Name: רגישות סמים של adenylyl cyclase: התייעלות Assay ומזעור למולקולה קטנה ויישומים הקרנת siRNA (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: למדו לפתח מבחן רגישות cAMP מבוסס תאים לסינון בקנה מידה גבוה באמצעות תאים מוקפאים וטכנולוגיית HTRF. שיטה זו מאפשרת זיהוי מסלולים מולקולריים ותגליות תרופות ביעילות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות למר ריצ&#39;רד אבץ וטוד Wiernicki להכשרה מתודולוגית והדרכה assay. אנו מודים גם יוחנן פאולוס ספנס לקריאה זהירה ועריכת הצעות. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות 060,397 MH, מוח והתנהגות קרן מחקר, ואלי לילי וחברה באמצעות התכנית לילי פרס המחקר (LRAP).

1. התרחבות וCryopreservation של תאי Assay מוכנים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות CHO-K1-DRD 2L תאים (CHO-D 2L) על צלחת 15 סנטימטר 2 תא תרבות בתקשורת F12 של שינקין בתוספת 1.0 מיקרומטר L-גלוטמין, 800 G418 מיקרוגרם / μl, 300 מיקרוגרם / hygromycin μl, 100 u / μl פניצילין, 100 מיקרוגרם / μl סטרפטומיצין, ו10% בסרום שור העובר (FBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס חממה humidified עם 5% CO 2 עד לתאים ומחוברות 90-95%. לשטוף את התאים עם 10 μl בופר פוספט (PBS), ולאסוף את התאים על ידי הוספת 3 μl של חיץ התא דיסוציאציה במשך 5 דקות ב37 ° C. Resuspend התאים באמצעות 12 μl של התקשורת והתרבות ולספור תאים באמצעות הרחקת trypan כחולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה תא XG 500 במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב μl 5 של תקשורת הקפאה (10% sulfoxide דימתיל, 90% FBS). לדלל את ההשעיה התא כדי להשיג את הריכוז הרצוי של התאים (לדוגמא: 1-20 x 10 6 תאים / μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> μl 1.0 aliquot של פתרון תא לכל cryovial. דגירה cryovials במכל הקפאת תא ב -80 ° C במשך הלילה. העבר את cryovials לN 2 מיכל נוזל לאחסון ארוך טווח. </li></ol> 2. תאי ציפוי Assay מוכנים (ואופציה ההפוך Transfection) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות להפשיר cryovial קפוא של תאים באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. ברגע שתאים מופשרים, להעביר את תאי צינור חרוטי 15 μl מכיל 9 μl של Opti-ממ, ומערבבים על ידי צינור היפוך 3-5x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב XG 500 במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. לשאוב supernatant ו resuspend התאים ב1 μl Opti-ממ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים באמצעות הרחקת trypan הכחולה כדי לקבוע כדאיות תא ולדלל את תאי קיימא במידת צורך (למשל. 3 x 10 5 תאים / ריכוז μl) בOpti-ממ. צלחת 10 μl / טוב של תאים בתרבית רקמה שטופלה צלחת 384 גם בעזרת פיפטה רבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך דילולים סדרתי של המחנה בOpti-ממ כדי ליצור עקומה סטנדרטית להערכת ייצור cAMP על ידי התאים (לפי מייצר המלצות - ראה סעיף 7). הוסף 10 μl / טוב של הסטנדרטים cAMP לצלחת הערה:. עקומת סטנדרט אחד יכולה להיות מוכנה על צלחת נפרדת או בארות ריקות באחת מצלחות assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את הצלחת ב100 XG במשך 15 שניות בטמפרטורת חדר, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס חממת humidified עם 5% CO 2 למשך שעה 1. </li></ol> 3. הפוך אפשרות transfection siRNA * סעיף זה הוא אופציונלי ורלוונטי לאיור 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון של siRNA ב DDH RNase ללא 2 O (0.4 pmol / μl לדוגמא). הוסף 5 μl לבארות בודדות של צלחת 384 גם, ו צנטריפוגות הצלחת ב100 XG 15 seג בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל Lipofectamine 2000 בOpti-ממ בפקטור של 0.006 (למשל להוסיף 6 μl של Lipofectamine 2000 ל1,000 μl של Opti-ממ), ומערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה פתרון Lipofectamine 2000/Opti-MEM במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. הוסף 5 μl של פתרון Lipofectamine 2000/Opti-MEM המדולל לבארות בודדות של צלחת 384 גם שכבר מכיל siRNA. צנטריפוגה את הצלחת ב100 XG במשך 15 שניות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת ל30 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים מוכנים assay הצלחת כפי שתואר לעיל (סעיף 2). צנטריפוגה את הצלחת ב100 XG במשך 15 שניות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור צלחת assay לחממת humidified על 37 מעלות צלזיוס (5% CO 2) ל48-96 שעה כפי שנקבע לגן ממוקד להפיל (ראו דיון). </li></ol> 4. הקרנת מולקולה קטנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את התרופה של עניין (מעכבים למשל. מולקולה קטנה) בOpti-ממ ל6x הריכוזים הסופיים הרצויים. דילולים סידוריים ניתן להשלים באמצעות טפטפות כף יד או תחנת טיפול נוזלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2.5 μl / טוב של מתחם הבדיקה או מאגר המכיל רכב (למשל DMSO) לצד השני של הבארות בעזרת פיפטה רבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את הצלחת ב100 XG במשך 15 שניות בטמפרטורת חדר (דגירה היא אופציונלית). </li></ol> 5. מתמשך אגוניסט טיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 600 ננומטר (כלומר. 6 פעמים הריכוז הסופי הרצוי של 100 ננומטר) פתרון של quinpirole בOpti-ממ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2.5 μl / טוב של פתרון quinpirole ננומטר 600 לצד השני של הבארות בעזרת פיפטה רבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את הצלחת ב100 XG במשך 15 שניות בטמפרטורת חדר, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס חממת humidified עם 5% CO 2 למשך 2 שעות. </li></ol> 6. גירוי של cAMP צבירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה 2 שעות, להכין stimulatiעל פתרון בOpti-ממ. פתרון הגירוי מורכב מ40 forskolin מיקרומטר, 2 מיקרומטר 3-isobutyl-1-methyxanthine (IBMX), ו -4 spiperone מיקרומטר (כל הריכוזים בשלב 6 הם 4x הריכוז הסופי הרצוי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת μl 5 / היטב פתרון הגירוי לצד השני של הבארות בעזרת פיפטה רבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את הצלחת ב100 XG במשך 15 שניות בטמפרטורת חדר, ודגירה בטמפרטורת חדר למשך שעה 1. </li></ol> 7. מרווה והערכת cAMP הצבירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייצור של cAMP בתאים נמדד באמצעות 2 הערכה הדינמית cAMP על פי הוראות יצרן. בקצרה, מחדש אנטי cAMP-cryptate וcAMP-D2 במים מזוקקים. להקפיא aliquots ב -20 ° C עבור אחסון לטווח קצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל aliquot אחד נגד cAMP-cryptate וaliquot אחד בנפרד cAMP-D2 במאגר תמוגה על פי הוראות היצרן כדי להפוך את הפתרונות עובדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">dd 10 μl / טוב של הפתרון עובד נגד cAMP-cryptate ו10 μl / טוב של הפתרון עובד cAMP-D2 לצלחת 384 גם בעזרת פיפטה רבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את הצלחת ב100 XG במשך 15 שניות בטמפרטורת חדר, ודגירה בטמפרטורת חדר למשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו את הצלחת בקורא צלחת פלואורסצנטי (הגדרת קנה מידה אוטומטית לרגישות) באמצעות עירור של 337 ננומטר, ולמדוד את הפליטות ב620 ננומטר ו665 ננומטר למייצר הוראות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל ניתוח ratiometric להעריך עקומת סטנדרט cAMP למייצרת הוראות. שימוש בערכים שהתקבלו, להסיק את הצטברות cAMP המוערכת בבארות הבדיקה באמצעות תוכנה לניתוח נתונים. </li></ol>

