Name: דור של Myospheres מhESCs על ידי תכנות מחדש אפיגנטיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: למד ליצור מיוספירות מתאי גזע עובריים אנושיים באמצעות תכנות מחדש אפיגנטי. הפרוטוקול מייצר תאי שריר שלד מכווצים ללא מיון FACS לחקר ביולוגיית שריר ורפואה רגנרטיבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

PLP הוא חוקר עמית במרכז לבריאות המחקר של סנפורד לילדים. עבודה זו נתמכה על ידי המענקים הבאים כדי PLP: R01AR056712, R01AR052779 וAR061303 P30 מהמכון הלאומי לבריאות / המכון לאומי של דלקת מפרקים ושלד ושרירים ומחלות עור (NIAMS), מד&quot;א ואת הפרס לחקר בריאות ילדי סנפורד. עבודה זו יש נהנתה בחלק ממימון מחקר מתכנית המסגרת השביעית של הקהילה האירופית בפרויקט FP7-בריאות - 2009 ENDOSTEM 241,440 (הפעלה של תאי כלי דם הקשורים גזע ותאי גזע שריר לתיקון והתחזוקה של רקמת שריר) SA נתמכה על ידי. מלגת CIRM.

1. זיהום של hESCs פרוטוקול זה דורש BAF60C גבוה lentiviruses כייל הקידוד וMyoD 13. מבנים אלה זמינים על פי דרישה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המלצות לפני שמתחיל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להבטיח את היעילות גבוהה של הזיהום, hESCs צלחת לזיהום בתנאים ללא מזין (איור 2 א) כדי לחסל את המתחרים סלולריים בעת הספיגה נגיפית. ואכן, MEFs קל יותר לשמצה להדביק לעומת hESCs ומוכשרים לגיור בתיווך MyoD. לפיכך, ביטול MEFs מתרבויות hESC מגדיל את שיעור הזיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מומלץ לי lentiviruses כייל גבוה כדי להבטיח יעילות גבוהה של זיהום. אפשרויות כדי לשפר את היעילות של זיהום נדונות בסעיף &quot;בדיקת זיהום&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הצלחות מצופים matrigel על ידי הוספת 1 מיליליטר של 1 מ&quot;ג / מיליליטר Matrigel בכל טוב ולהשאיר שעה לפחות 1 ב RT (או O / N אטום על 4 מעלות צלזיוסאם הכין היום קודם). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הליך זיהום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום לפני הזיהום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת תא שיבוט הס &amp; מוסף שחזור במדיום בדילול 1,000 X (2 ריכוז סופי מ&quot;מ). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 0 - זיהום עם BAF60C הערה: בצע את הזיהום של hESCs עם BAF60C הראשון ואחריו זיהום עם MyoD. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק גם צלחת 6 היטב של hESCs גדלה כמושבות 14 בהשעית תא בודד על ידי דגירה עם 1 מיליליטר של TrypLE 5 דקות ב37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת השעיה לצינור 15 מ&quot;ל, להוסיף 9 מיליליטר של מדיום hESC ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 1,200 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך צנטריפוגה, להכין את תערובת הזיהום בצינור נקי על ידי הוספת 1 מיליליטר של mTeSR1, polybrene (6 מ&quot;ג / מיליליטר) ותוספת תא הס שיבוט ושחזור (2 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות את התא גלולה (x 5 -1 10 6 תאים כ 5 x 10 מג אחדonfluent גם של hESCs) עם 1 מיליליטר של תערובת זיהום וצלחת על צלחת קובץ מצורף 6 גם נמוכה, מה שמונע מתאי שמירה על הפלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת BAF60C-IRES-GFP וירוס ב10 8 משרד הפנים ודגירה 3 שעות בחממה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את ההשעיה התא המכילה וירוסים ולחלק באופן שווה בשתי בארות מצופים matrigel. לאחר מכן להוסיף 2 מיליליטר של תא מוסף שיבוט ושחזור mTeSR1 + הס היטב כל אחד ולעזוב O / N בחממה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את המצע המכיל את הווירוס ולהחליף עם 2 מיליליטר של תא שיבוט mTeSR1and הס &amp; מוסף שחזור. תאים יתחילו להתנהל בכבדות, כפי שמוצג באיור 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Day2 - זיהום עם MyoD <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שימשיך לבדוק את מצב הקרינה של התאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לוודא שיש יעילות גבוהה של זיהום. אם לא, עיין בסעיף &quot;בדיקה להדביקיון &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם התאים הגיעו לפחות 80% ממפגש, פעל באופן הבא; אחרת לחכות ליום נוסף לפני