פלטפורמת microfluidic למדידת נויטרופילים Chemotaxis מדם מלא לא מעובד

פרוטוקול זה מפרט assay נועד למדוד chemotaxis נויטרופילים אדם מטיפה אחת של דם מלא עם שחזור חזק. גישה זו עוקפת את הצורך בהפרדת נויטרופילים ודורשת זמן הכנת assay רק כמה דקות. שבב microfluidic מאפשר למדוד החוזרים ונשנים של chemotaxis נויטרופילים לאורך זמן בתינוקות או יונקים קטנים, שבו נפח דגימה מוגבל.

טכנולוגיה מיקרופלואידית זו שואפת למדוד את הפונקציונליות של נויטרופילים אנושיים ישירות מטיפת דם אחת על פלטפורמה הניתנת לריבוב. תא הטעינה המרכזי משמש כמקור דם מלא ומשמש גם ככיור לשיפועי המשיכה הכימותרפיים הנוצרים מ-16 התאים הכימוטקטיים המוקדיים. הסינון המכני הייחודי של כדוריות הדם האדומות מאפשר לחקור את תפקודם של נויטרופילים בהקשר הטבעי של מרכיבי דם, תאים וביוכימיים.

ההסתעפות בין תעלה המובילה לתא הכימוטקטי המוקד לבין תעלה היוצאת מהמכשיר מאפשרת כימות ואפנון של כיווניות הנויטרופילים הנודדים. לפיכך, התוצאות יכולות להדגים כיצד נויטרופילים נודדים באופן פעיל נודדים בקלות על פני תאי דם אדומים כלואים ומצטברים במספרים לאורך זמן. מאפיין ייחודי אחד של המכשירים המיקרופלואידיים שלנו הוא שהם קלים מאוד לייצור ולהתקנה.

הם מורכבים משכבת PDMS יצוקה על רקיק מיקרו מפוברק שאנו מצמידים על תחתית זכוכית, צלחת יחידה או מרובת בארות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא דורשת רק טיפת דם מלא. ניתן להשתמש במכשירים עם פיפטות סטנדרטיות, אין להם חלקים נעים, אינם דורשים צינורות או משאבות מזרקים חיצוניות.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על יישומים קליניים בהשוואה לשלנו הנדרשים בטכניקות מסורתיות. הגישה שלנו לוקחת דקות מרגע איסוף הדם ועד למבחני נדידת הנויטרופילים. מסרקי סינון תאי הדם האדומים החדשים מונעים מ-RBCs לחסום את הנדידה הפעילה של נויטרופילים ומבדילים שיטה זו משיטות מיקרופלואידיות אחרות.

זה דורש הסרת הדם לפני ביצוע הבדיקות הכימותרפיות. החסימה המכנית של כדוריות הדם האדומות ותעלות הדם מייחדת את הטכנולוגיה שלנו ומאפשרת בדיקת נויטרופילים בסביבה הפיזיולוגית שלנו של דם מלא, כולל סרום וטסיות דם. לכן הטכנולוגיה מדויקת וקלה לשימוש, והיא יכולה לקדם משמעותית את ההבנה שלנו לגבי תפקידם של נויטרופילים ומערכת החיסון המולדת C בבריאות ובחולי.

בנה את פרוסת התבנית הראשית כדי להגדיר את ערוצי הנדידה בהתאם להוראות היצרן התבנית הראשונה. שלושת שכבות הפוטו-התנגדות השליליות הראשונות מבוססות אפוקסי מיקרון מעצבות את שכבת ה-50 מיקרון השנייה כדי להגדיר את תאי העמסת התאים והכימוקין. כעת ליציקה מכשירי פולימתיל סואן מערבבים במרץ 20 גרם PDMS עם שני גרם יוזם למשך חמש דקות.

יוצקים בזהירות את ה-PDMS על הוופל המעוצב ודגה, בייבוש ואקום למשך שעה. לאחר מכן אופים ומרפאים את המכשירים המיקרופלואידיים PDMS בתנור של 65 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות לפחות. כדי להבטיח שה-PDMS נאפה בטמפרטורה הנכונה, הקפד לעקוב אחר טמפרטורת התנור הפנימית באמצעות מדחום.

נקב את תאי העמסת הדם השלמים המרכזיים בקוטר 1.5 מילימטר. מחוררים גם מכשירים שלמים בצורת סופגנייה בקוטר 5.0 מילימטרים. הסר את החלקיקים ממכשירי הסופגנייה באמצעות סרט דבק.

לאחר מכן, יש לשטוף צלחת מרובת בארות במים נטולי יונים ולייבש בחנקן לאחר הכנסת הצלחת לתנור של 60 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. טיפול בפלזמת חמצן למשך 35 שניות. לאחר מכן מוסיפים את מכשירי הסופגניות ופלזמת החמצן.

יש לטפל שוב למשך 35 שניות נוספות. מעבירים בזהירות את המכשירים לבארות הצלחת ואופים עם מכשירים מלוכדים על פלטה חמה של 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר טיפול בפלזמת חמצן, המכשיר הידרופילי והשפעות נימיות יכולות לקדם את תחול התעלות הקטנות במכשיר.

לתמיסת המשיכה הכימותרפית, מערבבים חמישה מיקרוליטר של 10 מיקרו-מולרי FMLP עם חמישה מיקרוליטר של מיליגרם אחד למיליליטר פיברונקטין ו-490 מיקרוליטר HBSS. הכניסו לאט לאט את תמיסת המשיכה הכימותרפית לתוך כל פיפטת תא העמסת הדם ועוד 20 מיקרוליטר של מושך הכימותרפיה סביב החלק החיצוני של המכשיר. מניחים את הצלחת בחומר ייבוש למשך 15 דקות.