<ol><li>Sharma, S. K., Klee, W. A., Nirenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+regulation+of+adenylate+cyclase+accounts+for+narcotic+dependence+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dual regulation of adenylate cyclase accounts for narcotic dependence and tolerance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3092-3096 (1975).</li>
<li>Watts, V. J., Neve, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitization+of+adenylate+cyclase+by+Galpha%28i%2Fo%29-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Sensitization of adenylate cyclase by Galpha(i/o)-coupled receptors.</a> Pharmacol. Ther. 106, 405-421 (2005).</li>
<li>Christie, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+neuroadaptations+to+chronic+opioids%3A+tolerance%2C+withdrawal+and+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Cellular neuroadaptations to chronic opioids: tolerance, withdrawal and addiction.</a> Br. J. Pharmacol. 154, 384-396 (2008).</li>
<li>Fan, P., Jiang, Z., Diamond, I., Yao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+AGS3+during+morphine+withdrawal+promotes+cAMP+superactivation+via+adenylyl+cyclase+5+and+7+in+rat+nucleus+accumbens%2Fstriatal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of AGS3 during morphine withdrawal promotes cAMP superactivation via adenylyl cyclase 5 and 7 in rat nucleus accumbens/striatal neurons.</a> Mol. Pharmacol. 76 (3), 526-533 (2009).</li>
<li>Bohn, L. M., Gainetdinov, R. R., Lin, R. T., Lefkowitz, R. J., Caron, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((m-Opioid+receptor+desensitization+by+%CE%B2-arrestin-2+determines+morphine+tolerance+but+not+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">m-Opioid receptor desensitization by β-arrestin-2 determines morphine tolerance but not dependence.</a> Nature. 408, 720-723 (2000).</li>
<li>Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+long-term+plasticity+underlying+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of long-term plasticity underlying addiction.</a> Nat. Rev. 2, 119-128 (2001).</li>
<li>Avidor-Reiss, T., Nevo, I., Saya, D., Bayewitch, M., Vogel, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opiate-induced+adenylyl+cyclase+superactivation+is+isozyme-specific%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Opiate-induced adenylyl cyclase superactivation is isozyme-specific.</a> J. Biol. Chem. 272, 5040-5047 (1997).</li>
<li>Sadana, R., Dessauer, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+roles+for+G+protein-regulated+adenylyl+cyclase+isoforms%3A+insights+from+knockout+and+overexpression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosignals%22%5BJournal%5D)">Physiological roles for G protein-regulated adenylyl cyclase isoforms: insights from knockout and overexpression studies.</a> Neurosignals. 17, 5-22 (2009).</li>
<li>Kim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenylyl+cyclase+type+5+%28AC5%29+is+an+essential+mediator+of+morphine+action%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Adenylyl cyclase type 5 (AC5) is an essential mediator of morphine action.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3908-3913 (2006).</li>
<li>Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenylyl+cyclase+isoforms+as+novel+therapeutic+targets%3A+an+exciting+example+of+excitotoxicity+neuroprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Interv%22%5BJournal%5D)">Adenylyl cyclase isoforms as novel therapeutic targets: an exciting example of excitotoxicity neuroprotection.</a> Mol. Interv. 7, 70-73 (2007).</li>
<li>Beazely, M. A., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+properties+of+adenylate+cyclases+type+5+and+6%3A+A+progress+report%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Regulatory properties of adenylate cyclases type 5 and 6: A progress report.</a> Eur. J. Pharmacol. 535, 1-12 (2006).</li>
<li>Ejendal, K. F. K., Przybyla, J. A., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+10%5BTitle%5D)+AND+%22Adenylyl+cyclase+isoform-specific+signaling+of+GPCRs.+G+Protein-Coupled+Receptors%3A+Structure%2C+Signaling%2C+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Chapter 10.</a> Adenylyl cyclase isoform-specific signaling of GPCRs. G Protein-Coupled Receptors: Structure, Signaling, and Physiology. Siehler, S., Milligan, G. 10, Cambridge University Chapter. 189-217 (2010).</li>
<li>Lin, Y., Smrcka, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+molecular+recognition+by+G+protein+betagamma+subunits+on+the+path+to+pharmacological+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Understanding molecular recognition by G protein betagamma subunits on the path to pharmacological targeting.</a> Mol. Pharmacol. 80, 551-557 (2011).</li>
<li>Cumbay, M. G., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+sensitization+of+recombinant+adenylate+cyclases+by+activation+of+D2+dopamine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Heterologous sensitization of recombinant adenylate cyclases by activation of D2 dopamine receptors.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 297, 1201-1209 (2001).</li>
<li>Watts, V. J., Neve, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitization+of+endogenous+and+recombinant+adenylate+cyclase+by+activation+of+D2+dopamine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Sensitization of endogenous and recombinant adenylate cyclase by activation of D2 dopamine receptors.</a> Mol. Pharmacol. 50, 966-976 (1996).</li>
<li>Nevo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+adenylyl+cyclase+isozymes+on+acute+and+chronic+activation+of+inhibitory+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Regulation of adenylyl cyclase isozymes on acute and chronic activation of inhibitory receptors.</a> Mol. Pharmacol. 54, 419-426 (1998).</li>
<li>Nevo, I., Avidor-Reiss, T., Levy, R., Bayewitch, M., Vogel, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+and+chronic+activation+of+the+m-opioid+receptor+with+the+endogenous+ligand+endomorphin+differentially+regulates+adenylyl+cyclase+isozymes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Acute and chronic activation of the m-opioid receptor with the endogenous ligand endomorphin differentially regulates adenylyl cyclase isozymes.</a> Neuropharmacology. 39, 364-371 (2000).</li>
