ויזואליזציה של הדימרים synthase ATP במיטוכונדריה על ידי אלקטרונים קריו טומוגרפיה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבוע את המבנה והארגון של חלבונים מיטוכונדריאלים ב-C שתיים. זה מושג על ידי יצירת רשת מיקרוסקופ אלקטרונים מיובש קפוא המכילה את הדגימה. לאחר מכן, סדרת הטיה מוגבלת במינון של הדגימה נרשמת במיקרוסקופ קריו אלקטרונים.

לאחר מכן מעובדים את סדרת ההטיה ליצירת נפח טומוגרפי. לבסוף, צפיפות החלבון ממוצעת כדי לקבוע את מבנה החלבונים והממברנות מפולחות כדי לחשוף את המבנה התלת-ממדי שלהן. על ידי מיקום מחדש של ממוצעי החלבונים בחזרה לטום גרהם, המבנה והארגון של החלבונים בממברנה נחשף.

אז אנחנו עושים טומוגרפיה של קריאת אלקטרונים של מיטוכונדריה כי אנחנו רוצים להבין איך הם פועלים ברמה המולקולרית. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות, כמו מיקרוסקופ אלקטרונים של קטעי פלסטיק דקים הוא שהרזולוציה גבוהה יותר. החומר אינו מקובע כימית בשום צורה, והפרטים המולקולריים של החלבונים נשמרים.

הטכניקה של קריטוגרפיה אלקטרונית יכולה לקחת קצת זמן לשלוט, אך משתמשים מנוסים יכולים לרכוש חמישה עד שישה שטחי TOM באיכות טובה בכל מפגש. החלק הקשה ביותר בהליך הוא לייצר רשתות מיובשות קפואות בעובי קרח אופטימלי לאחר בידוד וכדור מיטוכונדריה, על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש ב-250 טריוזות T מילי-מולריות במאגר HEPA של 10 מילי-מולרי כדי להשעות מחדש את הגלולה לריכוז של כחמישה מיליגרם למיליליטר של פריקת זוהר חלבון כוללת. רשתות EM פחמן לחלוטין מחזיקות את צד הפחמן כלפי מעלה במכשיר ואקום בהתאם להוראות היצרן, מנזילות כמה מיליליטר של אתאן על ידי הפניית זרם של גז אתאן לצד הפנימי של מיכל אלומיניום מקורר חנקן נוזלי.

השתמש בזוג פינצטה כדי להרים רשת DM לפריקת זוהר ולהניח אותה על חלבון תערובת הספסל, תרחיף זהב מצומד, אחד לאחד עם התרחיף המיטוכונדריאלי, ומיד למרוח שלושה מיקרוליטרים של התמיסה על הרשת. לאחר מכן, הניחו את הפינצטה במכשיר זיגוג כמו גיליוטינה ביתית עם טריז של נייר פילטר, מחקו את עודפי הנוזל מהרשת ושחררו את ההדק כדי לצלול מיד את הרשת לאתאן נוזלי. לאחר מכן להעביר את הרשת מאתאן נוזלי לחנקן נוזלי.

הסר את עודפי האתאן מהרשת על ידי הנחת קצה של טריז נייר סינון טרי לתוך האתאן הנוזלי. כשהנוזל עולה, גרור בעדינות את הרשת במעלה נייר המסנן, שמור אותו מתחת לחזית הנוזל, ולאחר מכן העביר אותו מיד לחנקן נוזלי לאחסון לשימוש מאוחר יותר. הנח את הרשת בקופסת רשת ואחסן בעושה מלא חנקן נוזלי כדי להקליט סדרת הטיה טומוגרפית.

התחל בכך שתוודא שעושי החנקן הנוזלי מלאים, ובדוק שהטמפרטורה של שלב הדגימה ומכשיר העברת הרשת נמוכה מ-100 קלווין. ודא שמיקרוסקופ האלקטרונים מיושר היטב על ידי רכישת תמונה של רשת בדיקה ובדיקת איכות טבעות הקוצים הטבעות צריכות להיות עגולות ולהימשך עד קצה התמונה. לאחר מכן, הכניסו רשת עם מיטוכונדריה קפואה.

לאחר מכן, במצב חיפוש, חפש אזורים בעובי קרח ואיכות דגימה מתאימים. צלם תמונת חיפוש של שש שניות של אזורים מבטיחים כדי לקבוע התאמה לאיסוף נתונים. לאחר איתור אזור דגימה טוב, הטה את ה-tagפלוס מינוס 60 מעלות כדי לקבוע את טווח ההטיה המרבי הזמין ללא הפרעה של אזור החשיפה או המיקוד על ידי פסי רשת או גבישי קרח על חור מלא קרח סמוך בעל מראה דומה, שנה למצב חשיפה והתאם את עוצמת האלומה או זמן רכישת התמונה.

כך שלכל תמונה מוקלטת יש מינון אלקטרונים של 30 עד 50 אלקטרונים לפיקסל עבור CCDs או שישה עד שמונה אלקטרונים לפיקסל לשנייה. עבור גלאי אלקטרונים ישירים, חשב את יחס חלוקת המינון או I אפס מעל I 60 על ידי חלוקת ספירת האלקטרונים הממוצעת עבור תמונה של שנייה אחת שנרכשה באפס מעלות בתמונה של 60 מעלות על חור ריק. רכוש תמונה של שנייה אחת במצב חשיפה ושים לב לספירת האלקטרונים לכל אנגסטרום בריבוע.

