דור של Myospheres מhESCs על ידי תכנות מחדש אפיגנטיים

כאן אנו מתארים פרוטוקול המבוסס על תכנות מחדש אפיגנטיים של תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) לכיוון יצירת אוכלוסייה הומוגנית של אבות שלד שריר כי בתנאי תרבות המתירנית יצירת צבירים תלת ממדיים של myofibers ההתכווצות (myospheres), אשר מסכמים תכונות ביולוגיות של אדם שרירי שלד.

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור כדורי מיוס. מבנים דמויי EB המורכבים מתאי שריר שלד מתאי גזע עובריים אנושיים. זה מושג על ידי תכנות מחדש של התאים על ידי זיהום לנטי-ויראלי של Baf 60 C.השלב השני של ההליך הוא להדביק את אותם תאים בנגיף שני, myo D lentivirus.

לאחר מכן התאים הנגועים מושרים ליצור אגרגטים דמויי EB למשך חמישה ימים במדיום תרבית מבוסס סרום. לאחר מכן מוחלף מדיום ה-EB במדיום התמיינות חופשי בסרום, והאגרגטים גדלים במשך שבועיים נוספים לכדורי מיוס. בסופו של דבר, אימונופלואורסצנציה משמשת להמחשת קטעים של אגרגטים משובצים ב-OCT.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא ניוון התפוקה הגבוהה של תאי שריר השלד אשר נגזר כאחד מאבות מזנכימליים או מזודרמליים אינו דורש מיון עובדות ולכן תואם למערכת תרבותית תלת מימדית יום לפני ההדבקה בתאי גזע עובריים אנושיים בשש צלחות באר הוסף שיבוט והתאוששות של תאי גזע עובריים אנושיים למדיום ב 1000 x לריכוז סופי של שני מיקרומולר למחרת יום להדביק את תאי הגזע העובריים האנושיים עם אמבט טיטר גבוה 60 CGFP lentivirus. ראשית יש לפרק באר תאים לתרחיף תא בודד על ידי הוספת מיליליטר אחד של טריפ ודגירה של הצלחת למשך חמש דקות. לאחר מכן אוספים ומעבירים את המתלה לצינור של 15 מיליליטר.

הוסף תשעה מיליליטר מהמדיום המוכן וסובב את התאים כלפי מטה ב -1, 200 סל"ד למשך חמש דקות תוך המתנה למיליליטר של הר SIR, אחד. הוסף מוח פולי בריכוז סופי של שישה מיקרוגרם למיליליטר ותוסף התאוששות תאי גזע עובריים אנושיים בשתי מיקרומולר.

לאחר מכן השעו מחדש את התאים בתמיסה זו והעבירו אותם לבאר אחת של צלחת חיבור נמוכה של שש בארות. עכשיו תוסיפו את וירוס האמבטיה המרוכז 60 C בריבוי הדבקה של 100 מיליון. דגרו על הצלחת למשך שלוש שעות עם הנגיף.

לאחר מכן אוספים את התאים ומחלקים אותם לשתי בארות צלחת מצופות מטריג'ל. לכל צלחת, הוסף שני מיליליטר mt, SIR, אחד עם שני תוספי מיקרו-מולאר, ולאחר מכן דגר על התאים למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס. למחרת, החלף את המדיה במדיה טרייה.

התאים ייראו כאילו כבר התגבשו לאחר 48 שעות מתחילת הזיהום. בדוק את הקרינה כדי להעריך את יעילות הזיהום. המשך את שינויי המדיה היומיים עד שהתאים מגיעים ל-80% מפגש, ואז נתק את התאים ואת נגיף מיו D לתאים באמצעות אותו פרוטוקול.

שמור על התאים הנגועים עם שינויים יומיים בינוניים עד שהם מגיעים למפגש של 80% יום לפני נקודת גידול זו. לוחית MES על צלחות מצופות מטריג'ל ב-1000 תאים לסנטימטר רבוע כדי להעביר את התאים הנגועים לצלחת ME'S. למחרת.

השתמש ב-ALI כדי לנתק אותם ולהעביר את התאים לצינור של 15 מיליליטר לתאים. הוסף תשעה מיליליטר של מדיום תאי גזע עובריים אנושיים וצנטריפוגה למטה. הוסף 1, 200 סל"ד למשך חמש דקות.