<li>Beazely, M. A., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+a+novel+PKC+isoform+synergistically+enhances+D2L+dopamine+receptor-mediated+sensitization+of+adenylate+cyclase+type+6%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Signal%22%5BJournal%5D)">Activation of a novel PKC isoform synergistically enhances D2L dopamine receptor-mediated sensitization of adenylate cyclase type 6.</a> Cell. Signal. 17, 647-653 (2005).</li>
<li>Vortherms, T. A., Nguyen, C. H., Berlot, C. H., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+molecular+tools+to+dissect+the+role+of+Gs+in+sensitization+of+AC1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Using molecular tools to dissect the role of Gs in sensitization of AC1.</a> Mol. Pharmacol. 66, 1617-1624 (2004).</li>
<li>Watts, V. J., Taussig, R., Neve, R., Neve, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+D2+receptor-induced+heterologous+sensitization+of+adenylyl+cyclase+requires+Gas%3A+Characterization+of+Gas-insensitive+mutants+of+adenylyl+cyclase+V%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Dopamine D2 receptor-induced heterologous sensitization of adenylyl cyclase requires Gas: Characterization of Gas-insensitive mutants of adenylyl cyclase V.</a> Mol. Pharmacol. 60, 1168-1172 (2001).</li>
<li>Ejendal, K. F., Dessauer, C. W., Hebert, T. E., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+D%282%29+Receptor-Mediated+Heterologous+Sensitization+of+AC5+Requires+Signalosome+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Signal+Transduct%22%5BJournal%5D)">Dopamine D(2) Receptor-Mediated Heterologous Sensitization of AC5 Requires Signalosome Assembly.</a> J. Signal Transduct. 2012, 210324(2012).</li>
<li>Johnston, C. A., Beazely, M. A., Vancura, A. F., Wang, J. K. T., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+sensitization+of+adenylate+cyclase+is+protein+kinase+A-dependent+in+Cath.a+differentiated+%28CAD%29-D2L+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Heterologous sensitization of adenylate cyclase is protein kinase A-dependent in Cath.a differentiated (CAD)-D2L cells.</a> J. Neurochem. 82, 1087-1096 (2002).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+adenylyl+cyclase+inhibitor+for+treating+neuropathic+and+inflammatory+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Identification of an adenylyl cyclase inhibitor for treating neuropathic and inflammatory pain.</a> Sci. Transl. Med. 3, 65ra3(2011).</li>
<li>Nordstedt, C., Fredholm, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modification+of+a+protein-binding+method+for+rapid+quantification+of+cAMP+in+cell-culture+supernatants+and+body+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A modification of a protein-binding method for rapid quantification of cAMP in cell-culture supernatants and body fluid.</a> Anal. Biochem. 189, 231-234 (1990).</li>
<li>Xia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+morphine-induced+cAMP+overshoot%3A+a+cell-based+assay+model+in+a+high-throughput+format%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of morphine-induced cAMP overshoot: a cell-based assay model in a high-throughput format.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 31, 901-907 (2011).</li>
<li>Zaman, G. J., de Roos, J. A., Blomenrohr, M., Van Koppen, C. J., Oosterom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreserved+cells+facilitate+cell-based+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Cryopreserved cells facilitate cell-based drug discovery.</a> Drug Discov. Today. 12, 521-526 (2007).</li>
<li>Varga, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+adenylyl+cyclase+isoenzymes+in+CHO+and+B82+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Identification of adenylyl cyclase isoenzymes in CHO and B82 cells.</a> Eur. J. Pharmacol. 348, R1-R2 (1998).</li>
<li>Masri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonism+of+dopamine+D2+receptor%2Fbeta-arrestin+2+interaction+is+a+common+property+of+clinically+effective+antipsychotics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Antagonism of dopamine D2 receptor/beta-arrestin 2 interaction is a common property of clinically effective antipsychotics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 13656-13661 (2008).</li>
<li>Thaker, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+glioblastoma+multiforme+through+short+interfering+RNA+screening%3A+a+paradigm+for+therapeutic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurg.+Focus%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of glioblastoma multiforme through short interfering RNA screening: a paradigm for therapeutic development.</a> Neurosurg. Focus. 28, E4(2010).</li>
<li>Echeverri, C. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+RNAi+screening+in+cultured+cells%3A+a+user%27s+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Geneti%22%5BJournal%5D)">High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide.</a> Nat. Rev. Geneti. 7, 373-384 (2006).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Ejendal, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+antagonists+of+tick+dopamine+receptors+via+chemical+library+screening+and+comparative+pharmacological+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Discovery of antagonists of tick dopamine receptors via chemical library screening and comparative pharmacological analyses.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 42, 846-853 (2012).</li>
<li>Meyer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%22genome-to-lead%22+approach+for+insecticide+discovery%3A+pharmacological+characterization+and+screening+of+Aedes+aegypti+D%281%29-like+dopamine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl.Trop.+Dis%22%5BJournal%5D)">A "genome-to-lead" approach for insecticide discovery: pharmacological characterization and screening of Aedes aegypti D(1)-like dopamine receptors.</a> PLoS Negl.Trop. Dis. 6, e1478(2012).</li>
<li>Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+insights+into+firefly+luciferase+and+other+bioluminescent+reporters+used+in+chemical+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology.</a> Chem. Biol. 17, 646-657 (2010).</li>
<li>Fan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+genetically+encoded+biosensors+using+firefly+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase.</a> ACS Chem. Biol. 3, 346-351 (2008).</li>
<li>Jiang, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+cAMP+BRET+sensor+to+characterize+a+novel+regulation+of+cAMP+by+the+sphingosine+1-phosphate%2FG13+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway.</a> J. Biol. Chem. 282, 10576-10584 (2007).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