תוך התחשבות ביחס חלוקת המינון, חשב את המספר הכולל של התמונות ומרווח ההטיה שניתן לרשום עבור מינון אלקטרונים כולל ספציפי באמצעות תוכנת איסוף נתונים אוטומטית מתאימה. הגדר והקלט טום אגראם עם הפרמטרים שנקבעו זה עתה טומוס טיפוסי. עבור דגימות אלה, התחל בפלוס מינוס 20 מעלות ועבור דרך אפס מעלות לפני שתגיע להטיות גבוהות.

כדי ליצור ולפלח Tomos, המר את סדרת ההטיה לתבנית קובץ המתאימה לתוכנת השחזור. באמצעות תוכנית שחזור של טום גרהם כמו Im mod, יישר את התמונות על ידי סימון המיקום של סמני הזהב. לאחר היישור, צור טומו גרהאם.

שפר את הניגודיות של הטומו גרהם על ידי שימוש במסנן תמונה כגון מסנן דיפוזיה איזוטרופי לא ליניארי המופץ עם IM o להדמיה. השתמש בתוכניות הזמינות מסחרית כדי לפלח את ה-Tom באופן ידני. הקצה ווקסלים המתאימים לממברנה הפנימית והחיצונית לשכבות נפרדות לאחר ההקצאה, צור משטח להמחשת הממברנות.

באמצעות אפשרות הלחיצה בתוסף חבילת EM עבור emira, סמן את המיקום של חלקיקי סינטאז TP באמצעות החלקיקים המסומנים כקלט וחבילת תוכנה מתאימה כגון הערכת החלקיקים. עבור תוכנית טומוגרפיה אלקטרונית, חשב ממוצע אגרם להערכת רזולוציה. חשב את המתאם של מעטפת המבואה בין שני ממוצעים תת-טומו שנקבעו באופן עצמאי באמצעות תוכנית ההדמיה החינמית.

כימרה התאימה מבני רנטגן ידועים לממוצע תת-טום אגראם תחילה באופן ידני, ולאחר מכן באופן אוטומטי עם התאמת הפקודה כפי שניתן לראות באיור זה, פילוח ידני של הממברנות בקריאת אלקטרונים מיטוכונדריאלית חושף את מבנה הכריסטי במיטוכונדריה. על ידי הדמיית מיטוכונדריה מזני נוקאאוט שמרים שחסרים חלבונים מסוימים. ניתן להעריך את ההשפעה של חלבונים אלה על המורפולוגיה של כריסטי.

מוצגת כאן מיטוכונדריה מזן שמרים חסר תת-יחידה E של סינתזת TP, הנדרשת ליצירת דימרים סינתטיים TP. בניגוד לללה כריסטי הרגילה של מיטוכונדריה מסוג בר, אברונים אלה מכילים במקום זאת מספר מבני ממברנה פנימיים נטולי כריסטי או מכילים פלישות ממברנות קטנות בצורת בלון. באינגרמות עם ניגודיות טובה, דימרים של A TP Synthes נראים בקלות כפי שמצוין כאן על ידי ראשי החצים הצהובים.

על ידי פילוח הממברנות, ניתן לדמיין את המיקום של סינתזת A TP המיוצגת כעת על ידי הכדור הצהוב ביחס למורפולוגיה של כריסטי. במקרה זה, סינתזת A TP יוצרת שורות של דימרים לאורך הקצוות המעוקלים מאוד של ממוצע ה-Lo Meer Christi Sub tommo מאפשר לקבוע את מבני החלבונים ברזולוציות של ארבעה ננומטר ומעלה. על ידי התאמת מבני קרני רנטגן ידועים לתת-טומו ניתן להרכיב מודלים אטומיים ממוצעים של גרהאם של קומפלקסים חלבונים בסביבתם הטבעית כפי שהם נראים לעין.

בדוגמה זו, ניתן להחזיר נפחים ממוצעים לתוך טומו גרהם על מנת לסייע בארגון של קומפלקסים בודדים ביחס זה לזה ולמתחמי חלבון אחרים בממברנה. הפרוטוקול שלנו מדגים כיצד ניתן להשתמש בטומוגרפיה קריו אלקטרונים כדי לקבוע את המבנה והארגון של קומפלקסים חלבונים בתוך הממברנה המיטוכונדריאלית הפנימית. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לקבוע את המבנה והארגון של חלבונים אחרים הקשורים לממברנה בתוך תאים תאיים שונים.

הכנת דגימה היא המפתח לרכישת תרמוגרמות טובות. הרשת הקפואה חייבת להכיל עיניים זגוגיות מושלמות בעובי של 70 עד 150 ננומטר. בדרך כלל אנו מסננים חמש עד שש רשתות עד שאתה מוצא אזור בעובי קרח ואיכות דגימה אופטימליים.

לאיסוף גרם, מיקרוסקופ אלקטרונים שידור של 300 קילו-וולט עם שלב קריו ייעודי ומסנן אנרגיה ומצלמה עם גלאי אלקטרונים ישיר הוא הטוב ביותר, אך ניתן להשתמש גם במכשיר של 200 קילו-וולט עם שלב קריו כניסה צדדית ומצלמת CCD. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין רשת cry m. אסוף סדרת הטיה, שחזר תרמוגרמה וחשב ממוצע תת-טומו.

אלו הן המיומנויות הבסיסיות הנדרשות כדי לחקור כיצד ארגון החלבונים בתא משפיע על יכולתו של התא לבצע פונקציות ביולוגיות כגון סינתזת TP יעילה. אל תשכח שעבודה עם חנקן נוזלי ונוזל איתן יכולה להיות מסוכנת מאוד ויש להרכיב משקפי בטיחות וכפפות בכל עת.