הדמיה באמצעות המקרה גלמי של Melanogaster דרוזופילה

בסרטון זה נדגים טכניקות חדשות המאפשרות לנו לדמות pube של Drosophila Melanogaster מבלי לפגוע בשלמות המבנית של הפואר. על ידי שמירה על מארז האישון שלם, אנו ממזערים את השפעת ההדמיה על התפתחות הגולם ויכולת הקיום שלו. אנו משתמשים במיקרוסקופ קונפוקלי סורק תהודה של 8,000 הרץ לצורך הדמיה.

חשוב לציין, מהירות הסריקה המהירה מאוד והרגישות הגבוהה של מיקרוסקופ זה מפחיתה מאוד את ההלבנה, ומאפשרת תקופות ממושכות של תצפית. בשיטה זו, הצלחנו לדמיין מגוון תהליכים ביולוגיים של תאים, כולל התנהגות, פופ, פודיה, מורפוגנזה, פגוציטוזיס ומיטוזה. בטכניקה זו אנו יכולים לצפות באירועים באתרם לפרקי זמן ממושכים מבלי לפגוע באורגניזם.

התצפיות המתקבלות משיטות אלו יכולות לשמש להבנת מגוון תופעות ביולוגיות בשלב בלתי נגיש יחסית זה של התפתחות דרוזופילה, אנשי הגבינה, השלב המתאים, אנו בוחנים אותם בעודנו בבקבוקון מחפשים אינדיקטורים מרכזיים בשלב ההתפתחותי לחקר חלוקות תאים, אנו מחפשים פיפה שהסיטו את ראשם, אבל עדיין לא מראים חבילות ירוקות ומקוניום והבטן הגבית. אנשים משוחררים על ידי נגיעה במארז ההצצה עם מברשת לחה המעבירה מים כדי להמיס את דבק הרוק. לאחר מכן משחררים את פיפה בעדינות, מרימים אותם בעזרת המכחול ומעבירים לצלחת פטרי המכילה מים.

האנשים נשטפים היטב במים כדי לנקות את המארז ממזון או פסולת. לאחר מכן אנו מסדרים אותם, הצד הגבי כלפי מעלה כדי לוודא שהם בשלב הנכון. טפל בהם בזהירות.

הם יכולים למות בקלות אם אפילו נוצר חור קטן בצינור. פרטים נבחרים מונחים בקפידה ותחתית זכוכית צלחת פטרי ומכוונים אותה כך שתכונת העניין תהיה הקרובה ביותר להחלקת הכיסוי ומקבילה ככל האפשר לפני השטח. כדי להתבונן בכנף האישון, אנו תומכים את הגולם כנגד התמיכה, כגון אורך דק, חימר הדוגמנות או שעווה דנטלית, ומוודאים שהם לא זזים לאחר ההתמצאות.

לאחר מכן אנו מזמינים את המנה כדי לוודא שתכונת העניין נראית לעין ומכוונת היטב. בדרך כלל, הרכיב מספר פיפה בבת אחת הגן מפני האפשרות שאחד מהם אינו מבטא את החלבון הפלואורסצנטי או אינו בשלב הרצוי. לאחר שכל הפיפה מותקנת ומכוונת כראוי, אנו נוגעים בבסיס של כל פיפה עם מכחול לחה בדיוד דילין גליקול, הר לא רעיל התואם את מקדם השבירה של שמן טהור או מים מדוללים במים.

זה משרת מטרה כפולה של הפחתת עקיפה ממארז האישון והפחתת שבירה של טבילה נעשה שימוש בעדשות לאחר שהרכבנו וסידרנו כראוי את הגור. אנחנו עוברים למיקרוסקופ הקונפוקלי של סריקת הלייזר. אנו משתמשים בהפוך כמו SP 5 המצויד בסורק תהודה.

הצלחת מותקנת על המיקרוסקופ ואנו מאתרים את הפוט באמצעות האופטיקה של המיקרוסקופ. לאחר מציאת הגולם, התאימו את המיקוד כך שהתכונה המעניינת במקרה זה, הכנף תהיה גלויה. אנו מזהים את הכנף על ידי נוכחות של אלמנט קנה הנשימה גדול שעובר דרך אמצע הכנף.

כאשר אזור העניין מזוהה והמיקרוסקופ ממוקד, אנו מגיעים למטרה היבשה פי 20. לאחר אישור המיקוד מחדש, אנו מעבירים את המיקרוסקופ למצב קונפוקלי. אנו מתאימים את הפרמטרים של הקונפקל כדי למזער את החשיפה לאור.

