקה אחרות.

דבר זה מחייב את הסרת הדם לפני ביצוע בדיקות כימותרפיה. החסימה המכנית של תאי דם אדומים ותעלות היא המאפיינת את הטכנולוגיה שלנו ומאפשרת את בדיקת הנויטרופילים בסביבה הפיזיולוגית של דם מלא, כולל סרום וטבחוניות. לפיכך, הטכנולוגיה היא מדויקת וקלה לשימוש, והיא יכולה לקדם משמעותית את הבנתנו לגבי תפקידם של הנויטרופילים ומערכת החיסון המולדת בבריאות ובמחלה.

ייצרו את פרוסת תבנית המאסטר להגדרת תעלולי ההגירה בהתאם להוראות היצרן First pattern. לאחר מכן, דגמו את שכבת הפוטורזיסט השלילית הראשונה מבוססת האפוקסי בעובי של שלושה מיקרון, ואז דגמו את השכבה השנייה בעובי 50 מיקרון להגדרת תאי הטענה של התאים ותאי הכמוקינים. כעת, לצורך יציקת התקני ה-Polymethyl soane, ערבבו בעוצמה 20 גרם של PDMS עם שני גרם של יוזם (initiator) למשך חמש דקות.

שפכו בזהירות את ה-PDMS על פרוסת הסיליקון (wafer) עם התבנית ובצעו ניקוי בועות (Degas) בתוך דסיקטור ואקום למשך שעה אחת. לאחר מכן, אפו והקשו את התקני המיקרופלואידיקה מ-PDMS בתנור בטמפרטורה של 65 °C למשך שלוש שעות לפחות. כדי להבטיח שה-PDMS נאפה בטמפרטורה הנכונה, הקפידו לנטר את טמפרטורת התנור הפנימית באמצעות מדחום.

נקב את תאי טעינת הדם השלם המרכזיים בקוטר 1.5 מילימטר. כמו כן, נקב התקנים שלמים בצורת טבעת בקוטר 5.0 מילימטר. הסר את החלקיקים מההתקנים בצורת הטבעת באמצעות סרט דביק.

בשלב הבא, שטפו פלטה רב-בארים במים דה-יוניזציה וייבשו בחנקן לאחר הנחת הפלטה בתנור בטמפרטורה של 60 °C למשך חמש דקות. בצעו טיפול בפלסמת חמצן למשך 35 שניות. לאחר מכן, הוסיפו את התקני ה"דונאט" ופלסמת חמצן.

בצע טיפול נוסף למשך 35 שניות. העבר בזהירות את ההתקנים אל בארות הפלטה וחמם את ההתקנים המחוברים על פלטה חמה בטמפרטורה של 80 °C למשך 10 דקות. לאחר טיפול בפלזמת חמצן, ההתקן הוא הידרופילי ואפקטים קפילריים יכולים לסייע בהחדרת נוזל (priming) לתעלות הקטנות שבהתקן.

עבור תמיסת חומר המשיכה הכימי, ערבבו 5 µL של FMLP בריכוז 10 µM עם 5 µL של פיברונקטין בריכוז 1 mg/mL, ו-490 µL של HBSS. העבירו באיטיות בעזרת פיפטה את תמיסת חומר המשיכה הכימי אל תא טעינת הדם השלם, והוסיפו 20 µL נוספים של חומר המשיכה הכימי מסביב לחלקו החיצוני של ההתקן. הניחו את הפלטה במגש ייבוש (desiccator) למשך 15 דקות.

יש להפעיל ואקום על המכשיר כדי להחדיר למכשיר תמיסת חומר משיכה כימית (chemo attractant). הוצא את הפלטה מהמייבש ואשר את הרטבת תעלת המכשיר על ידי ירידה הדרגתית בגודל בועת האוויר. לאחר מכן, שטוף ביסודיות את תא טעינת הדם השלם ואת החלק החיצוני של המכשיר כדי להסיר שאריות של תמיסת החומר המשיכה הכימית.

בשלב הבא יש ליצור מדרג של חומר מושך כימי (chemo attractant) מכל אחת מתאי הכימוטקסיס המוקדיים לכיוון מרכז המכשיר. יש להזריק בעדינות 100 µL של PBS לתוך החור כך שתיווצר טיפת PBS מעל המכשיר. יש להטות את הפלטה ולהעביר באמצעות פיפט 1 mL של PBS מסביב למכשיר כך שייאספו בתחתית הבאר; יש לשאוב את הנוזל ולחזור על שטיפת ה-PBS שלוש פעמים.