במאמץ להקל על מחקרים של רגישות Heterologous, יש לנו בהרחבה שונו השיטה הקודמת שלנו להשגת יעילה &quot;תערובת ולקרוא&quot; פורמט זה הוא amendable להקרנת תפוקה גבוהה ומנגנון של בדיקת פעולה. השינויים העיקריים לפרוטוקול שלנו ניתן לסכם באופן הבא: 1) השימוש בתאי cryopreserved כמו חומרים כימיים &quot;assay-Ready&quot;; 2) המזעור של assay לפורמט 384 גם: 3) הניצול של מדידת HTRF של cAMP. האימוץ של שימור בהקפאה למבחני תא מבוס...

Cyclase adenylyl אדפטיבית (AC) איתות תגובה המכונה Heterologous או סופר רגישות התגלה לראשונה במעבדתו של חתן פרס נובל, ד&quot;ר מרשל נירנברג. ד&quot;ר נירנברג הציעה שנצפתה היענות AC עלתה בעקבות הפעלת קולטן כרונית δ אופיואידים הייתה מנגנון המעורב בסובלנות אופיום ותלות 1. בנוסף להפעלת קולטן כרונית δ אופיואידים, תגובת neuroadaptive זה של איתות AC מתרחשת גם לאחר הפעלה מתמשכת של כמה קולטנים אחרים Gαi / מצמידים o 2. יש לציין, רבים של קולטנים אלה קשורים לכאב, הפרעות נוירופסיכיאטריות ונוירולוגיות, וכוללים אופיואידים μ / κ, D דופמין 2/4, 5HT 1A, ו-M 2/4 קולטנים מוסקריניים 2. בנוסף לממצאיו של ד&quot;ר נירנברג, גוף גדול של ראיות המקשר רגישות של איתות AC להפעלת קולט אופיואידים כרונית שני <eמ&gt; במבחנה in vivo 3-7. רגישות של AC גם הייתה קשורה עם מגוון רחב של מחלות מעורבים קולטני דופאמין כמו 2 D כולל סכיזופרניה ומחלת פרקינסון (לסקירה ראתה התייחסות 2). למרות החשיבות הפוטנציאלית של רגישות, המנגנון המדויק (ים) הקשורים / הפעלה מתמשכת Gαi מצמידים o רצפטור שמוביל לעלייה בהיענות AC נשארה במידה רבה לא ידועה. מחקרים אלה מספקים רציונל לבחינת המנגנונים לרגישות של cyclase adenylyl כיעד הנוירוביולוגי חשוב. כמו כן, את הרלוונטיות הפיזיולוגיות של AC איתות 8 ואת החשיבות שisoforms AC הבודד להחזיק בתגובה מסתגלת זה צריכים גם להיות מוכר 2,9,10. בהקשר של המחקר שלנו, את התכונות הכלליות הקשורים לרגישות Heterologous של isoforms רקומביננטי של AC במקביל מאפיינים אלה described ללימוד isoforms אנדוגני של AC. באופן ספציפי, המחקרים קודמים מצאו כי ההפעלה של חלבוני Gαi / o ויחידות מהשנה שלאחר מכן שחרור / βγ התארגנות הן דרישות חשובות לרגישות הקולטן המושרית של כל isoforms AC. בנוסף, מספר מחקרים מצביעים על כך שהאיתות מקינאז החלבון ויחידות משנת Gβγ מעורבות ברגישות 2,11-13. מזגנים בודדים גם להציג דפוסי רגישות ייחודיים ומובחנים 12. לדוגמא, חשיפה מתמשכת של D 2 קולטנים לאגוניסטים קשורה לרגישות של AC1 וAC8 Ca 2 גירוי + / calmodulin 14,15, ואילו AC3 הקשור קשר הדוק לא רגיש 2. AC2, AC4, וAC7 קשור באופן הדוק, עם זאת, רק פעילות AC2 PKC מגורה היא רגישה וחסונה לאחר חשיפה ממושכת של D 2 קולטנים לאגוניסטים 7,14,16,17. בנוסף, AC5 וAC6 להראות מידה ניכרת של יתר מכירהרגישות ologous לגז וצבירת cAMP מגורה forskolin הבא הפעלה של D 2 קולטנים 14,18-20, אבל נראה שונים בדרישה שלהם לGβγ מקטע-AC קשרי גומלין ש21. למרות שרוב המחקרים של רגישות AC השתמשו קווי מודל תא (לדוגמא תאי HEK293 להביע isoforms AC הבודד), נראה כי ממצאים אלה לתרגם למודלי תא עצביים מקומיים 4,22. לאחרונה, את ההשפעות של מעכבי איזופורם AC סלקטיבית מולקולה קטנות שזוהו בתאי HEK293 להביע isoforms AC יכולות גם להיות מתורגמות למחקרים התנהגותיים in vivo 23. חוסר מנגנון מולקולרי שזוהה ולרגישות Heterologous כנראה משקף את המורכבות של התגובה המסתגלת, כמו גם מאפייני רגולציה הייחודיים של הפרט AC isoforms 12. להתיר מורכבות כזה מסתבך עוד יותר על ידי השימוש במתודולוגיה לא מסורבליםכובע הגביל חוקרים אקדמיים מהעסקת גישות משוחדת. לדוגמא, המחקרים מכניסטית הקודמים שלנו כללו שימוש במודלים סלולריים ברציפות תרבותי באמצעות 24 - ופורמט תרבית רקמת 48 היטב 15. תאים בתרבית גדלו בדרך כלל עבור 48 שעות ולאחר מכן נתון לטיפול אגוניסט תרופה (2-18 hr) ואחריו סדרה של שוטף התא וincubations (איור 1). פרוטוקולי הצטברות cAMP הספציפי AC-איזופורם היו אז מועסקים ואחרי מדידה של הצטברות cAMP באמצעות [3 H] מפרך וזמן רב cAMP מחייב מתודולוגיה 15,24. המשך מהתחלה ועד סוף לכל assay נדרש בדרך כלל כולל של ארבעה עד חמישה ימים מציפוי תא לניתוח נתונים (איור 1). היישום של טכנולוגיות ואוטומציה חדשות הוביל לשיפורים ניכר ללימודי רגישות בסביבה התעשייתית ומרכז HTS. לדוגמא, קבוצה עובדת עם המרכז הלאומי לחמיםקאל ג&#39;נומיקס דיווח יומיים HTS הליך assay לזיהוי מעכבי מולקולה קטנים של μ רגישות מושרה אופיואידים הקולטן בפורמט 1,536 היטב 25. המאמר הנוכחי מתאר את המאמצים שלנו כדי לפתח assay HTS ללימודים של רגישות Heterologous תוך שימוש בטכנולוגיות שזמינות ברוב מוסדות מחקר האקדמיים. אסטרטגיה זו הושגה על ידי שילוב של השימוש בתאי cryopreserved ממודלי תא heterologously מבטא את קולטן דופמין D 2 בשילוב עם isoforms cyclase adenylyl רקומביננטי אנדוגני או אדם (CHO-D 2L או HEK-AC6 / D 2 ליטר). כדי לשפר את התפוקה שלנו, אנחנו מחדש assay שלנו 48 גם הרגישות (בערך&gt; 20 צעדים על 4-5 ימים) לחמישה שלבים assay יום אחד, בפורמט 384 גם שהיה למעשה &quot;לערבב ולקרוא&quot;. הפורמט החדש משתמש בקרינת זמן הומוגני זמינה מסחרי נפתרה assay (HTRF) כדי למדוד ACC cAMPumulation בתאים שלמים עם קורא צלחת מצב מרובה. Assay הוא איתן וניתן להקרנת מולקולה קטנה, ויכול להיות מיושם בצורה יעילה למסך למעכבים של רגישות Heterologous. בנוסף, אנו מספקים מידע שמאפשר השימוש של assay זה עם transfection ההפוך של siRNA להקרנת ספריית siRNA רחבה ממוקדת או הגנום עם שינוי קל בלבד לגישה הכללית.