שתמשיך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיום ולהוסיף 1 מיליליטר של מגיב TrypLE לנתק את התאים. דגירה 5 דקות ב37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פעולה כfrom1.2.2.2 תאר - 1.2.2.6 הוספת וירוס MyoD ב10 8 משרד הפנים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את המצע המכיל את הווירוס ולהחליף עם 2 מיליליטר של תא שיבוט mTeSR1and הס &amp; מוסף שחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MEFs צלחת על matrigel מצופה צלחות ב2.5 x 10 5/2 סנטימטר ליום המחרת כדי לאפשר התפשטות של התאים הנגועים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 4 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיום ולהוסיף 1 מיליליטר של מגיב TrypLE לנתק את התאים. דגירה 5 דקות ב37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את התאים בצינור בז 15 מ&quot;ל, להוסיף 9 מיליליטר של מדיום hESC ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 1,200 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Rסר supernatant מחדש להשעות ב6 מיליליטר של מדיום hESC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא את המדיה מצלחת MEFs המכיל 6 היטב וhESCs צלחת ב1:02 יחס מפוצל, מחלק 3 מיליליטר לכל MEFs המכיל היטב. עצה! כאשר המושבות להגיע למפגש, חלק מהבארות של תאי MyoD/BAF60C-infected אפשר להקפיא בחנקן נוזלי כמניית מילואים. מדיום הקפאה כולל 90% מKOSR וDMSO 10% בתוספת 2 תאי שיבוט מ&quot;מ הס &amp; מוסף שחזור. הבארות הנותרות ניתן לאחר מכן נחשפו לפרוטוקול הבידול - ראו בהמשך לתיאור. אם יש צורך יותר תאים לייצר יותר myospheres, יכול להיות מופץ hESCs הנגוע נוסף באופן הבא: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מדיום דגירה עם 1 מיליליטר של 1 מ&quot;ג / IV collagenase מיליליטר במשך 5 דקות ב37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר IV collagenase ולהוסיף 1 מיליליטר של מדיום hESC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתיחה לגרד את המושבות עם טיפ 10 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את גושי colonies בצינור 15 מ&quot;ל ולאפשר למשקעים במשך 3 דקות. ואז להסיר את supernatant, resuspend במדיום hESC וצלחת על צלחות MEFs באמצעות 01:04 יחס. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בבדיקה זיהום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד מתפשט התאים, מומלץ לצלחת התאים הנגועים בקנה מידה קטנה יותר למסוק לניתוח RNA ולבצע ניתוח ביטוי חלבון על ידי immunofluorescence כדי לבדוק סמנים ביולוגיים המשקפים את המצב ביולוגי הנכון בכל שלב (ראה תוצאות נציג). לlentiviruses גבוה כייל את אחוז הצפוי התאים נגועים צריך להיות לפחות 80%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח יעילות גבוהה, יכולים להיות שונה הווקטורים lentiviral, מציגים סמן בחירת ניאון ו / או עמידות לאנטיביוטיקה. פלסמיד lentiviral להביע BAF60C גם נושא הקרינה ה-GFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיון hESCs עבור סמן פלואורסצנטי. במקרה של יעילות הנמוכה של זיהום מומלץ להשתמש בקרינהתאי ctivated מיון (FACS-מיון) להעשרה לתאים לבטא וירוס BAF60C ולאחר מכן להדביק את התאים בוירוס MyoD גבוה כייל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת תא שיבוט הס &amp; מוסף שחזור במדיום היום לפני המיון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום המיון, לנתק את התאים על ידי TrypLE (כפי שמתואר ביום 0) ו resuspend התאים בסרום KO החלפה בתוספת תא הס מוסף שיבוט ושחזור בFACS-צינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של המיון, לאסוף את התאים בסרום החלפת KO וצלחת על צלחות MEFs הוספת תא שיבוט הס &amp; מוסף שחזור. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. אינדוקציה והתמיינות כמו EB <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הליך אינדוקציה והתמיינות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 0 - אינדוקציה EB <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא, לפני שמתחיל בידול מBAF60C/Myod-infected hESCs, יש מספר גבוה של מושבות בבאר (איור 2 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל r כןסר בינוני, לשטוף עם PBS ולהוסיף 1 מיליליטר של 1 מ&quot;ג / IV collagenase מיליליטר. דגירה במשך 5 דקות ב37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר collagenase ולהוסיף 1 מיליליטר של EB בינונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתיחה במהירות מכאנית לנתק את המושבות ל400-800 אגרגטים תא על ידי גירוד עם טיפ 10 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הגושים של מושבות בצינור 15 מ&quot;ל ולאפשר למשקעים במשך 3 דקות. הסר את supernatant, מחדש להשעות ב 3 מיליליטר של EB בינונית ולהעביר את ההשעיה התא היטב אחד 6 גם נמוך צלחת קובץ מצורף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את גודל המושבות והמוות של התאים לפני שתמשיך. אם גושים גדולים נמצאים, לשבור אותם בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה עם טפטפת 5 מ&quot;ל, 3-4 פעמים. אם המוות של התאים הוא גבוה מאוד (תאים רבים צפים ופסולת) להחליף את המדיום על ידי איסוף אגרגטים בצינור 15 מ&quot;ל על ידי כוח הכבידה וצלחת אותם עם 3 מיליליטר של מדיום EB הטרי, אחרת ימשיכו כדלקמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1.5מיליליטר של מדיום EB הטרי בבארות </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את המדיום על ידי איסוף אגרגטים מהבארות בצינור 15 מ&quot;ל. תן להם להתיישב למשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant, להחליף עם 3 מיליליטר של מדיום EB הטרי ולהפיץ מחדש באותו בארות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1.5 מיליליטר של מדיום EB הטרי בבארות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 4 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך כמתואר ב&quot; יום 2 &quot;. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 5 - בידול myogenic של אשכולות כמו EB (איור 2 ד). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף המצרפים כפי שמתואר ב2.1.3.1 ולשטוף פעם עם 2 מיליליטר של PBS; לאפשר מצטבר למשקעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS ולהוסיף 3 מיליליטר של מדיום DM; צלחת באותו בארות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 6 - יום 20 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מD6 לD20 להחליף בינוני עם בינוני טרי כל 3 ימים. myospheres נציג מוצג בFigure 2E. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידול myosphere בדיקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שתמשיך הלאה, מומלץ לבדוק את היעילות של בידול myogenic בתוך myospheres על ידי ביצוע חתכים של myospheres המשובץ במתחם אוקטובר, כפי שתואר בפרוטוקול יופיטר קודם 12. לבצע מכתים immunofluorescence עבור סמני myogenic כגון myognenin (F5D שיבוט, DSHB) ושרשרת שרירן כבדה (MF20 שיבוט, DSHB) (ראה תוצאות נציג). עצה! כדי להצליח עם הצביעה לmyogenin על סעיפי EB זה קריטי לבצע אחזור אנטיגן על ידי טיפול עם נתרן גופרתי dodecyl (SDS) 0.5% למשך 5 דקות. בנוסף, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה לצביעה הכפולה באמצעות נוגדני F5D וMF20. </li></ol></li></ol> 3. מתכוני מדיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני ESC DMEM-F12 1 מ&quot;מ L-גלוטמין 20% סר נוקאממ בינוני החלפה (KOSR) 0.1 חומצות אמינו חיוניות מ&quot;מ (NEAA) 50 פניצילין U / ml / סטרפטומיצין (עט / סטרפטוקוקוס) 0.1 מ&quot;מ בטא mercaptoethanol 8 ng / גורם גדילת מיליליטר בסיסי פיברובלסטים (bFGF) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> EB בינונית DMEM F12 1 מ&quot;מ L-גלוטמין 15% FBS 5% סרום סוסים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני DM DMEF F12 מוסף שלה 1X הנוזלי מדיה מוסף 1X N-2 </li></ol>

<ol><li>Darabi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+skeletal+muscle+regeneration+from+differentiating+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Functional skeletal muscle regeneration from differentiating embryonic stem cells.</a> Nat Med. 14, 134-143 (2008).</li>
<li>Darabi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ES-+and+iPS-derived+myogenic+progenitors+restore+DYSTROPHIN+and+improve+contractility+upon+transplantation+in+dystrophic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human ES- and iPS-derived myogenic progenitors restore DYSTROPHIN and improve contractility upon transplantation in dystrophic mice.</a> Cell Stem Cell. 10, 610-619 (2012).</li>