עוצמת האור נשמרת מתחת ל-10% שידור. כדי למקסם את הבהירות, אנו פותחים את חור הסיכה ל-130 מיקרון עבור עדשת 20 x עם azuma four ומגדירים את הרווח ל-900 וולט. בעזרת הגדרות אלה אנו יכולים לדמיין במשך שעות מבלי להשפיע על אורך המרווח המיטוטי או על בריאות החיה.

לאחר מכן, אנו מגדירים את מספר קטעי Z ואת תדירות צילום התמונה כך שיתאימו למאפייני התופעה הביולוגית שאנו מנסים לצפות, למשל, מרווחי הדמיה של דקה אחת לוכדים מספיק את כל התכונות החשובות של חלוקת התא. אבל מרווחים של שלוש שניות חשובים כדי להתבונן בדינמיקה של פילו פודיה. התמקד למעלה ולמטה דרך האפיתל עד שתמצא את התכונה הרצויה.

במידת הצורך, השתמש במיקרוסקופ ובמצב XYZT כדי לאסוף ערימות Z לאורך זמן. משך הסרטים הוא גם פרמטר חשוב. יצרנו סרטונים באורך של עד 10 שעות.

כאשר מדמים מספר מולקולות פלואורסצנטיות בו זמנית, אנו מנסים לקצר את משך ההדמיה הכולל. באופן עקרוני, כל תג פלואורסצנטי גורם לייצור גדול יותר של מיני חמצן תגובתיים. בפועל, לא ראינו קטלניות הקשורה להדמיית קווים מסומנים בשלוש תוויות במשך שעה או פחות.

אם רקמת המטרה או התהליך קטנים מכחמישה מיקרון, סביר להניח שתצטרך להשתמש בעדשת טבילה. זכור כי עדשות אלו ממקדות את הלייזר לנקודה עדינה יותר, ובכך מגבירות את עוצמת האור, ועליך להתאים את פרמטרי ההדמיה בהתאם, סרטים מועברים מהמיקרוסקופ הקונפוקלי למחשב המפעיל את תוכנית ניתוח התמונות של הכביש המהיר, פיג'י. עם פיג'י, אנו יכולים לפתוח, למדוד ולתפעל תכונות בתמונות הרב-ממדיות שנוצרו על ידי הקונפוקל.

שיטת הדמיה זו אפשרה לנו לחקור את מיקום הגרעינים ביחס למחזור התא. באגף האישון, אספנו ערימת Z מהחלק העליון של האפיתל לתחתית הגרעינים הנצפים ביותר במרווחי זמן של דקה אחת. בסרטים אלה, ראינו רק חלוקות המתרחשות בחלקים הקונפוקליים האפיקליים המוצגים כאן משמאל, החלקים הבסיסיים יותר המוצגים מימין חושפים את חזרתם של גרעינים שחולקו לאחרונה מהשכבה השטחית, אך אינם מכילים מאפיינים אחרים של מיטוזה.

נתונים אלה מראים כי אפיתל כנף האישון המתחלק במהירות דומה לדיסקת כנף הזחל ול-MedOne אחרים. האפיתל בגרעינים אלה נע אל פני השטח האפיקליים של האפיתל במהלך המיטוזה. למרות המשותף הזה, אפיתל כנף האישון הוא יחסית לא מרובד כאשר רוב הגרעינים קרובים מאוד לשכבה העליונה.

שיטות קודמות להדמיית דרוזופילה בשלבים מוקדמים של התפתחות האישון נפגעו, בעיקר בשל ניסיונות להסיר או לחדור למארז האישון. אנו מתארים כאן גישה חדשה המאפשרת לנו לדמיין תאים בוגרים במהלך ההתפתחות מבלי להשפיע על כדאיות האורגניזם. השיטה שלנו שונה מבחינה איכותית מאחרות בכך שהיא שומרת על מקרה האישון שלם לחלוטין.

השילוב של מיקרוסקופיה קונפוקלית עם סריקה תהודה מאפשר לנו לדמיין רקמות מתפתחות בטווח של 20 מיקרון ממארז האישון. המגבלות העיקריות בפתרון עומק הן מרחק העבודה של העדשה ופיזור מהמארז ברקמה. עם זאת, השיטה שלנו מאפשרת לנו לפתור תכונות של תאי האפיתל מהקודקוד לבסיס.

השתמשנו בטכניקה זו כדי להתבונן במיטוזה, פילו, פודיה, מורפוגנזה ופגוציטוזיס. בנוסף לכך, חקרנו עד שלושה תגים פלואורסצנטיים נפרדים בדגימה אחת. אנו מאמינים שהגישות המתוארות כאן פתחו את התקופה המוקדמת של התפתחות האישונים עד לחקר שכבות האפיתל החיצוניות ביותר.

בשילוב עם כוחה של הגנטיקה הגיאלית, נגישות זו עשויה לשפר עוד יותר את הבנתנו את התפתחות המבוגרים.