<table><tbody><tr><td>CHO-K1-DRD2L תאים</td><td>DiscoveRx</td><td>930579C2</td><td></td></tr><tr><td>חזיר' s F12 מדיה</td><td>VWR</td><td>SH30026fs</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>VWR</td><td>SH3007003</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Sigma</td><td>A1720</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin</td><td>Fisher</td><td>50-230-5556</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Life Technologies</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>כלים 15 ס"מ</td><td>BD Falcon</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>מאגר דיסוציאציה של תאים</td><td>Life Technologies</td><td>13150016</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Life Technologies</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Fisher</td><td>976171</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>TC מטופל 384 צלחות</td><td>Perkin-Elmer</td><td>6007688</td><td></td></tr><tr><td>HTRF cAMP Dynamic 2 kit</td><td>Cisbio Bioassays</td><td>62AM4PEB</td><td>http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay</td></tr><tr><td>Synergy 4</td><td>Biotek</td><td>H4MLFPTAD</td><td></td></tr><tr><td>Prism 6</td><td>GraphPad Software</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>(&plusmn;)Quinpirole</td><td>Sigma</td><td>Q111</td><td></td></tr><tr><td>Spiperone</td><td>Sigma</td><td>S7395</td><td></td></tr><tr><td>Clozapine</td><td>Sigma</td><td>C6305</td><td></td></tr><tr><td>Haloperidol</td><td>Sigma</td><td>H1512</td><td></td></tr><tr><td>S-(-) Sulpiride</td><td>Sigma</td><td>S112</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 מגיב טרנספקציה</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Life טכנולוגיות</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>MP ביו-רפואי</td><td>נטול מים, DNase ו-RNase</td><td>821739</td><td></td></tr><tr><td>Gas siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>מותאם אישית siRNA</td><td></td></tr><tr><td>בקרת siRNA לא ממוקדת</td><td>Dharmacon</td><td>D-001206-14-20</td><td></td></tr><tr><td>siGlo Red</td><td>Dharmacon</td><td>D-001630-02</td><td></td></tr></tbody></table>

רגישות סמים של adenylyl cyclase: התייעלות assay ומזעור למולקולה קטנה ויישומים הקרנת sirna

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

רגישות של cyclase adenylyl איתות (AC) הייתה מעורבת במגוון רחב של הפרעות נוירופסיכיאטריות ונוירולוגיות, כולל שימוש בסמים ומחלת פרקינסון. הפעלה חריפה של / קולטנים צמודים o Gαi מעכבת את פעילות AC, ואילו הפעלה מתמשכת של תוצאות קולטנים אלה ברגישות Heterologous של AC ורמות מוגברות של cAMP התוך התאי. שמחקרים קודמים הוכיחו כי שיפור זה של היענות AC הוא ציין הן במבחנה in vivo לאחר ההפעלה הכרונית של מספר סוגים של קולטנים / צמוד o Gαi כולל D 2 דופאמין וμ קולטני אופיואידים. למרות רגישות Heterologous של AC דווחה לראשונה לפני כארבעה עשורים, המנגנון (ים) העומד בבסיס תופעה זו אינו ידוע ברוב. המחסור בנתונים מכניסטית ככל הנראה משקפים את המורכבות כרוכות בתגובה מסתגלת זה, טוען כי גישות nonbiased יכולים לסייע בזיהויing המסלולים המולקולריים מעורבים ברגישות Heterologous של AC. מחקרים קודמים מעורבים קינאז ואיתות Gbγ כחופפים מרכיבים המווסתים את רגישות Heterologous של AC. כדי לזהות מטרות חופפות וייחודיות נוספות הקשורות לרגישות של AC, הפיתוח והאימות של assay רגישות cAMP מדרגי נדרש לתפוקה גדולה יותר. גישות קודמות כדי ללמוד רגישות הן בדרך כלל מסורבלות מעורבת תחזוקה רציפה תא תרבות, כמו גם במתודולוגיה מורכבת למדידת צבירת cAMP שכוללת שלבי שטיפה מרובים. לכן, הפיתוח של assay מבוסס תאים חזק שיכול לשמש עבור הקרנת תפוקה גבוהה (HTS) בפורמט גם 384 יקל מחקרים עתידיים. שימוש בשני דגמי D 2 קולטן דופמין סלולריים (כלומר. CHO-D 2L וHEK-AC6 / D 2L), יש לנו להמיר assay שלנו 48 היטב הרגישות (&gt; 20 צעדים 4-5 ימים) ולחמש-sTEP, assay יום אחד בפורמט 384 גם. התבנית חדשה זו ניתנת להקרנת מולקולה קטנה, ואנו מראים כי עיצוב assay זה יכול גם לשמש בקלות עבור transfection ההפוך של siRNA בציפייה להקרנת ספריית siRNA ממוקד.