<li>Iacovino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+cassette+exchange%3A+a+rapid+and+efficient+system+enabling+conditional+gene+expression+in+embryonic+stem+and+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Inducible cassette exchange: a rapid and efficient system enabling conditional gene expression in embryonic stem and primary cells.</a> Stem Cells. 29, 1580-1588 (2011).</li>
<li>Barberi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+engraftable+skeletal+myoblasts+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Derivation of engraftable skeletal myoblasts from human embryonic stem cells.</a> Nat Med. 13, 642-648 (2007).</li>
<li>Goudenege, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myoblasts+derived+from+normal+hESCs+and+dystrophic+hiPSCs+efficiently+fuse+with+existing+muscle+fibers+following+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Myoblasts derived from normal hESCs and dystrophic hiPSCs efficiently fuse with existing muscle fibers following transplantation.</a> Mol Ther. 11, 2153-2167 (2012).</li>
<li>Forcales, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal-dependent+incorporation+of+MyoD-BAF60c+into+Brg1-based+SWI%2FSNF+chromatin-remodelling+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex.</a> Embo J. 31, 301-316 (2012).</li>
<li>Albini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+reprogramming+of+human+embryonic+stem+cells+into+skeletal+muscle+cells+and+generation+of+contractile+myospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells into skeletal muscle cells and generation of contractile myospheres.</a> Cell Rep. 3, 661-670 (2013).</li>
<li>Weintraub, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+muscle-specific+genes+in+pigment%2C+nerve%2C+fat%2C+liver%2C+and+fibroblast+cell+lines+by+forced+expression+of+MyoD%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 5434-5438 (1989).</li>
<li>Tapscott, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD1%3A+a+nuclear+phosphoprotein+requiring+a+Myc+homology+region+to+convert+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts.</a> Science. 242, 405-411 (1988).</li>
<li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51, 987-1000 (1987).</li>
<li>Ho, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+embryonic+stem+cell+chromatin+remodeling+complex%2C+esBAF%2C+is+essential+for+embryonic+stem+cell+self-renewal+and+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An embryonic stem cell chromatin remodeling complex, esBAF, is essential for embryonic stem cell self-renewal and pluripotency.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 5181-5186 (2009).</li>
<li>Gomes, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+pluripotent+stem+cells+by+using+cryosections+of+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of pluripotent stem cells by using cryosections of embryoid bodies.</a> J Vis Exp. (46), (2010).</li>
<li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).</li>
<li>Barcova, M., Campa, V. M., Mercola, M. Human embryonic stem cell cardiogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarcova%2C+M+%22Human+Stem+Cell+Manual%3A+a+Laboratory+Guide%22">Human Stem Cell Manual: a Laboratory Guide</a>. Loring, J. F., Wesselschmidt, R. L., Schwartz, P. H. , Elsevier/Academic Press. Amsterdam. 227-237 (2007).</li>
<li>Blum, R., Vethantham, V., Bowman, C., Rudnicki, M., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+enhancers+in+skeletal+muscle%3A+the+role+of+MyoD1%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of enhancers in skeletal muscle: the role of MyoD1.</a> Genes Dev. 26, 2763-2779 (2012).</li>
</ol>

יש לנו מה למסור.