מרחו ואקום על המכשיר כדי למלא את המכשיר בתמיסת כימותרפיה. הסר את הצלחת מהחומר היבש ואשר הרטבה של תעלת המכשיר על ידי ירידה הדרגתית בגודל בועת האוויר. לאחר מכן שטפו היטב את כל תא העמסת הדם ואת החלק החיצוני של המכשיר כדי להסיר עודפי תמיסת משיכה לכימותרפיה.

לאחר מכן ליצור שיפוע של מושך כימותרפיה מכל אחד מהתאים הכימוטקטיים המוקדיים למרכז המכשיר. הזרקו בעדינות 100 מיקרוליטר PBS לתוך החור כך שתיווצר טיפה של PBS על גבי המכשיר. הטה את הצלחת ופיפטה מיליליטר אחד של PBS סביב המכשיר כדי לאסוף בתחתית הבאר, שאב את הנוזל וחזור על שטיפת PBS שלוש פעמים.

לאחר מכן, מלאו כל באר במדיה כדי להטביע את המכשירים ואפשרו 15 דקות להתייצבות השיפוע. לאחר מכן פיפטה לאט שני מיקרוליטרים של דם מלא לכל תא טעינת דם מלא. לאיסוף דם מדקירת אצבעות, יש לשטוף ידיים במים וסבון.

יבש את העור כתמיסת כתמים נוגדי קרישה. הוסף מיליליטר אחד של 0.2% HSA ו-10 מיקרוליטר של 32.4 ווים מיקרומולריים. כתם בצינור איסוף דם הפרין דוקר את אצבעו של התורם הבריא ומנגב את טיפת הדם הראשונה.

אוספים 50 מיקרוליטר דם לתמיסת הכתם נוגד הקרישה ומערבבים בעדינות. הגדר את החדר הביולוגי ל-37 מעלות צלזיוס, 80% לחות ו-5% CO2. התחל מיד את הדמיית ה-Time-lapse בהגדלה של פי 10 ומעלה לניתוח סטטיסטי משמעותי עקוב ידנית אחר לפחות 50 נויטרופילים בכל דגימה.

ספרו את התאים הנכנסים לתאי הכימוטקסיס המוקדיים לאורך זמן. לאחר מכן באמצעות תמונה J, חשב מהירויות נויטרופילים בערוץ שבין WBLC ל-FCC. לאחר מכן, כדי לכמת את הכיווניות של הנויטרופילים, ספרו את מספר התאים שעוברים את ההסתעפות וחשבו את היחס בין מספר התאים שפונים לעבר תאי הכימוטקסיס המוקדיים לבין התאים שיוצאים מהמכשיר.

תאים שאינם כיווניים אינם עוקבים אחר השיפוע הכימוטקטי ולכן נודדים במספרים שווים לכיוון ה-FCC וערוץ היציאה. בניסוי זה, בדיקת הכימוטקסיס של נויטרופילים בדם מלא אומתה על ידי מדידת הצטברות הנויטרופילים לכיוון שיפוע FMLP. התוצאות מאשרות שתאי הדם האדומים נלכדים על ידי מסרק הסינון בעוד שהנויטרופילים מסוגלים לנדוד באופן פעיל מתוך דם מלא.

שיפוע הכימותרפיה הליניארי היציב שנוצר על ידי המכשיר המיקרופלואידי של כל הדם אושר באמצעות דקסטרן שכותרתו FSE ורמות הקרינה נמדדו לאורך זמן. תוצאות שהתקבלו באמצעות פלטפורמת הכימוטקסיס החדשנית של WB מגלות כי נויטרופילים מכל מקורות הדם נודדים במהירות עקבית ועם תאים נודדים דומים. חשוב לציין, מערכת זו מאפשרת כימות של הנויטרופילים, ולכן מבדילה בין כימוטקסיס לכימותרפיה קינזיס לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך פחות מ-10 דקות אם היא מבוצעת כראוי.

שילוב המכשיר שלנו בצלחת 12 או 24 בארות תוך שימוש בטכניקות סטנדרטיות של חדר נקי, מתקנים, הקרנה של מספר תנאים בו זמנית. באמצעות טכניקה זו, אנו מסוגלים למדוד מהירות וכיווניות נויטרופילים ברמת התא הבודד. בניגוד לשיטות מסורתיות המודדות נדידת תאי קצה בתפזורת, זכור לקדם בזהירות את המכשיר המיקרופלואידי ולטעון את שתי הדגימות לאט כדי ש-RBCs לא יידחפו מעבר ל-com של המכשיר.

הפרוטוקול המתואר שימושי במיוחד למדידת ליקויים כימוטקטיים של נויטרופילים חולפים, ומאפשר דגימות חוזרות ונשנות על פני מספר נקודות זמן, אך ניתן להתאים אותו גם למדידת נדידה של סוגי תאים אחרים מאורגניזמים מודלים שונים. שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי שינויים זמניים בתפקוד הנויטרופילים בחולים עם מצבים שונים הקשורים לשכיחות גבוהה יותר של זיהומים, כולל חולי טראומה, חולים לאחר ניתוח גדול וחולי סרטן המקבלים כימותרפיה.