חלק א פיתוח assay רגישות גם Heterologous 384 לזיהוי מעכבי מולקולה קטנים תוך שימוש במודל סלולרי זמין באופן מסחרי. ללמוד רגישות Heterologous במודל תא, עשינו מספר השיפורים שאפשרו לנו לייעל את assay לפורמט &quot;לערבב ולקרוא&quot;. כמה מהשינויים המרכזיים מודגשים בהמשך, והם מתוארים בפירוט רב יותר בדיון. צעד המפתח הראשון היה שינוי תרבית התאים שלנו מהתאים ברציפות בתרבית תאי cryopreserved 26. ...

הפעלה מתמדת של תוצאות מעכבות G-חלבון בשילוב קולטנים ברגישות של איתות cyclase adenylyl. כדי לזהות את המסלולים מולקולריים החיוניים, גישות nonbiased נחוצות, עם זאת, אסטרטגיה זו מחייבת הפיתוח של assay רגישות cAMP מבוסס תאים ניתן להרחבה. בזאת, אנו מתארים assay רגישות למולקולה קטנה והקרנת siRNA.

רגישות סמים של adenylyl cyclase: התייעלות Assay ומזעור למולקולה קטנה ויישומים הקרנת siRNA

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לפתח בדיקת רגישות ל-cyclic A MP מבוססת תאים המבוצעת ביום אחד עבור יישומים של סריקה בשניקה גבוהה, כולל סריקת ספריות כימיות. מטרה זו מושגת תחילה על ידי הפשרה וזריעה של תאים קפואים שהוכנו מראש עבור הבדיקה. השלב השני הוא הוספת תרכובות בדיקה או אנטגוניסטים לתאים, ולאחר מכן הוספת התרופה המגבירה את הרגישות לאדניל ציקלאז.בשלב הבא מוסיפים מפעיל adenylyl cyclase בנוכחות מעכב phosphodiesterase כדי לעורר הצטברות של cyclic A MP. השלב הסופי הוא השבתת התגובה באמצעות Reagents לזיהוי cyclic A MP בשיטת homogenous time resolved fluorescence או HTRF, הממBסים בתמיסת ליזיס (lysis buffer), ולאחר מכן מדידת הפלואורסצנציה. בסופו של דבר, השימוש בתאים קריו-משומרים ובטכנולוגיית HTRF cyclic A MP מאפשר ביצוע של בדיקת רגישות (sensitization assay) בתא יום אחד לסריקת מולקולות קטנות.הרעיון לגישה זו עלה לראשונה כאשר התעניינו בשימוש בסריקה ברגישה (high-throughput screening) כדי לחקור רגישות הטרוגנית מתווכת-רצפטור של ציקלאז דנטלי. שתי טכניקות מרכזיות המשמשות כאן כוללות שימוש בתאים קפואים כריאגנטים זמינים (off the shelf) ושימוש בערכות בדיקה של זמן תוצאה הומוגני למדידת cAMP. המתודולוגיות הבסיסיות המשמשות כאן יכולות לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח באיתות תאי וגילוי תרופות באמצעות בדיקות מבוססות תאים. לתחילת העבודה, תרבתו תאי CHO D2L בצלחת תרבית תאים של 15 סנטימטר כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב; דגרו את התאים בטמפרטורה של 37°C באינקובטור לח עם 5% CO2 עד שהתאים יגיעו ל-90 עד 95% Confluent; לאחר מכן, שטפו את התאים עם 10 מיליליטר של פוספט buffered saline או PBS, ואספו את התאים ב-3 מיליליטר של בופר לפירוק תאים (cell dissociation buffer) לאחר דגירה של חמש דקות ב-37°C.לאחר מכן, השהו את התאים ב-12 milliliters של מצע תרבית, וספרו את התאים באמצעות שיטת הדחת trypan blue. סובבו את תגלי התאים בצנטריפוגה ב-500 Gs למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שאבו את הנוזל שמעל והשהו את משקע התאים ב-5 milliliters של מצע הקפאה. לאחר דילול תגלי התאים להשגת ריכוז התאים הרצוי, העבירו aliquot של 1 milliliter מתמיסת התאים לכל מבחנת קריו (cryo vial). הדגירו את מבחנות הקריו במכל הקפאת תאים בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס למשך לילה.ביום למחרת, העבירו את מבחנות הקריו למכל מיצני חנקן לאחסון לטווח ארוך. כדי להכין תאי מערך (plate assay), ראשית הפשירו במהירות מבחנת קריו קפואה של תאים במקלח מים של 37 °C. לאחר הפשרת התאים, העבירו אותם למבחנה קונית של 15 ml המכילה תשעה ml של optimum ועזרו לערבב על ידי היפוך המבחנה שלושה עד חמישה פעמים, ולאחר מכן בצעו סרקיגציה של התאים ב-500 Gs למשך חמש דקות. בטמפרטורת החדר, שאבו את supernatant והשביו את התאים ב-1 ml של optimum.ספרו את התאים באמצעות שיטת הדחת trypan blue כדי לקבוע את חיוניות התאים לפני דילול התאים החיוניים לפי הצורך. לאחר מכן, זרקו 10 µL של תאים לכל באר בלוח 384 בארים שעבר טיפול לתרבית רקמות, באמצעות פיפט רב-ערוצי.הכינו דלואות סדרתיות של cyclic AMP ובחרו את הריכוז האופטימלי ליצירת עקומת סטנדרט להערכת ייצור cyclic AMP על ידי התאים. הוסיפו לכל באר בלוחית 10 µL של סטנדרטים של cyclic AMP. סבבו את הלוחית בצנטריפוגה במהירות של 100 ×g למשך 15 שניות בטמפרטורת החדר, והדגירו ב-37 °C באינקובטור לח עם 5% CO2 למשך שעה אחת.