הפרוטוקול המוצע כאן מתאר כיצד ליצור אשכולות תלת ממדיים של myofibers ההתכווצות (myospheres) ישירות מhESCs. יש האסטרטגיה המוצעת פוטנציאל חסר תקדים ויוצא דופן כדי לייצר את שרירי מיני בהשעיה שיכולה להיות מתאים כמו &quot;מחלה בצלחת&quot; מודל עבור שני מבחני מיון ומחקרים התפתחותיים. יתר על כן, השיטה לייצר myospheres מhESCs היא פשוטה ואינה דורשת כל צעד מיון FACS במהלך ההתמיינות, אשר בדרך כלל יש לו השפעה שלילית על התשואה של תאים התאוששו. חוץ מזה, הליך מיון במהלך ההתמיינות יפריע לצבירה מכיוון שהיא מרמזת ניתוק של EB לתוך תאים בודדים. השיטה המוצעת מבוססת על reprograming אפיגנטיים של hESCs עם גורמים ספציפיים, MyoD וBaAF60C, שאינם באים לידי ביטוי בתאי גזע עובריים pluripotent. MyoD וBAF60C לספק את ה החלבון המורכבת &quot;הליבה&quot;בסימני הלוקוסים הגנומי שממנו השעתוק ממשיך להפעיל את תכנית myogenic השלד. שני הגורמים מועברים לתאים בדרך של זיהומי lentiviral ולכן זה קריטי כדי להשיג את יעילות גבוהה של זיהום של שני הגורמים בכל התאים. זו יכולה להיות מושגת על ידי שימוש בוירוסי כייל גבוהים או וירוסי ניחן סמני בחירה. תנאי תרבות גם לשחק תפקיד חשוב באופטימיזציה של מידת בידול myogenic. אנו מציעים מבוססי פרוטוקול סרום בידול לבידול של MyoD/BAF60C להביע hESCs לתוך אשכולות של מבשרי myogenic, ואחריו דגירה במדיום מוגדר סרום ללא (המכיל אינסולין transferrin - ITS) כדי להשיג המרה של מבשרי myogenic לmyotubes שלד. עם זאת, זה אפשרי, כי תקשורת מוגדרת אחרת יכולה להשיג בידול myogenic שווה או טוב יותר. מגבלה הנוכחית של הפרוטוקול היא שהוא מסתמך על השימוש בסרום שור עוברי, אשר, מלבד להכילing חלבונים מן החי וחומרים רבים, מציג וריאציות הרבה להרבה. זה עלול לגרום ליעילות נמוכה יותר או ההטרוגניות של המרה myogenic בתוך myospheres. ראוי לציין, שלא כל המבנים דמויי-EB נגזרים מBAF60/MyoD-expressing hESCs הם myospheres; כלומר, חלקם מצרפים כמו EB לחלוטין המורכב של myofibers. מספר myospheres בדרך כלל נגזר מhESCs להביע BAF60C וMyoD יכול להשתנות 30-60% כפי שהוערך על ידי immunostaining על סעיפי EB שבוצעו בסוף הפרוטוקול (ראה תוצאות). גישת פוטנציאל להעשיר את המנה תרבות לmyospheres רק תהיה להשתמש כתב myogenic. זה יקל על השלכת האשכולות כמו EB באופן חלקי או לא מובחנים ובחירה רק myospheres. לבסוף, הבנה טובה יותר של המנגנונים שבבסיס הדרישות זמניות של הגורמים הציגו תהיה שימושית כדי לשפר את השיטה של ​​מסירה. לדוגמא, אם BAF60C וMyoD נדרשים רק עבור shזמן אורט &quot;בעיטה&quot; התאים בכיוון הנכון, שיטות המבוססות על משלוח mRNA שונה יכול להיות מיושמת. לעומת זאת, אם הגורמים נדרשים לזמן ארוך יותר לפני שהתאים לנצל החלבונים אנדוגניים שלהם, גישת episomal תהיה מומלצת לחסל את השונות והשפעות בלתי מבוקרות בשל האינטגרציה בגנום. לבסוף, נציין שזה חובה להביע BAF60C לפני או במקביל לMyoD (לא לאחר) על מנת להשיג גיור hESC לשרירי שלד. הדרישה לביטוי מוקדם של BAF60C ככל הנראה מסתמכת על תפקידה בהגדרה מראש הנוף אפיגנטיים להפצת הכרומטין MyoD נכונה דרך הגנום 6,15. ככזה, פרוטוקולי עתיד עשויים להיות משופרים על ידי תרכובות או מניפולציות אחרות שמקדמות ביטוי BAF60C בhESCs.