בשלב הבא, מלאו כל באר במצע כדי לשקע את ההתקנים והמתינו 15 דקות להתייצבות הגרדיאנט. לאחר מכן, טפטפו באיטיות באמצעות פיפט 2 µL של דם מלא לתוך כל תא טעינה של דם מלא. לאיסוף דם באמצעות דקירה באצבע, שטפו את הידיים במים וסבון.

ייבשו את העור כפתרון צביעה נוגד קרישה. הוסיפו 1 mL של 0.2% HSA ו-10 µL של hooks בריכוז 32.4 µM. לצביעה, השתמשו במבחנה לאיסוף דם עם הפרין, דקרו את אצבעו של תורם בריא ונגבו את טיפת הדם הראשונה.

אסוף 50 µL של דם לתוך תמיסת הצביעה הנוגדת קרישה וערבב בעדינות. הגדר את תא הביו ל-37 °C, 80% לחות ו-5% CO2. התחל מיד בדימות time-lapse בהגדלה של 10x או יותר; לצורך ניתוח סטטיסטי משמעותי, עקוב באופן ידני אחר לפחות 50 נויטרופילים בכל דגימה.

ספרו את התאים הנכנסים לתאי הכימותקסיס הממוקדים (focal chemotaxis chambers) לאורך זמן. לאחר מכן, באמצעות תוכנת Image J, חשבו את מהירות הנויטרופילים בערוץ שבין ה-WBLC ל-FCC. כדי לכמת את כיווניות התנועה של הנויטרופילים, ספרו את מספר התאים שעוברים את נקודת הפיצול וחשבו את היחס בין מספר התאים הפונים לעבר תאי הכימותקסיס הממוקדים לבין התאים היוצאים מההתקן.

תאים שאינם מכוונים אינם עוקבים אחר המעגול הכימותקטי ולכן נודדים במספרים שווים לעבר ה-FCC וערוץ היציאה. בניסוי זה, תקיפותו של מבחן הכימותקסיס של נויטרופילים מדם מלא תוקפה על ידי מדידת הצטברות הנויטרופילים לעבר מדרגת ריכוז של FMLP. התוצאות מאשרות שתאי הדם האדומים נלכדים על ידי מסרק הסינון בעוד שהנויטרופילים מסוגלים לנדוד באופן פעיל החוצה מהדם המלא.

המעבר הליניארי היציב של חומר המשיכה הכימי שנוצר באמצעות התקן המיקרופלואידי לדם מלא אומת באמצעות דקסטראן המסומן ב-FSE, ורמות הפלואורסצנציה נמדדו לאורך זמן. תוצאות שהתקבלו באמצעות פלטפורמת ה-WB Chemotaxis החדשנית מגלה כי נויטרופילים מכל מקורות הדם נעים במהירות עקבית ובמספר דומה של תאים נודדים כוללים. חשוב לציין כי מערכת זו מאפשרת כימות של הנויטרופילים, ובכך מבדילה בין כימוטקסיס לכימוקינזיס. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בפחות מ-10 דקות אם היא מבוצעת כראוי.

שילוב המכשיר שלנו בלוחית של 12 או 24 בארות תוך שימוש בטכניקות ובמתקנים סטנדרטיים של חדר נקי, מאפשר סריקה של מספר תנאים בו-זמנית. באמצעות טכניקה זו, אנו יכולים למדוד את המהירות ואת הכיווניות של נויטרופילים ברמת התא הבודד. בניגוד לשיטות מסורתיות המודדות נדידת תאים כוללת בנקודת סיום, זכרו להכין (prime) את המכשיר המיקרופלואידי בזהירות ולהטעין את שתי הדגימות באיטיות כדי שתאי דם אדומים (RBCs) לא יידחפו מעבר לפתח של המכשיר.

הפרוטוקול המתואר שימושי במיוחד למדידת ליקויי כימוטקסיס זמניים של נויטרופילים, ובכך מאפשר דגימות חוזרות בנקודות זמן מרובות, אך ניתן להתאימו גם למדידת נדידה של סוגי תאים אחרים מאורגניזמי מודל שונים. שיטה זו עשויה לספק תובנות לגבי שינויים זמניים בתפקוד הנויטרופילים במטופלים עם מצבים שונים הקשורים לשכיחות גבוהה יותר של זיהומים, כולל מטופלים לאחר טראומה, מטופלים לאחר ניתוח נרחב ומטופלי סרטן המקבלים כימותרפיה.