לצורך סריקת מולקולות קטנות, ראשית יש לדלל את התרופה הנבדקת בריכוז אופטימלי עד פי שישה מהריכוזים הסופיים הרצויים. ניתן לבצע דילול סדרתי באמצעות פיפטות ידניות או תחנת טיפול בנוזלים. הוסף 2.5 µL לכל באער של הבדיקה, התרכובת או הבאפר המכיל vehicle.החילו את התמיסה לדופן הבארות באמצעות פיפט רב-ערוצי וסובבו את הפלטה בצנטריפוגה ב-100 GS למשך 15 שניות. בטמפרטורת החדר, עבור טיפול באגוניסט עמיד, הכינו תמיסת Quin parol בריכוז 600 nanomolar והוסיפו 2.5 microliters של תמיסת ה-Quin parol בריכוז 600 nanomolar לכל בארה לדופן הבארות. באמצעות פיפט רב-ערוצי, סובבב את הפלטה שוב בצנטריפוגה לפני דגירה ב-37 degrees Celsius בתוך אינקובטור לח עם 5%CO2 למשך שעתיים.במהלך הדגירה שנמשכת שעתיים, הכין את תמיסת הגירוי ב-OptiMEM כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. הוסף חמישה מיקרוליטרים לכל באר מתמיסת הגירוי לדפנות הבארים באמצעות פיפט רב-ערוצי, לאחר סבב צנטריפוגה של הפלטה וכפי שנעשה בעבר, והדגש בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. ייצור של cyclic AMP על ידי התאים נמדד באמצעות ערכת cyclic AMP dynamic 2 לפי הוראות היצרן; בקצרה, השב את anti-cyclic AMPK crypt ו-cyclic AMPD 2 במים מזוקקים, דלל מנה אחת של anti-cyclic AMPK crypt ומנה אחת של cyclic AMPD 2 בנפרד בבופר הליזה, בהתאם להוראות היצרן, להכנת תמיסות עבודה. כדי לעצור את הצטברות ה-cyclic AMP בפלטת 384 הבארים, הוסף 10 מיקרוליטרים לכל באר של תמיסת העבודה anti-cyclic AMPK crypt 8 ו-10 מיקרוליטרים לכל באר של תמיסת העבודה cyclic AMPD 2.בעזרת פיפט רב-ערוצי, סבבו את הפלטה שוב בצנטריפוגה ב-100 GS למשך 15 שניות בטמפרטורת החדר לפני דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת; קראו את הפלטות בקורא פלטות פלואורסצנציה תוך שימוש בעירור של 337 ננומטר ומדדו את הפליטות ב-620 ננומטר ו-665 ננומטר בהתאם להוראות היצרן. בצעו ניתוח רציומטרי כדי להעריך את עקומת הסטנדרט של cyclic A MP בהתאם להוראות היצרן. בעזרת הערכים שהתקבלו, בצעו אקסטרפולציה להערכת הצטברות ה-cyclic A MP בבאירי הבדיקה באמצעות תוכנה לניתוח נתונים.תאי CHO D two L שהוקפאו בשימור קריוגני נזרעו ישירות לתוך פלטות בדיקה בעלות 384 בארות, כדי להדגים שניתן לבצע בדיקות רגישות (sensitization assays) בפורמט של 384 בארות, ובכך להפחית את מספר השלבים מעל 20 לשמישה בלבד. המחקרים גילו כי טיפול מקדים של שעתיים ב-Quin Perol הגביר את הצטברות ה-cyclic A MP שנגרמה בעקבות גירוי של ארבע שעות, באופן התלוי במינון ועקבי עם רגישות הטרוגנית. סדרת הניסויים השנייה בחנה האם ניתן להשתמש בבדיקה יעילה ומהירה זו להערכת מעכבים של תהליך הרגישות.התוצאות הראשוניות גילו כי טיפול מקדים בהלופרידול או בפירופירון, אנטגוניסטים פרוטוטיפיים של D2, מנע לחלוטין את הרגישות המושרה על ידי קווינפירון להצטברות של cAMP מחזורית מעוררת. שיטה זו שימשה לאחר מכן להערכת העוצמה של סדרה של אנטגוניסטים ל-D2, כדי לבחון אם תרכובות אלו מעכבות רגישות באופן דומה לתוצאות הקודמות. מחקרים אלו הדגימו כי האנטגוניסטים ל-D2 עיכבו רגישות המושרה על ידי אגוניסט באופן תלוי מינון.המטרה הבאה הייתה לפתח בדיקת רגישות (sensitization assay) של 384 בארות, שניתן להשתמש בה לצורך סריקת ספריית siRNA באמצעות טרנספקציה הפוכה בקנה מידה רחב כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. התוצאות גילו כי חשיפת תאים לאגוניסט Quinparole למשך שעתיים הובילה להגברה ניכרת של Forskolin וע กระตุ้น הצטברות של cyclic AMP. ההצטברות המוגברת של cyclic AMP הן בריכוז של 100 nanomolar והן בריכוז של 300 nanomolar של Forskolin הייתה גבוהה פי 15 בהשוואה לתאים שעובדו עם vehicle. טרנספקציה הפוכה של GSS siRNA לתאים המבטאים קולטנים מסוג D2 חסמה את הרגישות של adenyl cyclase המושרה על ידי אגוניסט.כאשר נוסף האגוניסט של קולטן D2, Quin Perol, עוררה הצטברות של cyclic AMP שנמדדה באמצעות H-T-R-F; תגובת רגישות של 15-fold הופחתה ב-94%. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע את הבדיקה כולה בפחות משמונה שעות אם היא מבוצעת כראוי בהתאם לפרוטוקול זה. ניתן למדוד גם מולקולות איתות אחרות, כגון IP1 ו-Phospho-Akt, על מנת לבחון מסלולי איתות נוספים של הקולטן.

drug-induced-sensitization-adenylyl-cyclase-assay-streamlining

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

בסרטון זה, אנו מדגימים את המבחן ההומוגני של הקרבה הזוהרת המוגברת – בדיקת קרבה מבוססת חרוזים. הוא משתמש בחרוזי קבלה ותורם בגודל הומוגני, משותקים עם שני חלבונים הנוטים לקיים אינטראקציה כדי לסנן מולקולות קטנות פוטנציאליות המעכבות אינטראקציות חלבון.