בגלל היכולת הייחודית שלהם לעצמית לחדש תוך שמירת pluripotency, תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) נחשבים משאב יקר ערך ברפואת רגנרטיבית. דור גזע אכלוס תא בתיווך של שרירים פגועים ותאי hESC או גזע pluripotent מושרה (iPSC) נגזר של שרירי שלד לדוגמנות מחלה במבחנה הם מטרות עיקריות של מחקרים שמטרתם איתור וטיפולי הבהרה בפתוגנזה של מחלות רבות התוקפת. עם זאת, מחקרים אלה כבר לערער על ידי ההתנגדות של hESCs להמיר לתאי שרירי שלד ועל ידי מיעוט מידע לגבי הרגולציה המולקולרית של hESC-מחויבות כלפי myogenesis שלד. ואכן, ניסיונות קודמים ליצור אבות שרירי שלד מhESCs גילו כי רק גוף embryoid progenies (EB) נגזרת או תאי mesenchymal מוסמך להפעיל myogenesis השלד הבא ביטוי מחוץ לרחם של מפעילי תעתיק (לדוגמא:PAX3 או Myf5) 1-3 או על ידי חשיפה לתנאי תרבות הספציפיות 4-5. הראינו בעבר כי רכיב SWI / SNF, BAF60C (המקודד על ידי SMARCD3), הוא מרכיב חיוני של מכונות תעתיק המאפשרת הפעלה בתיווך MyoD של לוקוסי שרירים ספציפיים 6. יש לנו גילינו לאחרונה כי ההיעדר סלקטיבית של BAF60C מקנה על hESCs ההתנגדות להפעלה בתיווך MyoD של myogenesis שלד 7 כי הוא ציין אחרת בBAF60C לבטא בתאים סומטיים 8-10, תהליך המכונות המרת myogenic כ. ביטוי מאולץ של BAF60C מאפשר MyoD להפעיל ישירות myogenesis השלד בhESCs, בתנאי תרבות ספציפיים, עם BAF60C וMyoD הטלת חתימה אפיגנטיים המתחייבת hESCs כלפי שושלת myogenic 7. ראוי לציין, ניתוח proteomic הקודם חשף את ההיעדר סלקטיבית של BAF60C, בין רכיבי SWI / SNF, ב11 ESCs. השתמשו בידע זה כדי להטיל מחויבות אפיגנטיים של hESCs על שושלת myogenic, מוביל את הדור של אוכלוסייה הומוגנית של myoblasts שלד שיכול להצטבר ליצירת התכווצות תלת ממדים מבנים (myospheres) כי שרירים פונקציונלי לחקות מיניאטורי שלד 7. אכן, השיטה של יצירת תאי אב שרירי שלד מhESCs מסתמכת על המחויבות אפיגנטיים של hESCs לשושלת myogenic, שהוא phenotypically סמויה עד תאים נחשפים לאותות בידול, כגון תא צבירה ותרבות במדיום התמיינות (ראה פרוטוקול ספציפי). אסטרטגיה זו מאפשרת הרחבה של אוכלוסייה הומוגנית של hESCs שepigenetically מחויבים לשושלת שרירי שלד ומתאימה להיווצרות myospheres התכווצות תלת ממדים כי לשחזר היסטולוגית ומאפיינים פונקציונליים של שלדשרירים. Myospheres מספק את ההוכחה הראשונה של שרירים מוקטנים לניצול ל&quot; מחלה בצלחת &quot;מודל של מחלות שרירים. כאשר נוצר מiPSCs המטופל נגזר, יש לי myospheres אלה הפוטנציאל לברר שאלות התפתחותיות ארוכי שנים ופתוגנזה של מחלות נדירות, בנוסף למציע פוטנציאל האדיר ככלי להקרנת תפוקה גבוהה של תרכובות טיפוליות. אנחנו גם לציין כי קריאת נתונים מיידיות אחד של ניתוח myosphere יכולים להיות מסופקים על ידי אימונוהיסטוכימיה על סעיפים, כפי שתוארו בפרוטוקול יופיטר על ידי גומז et al. 12

