בדיקה

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לספק בדיקת מבוך Y פשוטה לבחינת חוש הריח ב-Drosophila melanogaster. הדבר מושג תחילה על ידי הרעבת הזבובים למשך 16 עד 18 שעות, כדי להגביר את המוטיבציה שלהם לחקור סביבות חדשות עם גירויים נדיפים. השלב השני של הפרוצדורה הוא הרכבת מערך מבוך ה-Y המכיל את מקורות הריח על נייר סינון, כגון חומצה אצטית בממס לעומת ממס לבדו.

השלב השלישי הוא העברה מהירה ועדינה של הזבובים למבחנה המכילה את המצע. לאחר מספר שעות, השלב הסופי הוא רישום מיקומם של הזבובים במבוך. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות תגובה לחומר הריח על סמך הנתונים שהתקבלו ממבוך ה-Y.

העלנו לראשונה את הרעיון לשיטה זו כאשר החלטנו לפתח שיטה פשוטה וזולה לבדיקת התגובה הריחית של זבובים. יתרון של טכניקה זו על פני אפשרויות אחרות הוא שהיא מאפשרת לזבובים לקבל החלטה ללא לחץ רב מדי. את הפרוצדורה תדגים מייגן סימון, סטודנטית לדוקטורט מהמעבדה שלי. עבור פרוטוקול זה, הכינו זן זבובים שונה (isogenized) עם פנוטיפים התנהגותיים יציבים וחזקים. כל מלאי כזה ישמש כביקורת ייחוס לבדיקה הריחית; עבור כל זן גנטי שישמש בניסוי, בצעו הכלאה חוזרת (back cross) של הזן אל זן הייחוס למשך חמישה דורות.

הצמידו נקבות בודדות מזן ניסויי למספר זכרים איזוגניים עבור כל הצלבה חוזרת. עבור ניסויי ריח, תחזקו את ה-drosophila על מצע קמח תירס סטנדרטי עם אנטיביוטיקה תחת מחזור אור של 1212, ובטמפרטורה של 25 °C.

יש לבצע את הניסויים תמיד בטמפרטורה של 25 °C ותחת תאורה בספקטרום האדום הרחוק, שאינו נראה עבור Drosophila. כמו כן, חייבת להיות אפשרות לאוורר את החדר באופן מלא בין הניסויים לפני ביצוע הבדיקה בבוקר למחרת. בסוף היום, העבירו קבוצות של 10 עד 20 קווי ניסוי לבקבוקוני זכוכית עם לחות המסופקת באמצעות מגבת רטובה.

יש לבחון את הזבובים בתוך 16 עד 18 שעות, אחרת הם עלולים למות כתוצאה מהתייבשות או הרעבה למחרת. הרכיבו את מבוך ה-Y. התחילו בחיבור מחבר בצורת Y לשתי מבחנות זכוכית באמצעות מחברי ספוג עם קצות פיפטה גזוזים, המהווים את התעלות; צורתם המצומצמת הופכת מעברים אלו למעברים חד-כיווניים.

הענף השלישי של ה-Y מחובר לצינור טעינה העשוי מהחלק הרחב של קצה פיפט, והוא מאפשר מעבר מבקבוקון הטעינה אל נקודת הבחירה של המבוך. מעבר לכל אחת מהמנהרות המצטמצמות נמצא בקבוקון זכוכית, שאחד מהם חייב להיות טעון בחומר ריח. אלו הם בולוסים של 40 µL שספוגים בריבועי נייר סופג בגודל 28 mm.

יש להחליט באופן אקראי איזה מהשניים מכיל את חומר הריח כדי לבצע את הבדיקה ראשונה. קהלו את הזבובים על קרח למשך זמן קצר, כדי להאט אותם. פעולה זו צריכה להתבצע תחת אור אדום רחוק מנורות LED ובטמפרטורה של 25 °C; העבירו בעדינות את קבוצת הזבובים אל מבחורת הטעינה וטענו את מבוך ה-Y בזבובים למבחן.

אין להשתמש בהרדמה בגז. קריטי להעביר את הזבובים לבקבוק הטעינה במהירות ובזהירות. זהו למעשה השלב הקשה ביותר בניסוי זה, כיוון שעל הזבובים להתעורר במהירות לפני שיתפשטו זבובים אחרים במסת ה-Y.

יש לאפשר לזבובים לחקור את המבוך במשך 24 שעות, כך שמספר מרבי של זבובים יעברו לאחד משני המבחנות הזכוכית. מספר הזבובים הנוכחים במבחנות השונות משמש לחישוב המדד הריחני (olfactory index). יש להחיל שיטות סטטיסטיות סטנדרטיות על ערך זה, שנאסף מהתנהגותם של עד 10 זבובים.

אם 10 קבוצות זבובים אינן מספקות תוצאות עקביות, ניתן לבצע את הניסויים עם 20 קבוצות זבובים. כדי לנקות את רכיבי המבוך, השרו אותם כשהם מפורקים ב-RBS 35 MD למשך לילה. לאחר מכן שטפו אותם במי ברז ובשטיפה סופית ב-DI water לפני ייבוש באוויר.

תגובות סטנדרטיות לחומר ריח. שימוש במבוך Y כולל משיכה, אדישות או הימנעות. לדוגמה, זבובים מסוג cantons נמנעים באופן חזק מ-10% acetic acid, בעוד שהם אינם נמנעים מ-10% pheno acetic acid.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי בדיקת גל זו מייצגת סביבה מלאכותית עבור הזבובים. ניתן להשתמש בפרוצדורה זו כשיטה מקדימה, ולאחריה ניתן לבצע בדיקות זירה (arena) או בדיקות פנימיות כדי לאשש את התגובות הריחניות של הזבובים בתנאים השונים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבחון בפשטות תגובות ריחניות של *Drosophila melanogaster* באמצעות בדיקת ה-SW.