בדיקה הומוגנית של קרבה זוהרת מוגברת: בדיקת קרבה מבוססת חרוזים לסינון מולקולות קטנות המעכבות אינטראקציות חלבון-חלבון

השגת הבנה ברמת מערכות של תהליכים תאיים היא מטרה של ביולוגיה של התא המודרנית. אנו מתארים כאן אסטרטגיות לכתבי לוציפראז ריבוב של תפקוד תאי שונים נקודות קצה לחקור את תפקוד גן באמצעות הגנום בקנה מידה ספריות RNAi.

פלטפורמת הקרנה מבוססת לוציפראז Multiplexed לחקירת מלחמה בסרטן הקשורים להעברת אותות בתאים בתרבית

אנו מציגים שיטה לקיבוע מהיר, הפיך של מולקולות קטנות והרכבות nanoparticle פונקציונליות ללימודי Surface Plasmon התהודה (SPR), תוך שימוש רציף לכידת הכימיה cycloaddition bioorthogonal ונוגדן אנטיגן על השבב.

Microfluidic תגובת Capture-חיי בן אשר על השבב כדי לשתק הפיך מולקולות קטנות או מבני Multi-רכיב עבור יישומי Biosensor

כאן, אנו מתארים בדיקה פנוטיפית החלה על מסכי תפוקה גבוהה / תוכן גבוה של RNA סינתטי קטן מפריע (siRNA), תרכובת כימית, וספריות מוטציה שחפת Mycobacterium. שיטה זו מסתמכת על זיהוי של שחפת Mycobacterium שכותרתו פלואורסצנטית בתוך תא מארח שכותרתו פלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית אוטומטית.

בדיקה פנוטיפית מיקרוסקופית לכימות של מיקובקטריה תאית המותאמת להקרנה בתפוקה גבוהה/תוכן גבוה

פרוטוקול מסופק לבחירת אפטמרים ממתגי מבנה עבור מטרות מולקולות קטנות בהתבסס על שיטת בחירת חרוזים מגנטיים קפדנית ניתנת לכוונון. אפטמרים שנבחרו עם תכונות מיתוג מבנה מועילים לבדיקות הדורשות שינוי קונפורמציה כדי לאותת על נוכחות מטרה, כגון בדיקת ננו-חלקיקי הזהב המתוארת.

שיטה לבחירת Aptamers מיתוג מבנה יישומית לColorimetric זהב Nanoparticle Assay

ספיחה של פפטידים לכלי פלסטיק במהלך דילולים סדרתיים מסורתיים מבוססי קצה יכולה להשפיע באופן משמעותי על קביעת העוצמה ולבלבל את ההבנה של קשרי מבנה-פעילות המשמשים לזיהוי עופרת ושלבי אופטימיזציה של עופרת בגילוי תרופות. כאן מתוארות שיטות לדילול סדרתי אקוסטי אוטומטי ללא מגע של דגימות פפטיד.

אקוסטית אוטומטית מחלק עבור דילול סדרה של אגוניסטים פפטיד ב מבחני קביעת און

אנו מציגים במחקר הנוכחי הוא assay קרינה מבוססת רומן באמצעות לימפוציטים נגזר עכבר מהונדס. Assay זה מתאים להקרנה תפוקה גבוהה (HTS) של מולקולות קטנות ניחן קיבולת אחד עיכוב או קידום ההפעלה הלימפוציטים.

Assay לימפוציטים הקרינה מבוסס מתאים להקרנה תפוקה גבוהה של מולקולות קטנות

נייר זה משתמש assay המבוססות על זרימת-cytometry לספריות מסך של מעכבי כימיים לצורך זיהוי מעכבי ו המטרות שלהם להשפיע על איתות לקולטן T-cell. ניתן להרחיב את השיטות המתוארות כאן גם עבור הקרנות תפוקה גבוהה.

זיהוי של מתווכים של קולטן תא T איתות באמצעות הקרנת הסרט מעכב כימי ספריות

באמצעות שיטת הסריקה (NADH)-ביחד התאמה ATPase הותאמה הקרנה חצי תפוקה גבוהה של מולקולה קטנה רירן מעכבי. זה שיטת הקינטי מופעל בפורמט 384-היטב אימונולוגיה עם כמויות התגובה הכולל של רק 20 μl לכל טוב. הפלטפורמה צריכה להיות ישימה כמעט כל הפקת האנזים.

הסתגלות למחצה בתפוקה גבוהה של מעכבי הנדח ביחד לסינון מולקולה קטנה

פרוטוקול זה מספק שיטה לאופטימיזציה גלובלית שיטתית של חיישנים ביולוגיים מקודדים גנטית באמצעות יצירה והערכה של ספריות גנטיות בסיוע אוטומציה. זה משולב עם מתודולוגיות תכנון ניסוי כדי לייעל את הניסויים ולאפשר בחירת רכיבים גנטיים כדי לכוונן את החיישנים הביולוגיים לתוצאות תכנון ספציפיות.

דגימה יעילה של מרחב תכנון חיישנים ביולוגיים מקודדים גנטית מתאפשרת עם תכנון ניסויים וזרימת עבודה של אוטומציה

פרוטוקול זה מציג מתודולוגיית סקר פלואורומטרית המותאמת לזיהוי מעכבי מוצר טבעי/מולקולות קטנות של סינתזת חלבונים. הפרקטיות שלו הופכת אותה למתאימה הן להוראה לתואר ראשון בטכניקות גילוי תרופות והן ליישום בקמפיינים של כימיה רפואית.

פרוטוקול מבוסס פלואורסצנציה לסינון ראשוני של מעכבי סינתזת חלבונים ממקורות טבעיים

למדו לפתח מבחן רגישות cAMP מבוסס תאים לסינון בקנה מידה גבוה באמצעות תאים מוקפאים וטכנולוגיית HTRF. שיטה זו מאפשרת זיהוי מסלולים מולקולריים ותגליות תרופות ביעילות.

רגישות סמים של adenylyl cyclase: התייעלות Assay ומזעור למולקולה קטנה ויישומים הקרנת siRNA

גלה סרטונים נוספים