Resus, השעו את התאים הגלולים בשישה מיליליטר טריים של מדיום תאי גזע עובריים אנושיים. כעת הסר את המדיום משתי צלחות של mes והוסף אליהם את התאים הנגועים. דגירה על התאים למשך מספר ימים.

פעם אחת, הוסף 80% מפגש. הסר את כל המדיה והוסף מיליליטר קולגנאז ארבע. הוסף מיליגרם אחד למיליליטר לאחר חמש דקות בקולגנאז ב-37 מעלות צלזיוס.

החלף את הקולגנאז במיליליטר של מדיום תאי גזע עובריים אנושיים. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ דיסקציה, מגרדים את המושבות באמצעות קצה פיפטה של 10 מיליליטר, מעבירים את המושבות לצינור של 15 מיליליטר ומאפשרים להן להתייצב. לאחר שלוש דקות, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את התאים במדיום תאי גזע עובריים אנושיים.

לאחר מכן צלחת את התאים ביחס של אחד לארבעה ללוחות מת'. התאים הנגועים צריכים להיות במספר גבוה ויצרו מושבות באיכות טובה להליך זה. מוציאים את המדיה מכל באר ומוסיפים מיליליטר קולגנאז. ארבע.

הוסף מיליגרם אחד לריכוז מיליליטר כמו קודם, ואת תגובת הקולגנאז לאחר חמש דקות על ידי החלפתו במדיום EB. ואז השתמש במהירות במיקרוסקופ כדי לגרד את המושבות. בעזרת קצה פיפטה של 10 מיליליטר ניתן לפרק את התאים לגושי תאים קטנים.

אספו את האגרגטים הללו לתוך שפופרת של 15 מיליליטר, ולאחר שהם התייצבו במשך כשלוש דקות, הסירו את הסופרנטנט, השעו מחדש את התאים בשלושה מיליליטר של מדיום EB והעבירו הכל לבאר אחת של צלחת חיבור נמוכה של שש בארות. דגרו את הצלחת הזו למשך הלילה למחרת. בדוק אם יש בהם נתחי מושבה גדולים.

אם יימצאו כאלה. שברו אותם על ידי הזרמתם דרך פיפטה של חמישה מיליליטר כמה פעמים. אם יש הרבה תאים בודדים צפים, אספו אגרגטים על ידי משקעים והחליפו במדיום EB טרי.

החלף את המדיה כל יומיים לאחר חמישה ימי תרבית. אסוף את אגרגטים של התאים ושטוף אותם פעם אחת עם שני מיליליטר PBS המאפשר לתאים לשקוע תחת כוח משיכה רגיל. לאחר מכן החלף את ה-PBS בשלושה מיליליטר של מדיום DM והחזיר את התאים לאותה בארות צלחת במהלך 15 ימי התרבית הבאים.

החלף את המדיום כל שלושה ימים. במהלך תקופה זו, ייווצרו מזוספרות. תאי גזע עובריים אנושיים נדבקו באמבט 60 C הנושא פלואורסצנטיות GFP.

לאחר 72 שעות, התאים מוינו עובדות. תאים המבטאים BAF 60 C גודלו לכ-75% שטף ולאחר מכן נדבקו ב-myo D lentivirus. ביטוי גנים אקסוגני זוהה בתאים הנגועים על ידי PCR כמותי בזמן אמת.

נבדק הביטוי וההתפלגות ברמת החלבון. ה-GFP הבא מתאים לביטוי baf 60 C, ונוגדני מיו D שימשו לבדיקת ביטוי מיו D. 15 יום לאחר שתאי הגזע העובריים האנושיים החלו להיווצר אגרגטים דמויי EB.

חלק מכדורי המיוס הוטמעו בתרכובת OCT וחתכו את הקטע הצבוע חיובי עבור סמני שרשרת כבדים מיוגניים ומיוזין. החל מהיום העשירי, ניתן היה לצפות בהתכווצות ספורדית בכדורי המיוס. חלק מכדורי המיוס לבשו צורות שונות או יוצאות דופן, אולי בגלל היתוך בין כדורי מיוס.

טכניקה זו תקדם את המחקר בתחום מידול וטיפול במחלות מכיוון שניתן ליצור כדורי מיו מתאי גזע פלוריפוטנטיים של חולים הסובלים מהפרעות שרירים שונות. מסיבה זו, כדורי מיו מספקים מודל מחלה במהדורה המתאים לניקוי תרופות ופתוגנזה של מחלות.