<table><tbody><tr><td>צלחת 6 בארות</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>צלחת חיבור נמוכה 6 בארות</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>GFR Matrigel</td><td>BD Biosciencies</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>MEFs (עצירת צמיחה)14</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Invitrogen</td><td>15-090-CV</td><td></td></tr><tr><td>KOSR</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>1 מ"מ L-גלוטמין (100X)</td><td>Invitrogen</td><td>35050-61</td><td></td></tr><tr><td>עט/סטרפטוקוקוס (100X)</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Invitrogen</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>NEAA (100X)</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>ITS תוסף מדיה נוזלית</td><td>Sigma</td><td>I3146</td><td></td></tr><tr><td>N2-supplement&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>Invitrogen</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>HyClone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>HS</td><td>Invitrogen</td><td>16050114</td><td></td></tr><tr><td><a href="https://www.stemgent.com/products/193">hES שיבוט תאים & תוסף התאוששות</a></td><td>Stemgent</td><td>01-0014-100</td><td></td></tr><tr><td>bfgf</td><td>Sigma</td><td>4114-TC</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MyoD</td><td>BD Biosciences</td><td>554130</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MyHC</td><td>DSHB</td><td>MF20</td><td></td></tr><tr><td>Anti-myogenin</td><td>DSHB</td><td>F5D</td><td></td></tr></tbody></table>

דור של myospheres מhescs על ידי תכנות מחדש אפיגנטיים

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

דור של אוכלוסייה הומוגנית ושפע של תאי שריר שלד מתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) הוא דרישה לטיפולים מבוססי תאים ול&quot; מחלה בצלחת &quot;מודל של מחלות neuromuscular אדם. מכשולים עיקריים, כגון שפע וההטרוגניות של האוכלוסייה של עניין, כמו גם חוסר פרוטוקולים להיווצרות של מבני התכווצות תלת ממדים נמוכים, הגבילו את היישומים של תאי גזע לטיפול בהפרעות התוקפת. יש לנו תוכנן פרוטוקול המתגבר על מגבלות אלה על ידי הכנסה מחוץ לרחם של גורמים שהוגדרו בhESCs - MyoD גורם נחישות השריר והכרומטין SWI / SNF שיפוץ BAF60C רכיב מורכב - כי הם מסוגלים לתכנת מחדש hESCs לתאי שרירי שלד. כאן אנו מתארים את הפרוטוקול מבוסס כדי ליצור myoblasts נגזר hESC ולקדם את האשכולות שלהם לתוך מבני tridimensional מיניאטורי (myospheres) שרירי שלד מיניאטורי פונקציונלי לחקות 7 </sup&gt;.

איור 1 א מציג סכמטי של הפרוטוקול מוצע כדי ליצור myospheres מhESCs. שלבים הקריטיים כדי לשלוט (מסומן על ידי החיצים) הם את היעילות של הזיהום בhESCs והמרת myogenic בתוך myospheres. בניסויים שלנו אנו מנצלים BAF60C קידוד וקטור lentiviral שנושא הקרינה ה-GFP. אנחנו בדרך כלל להדביק את התאים עם BAF60C וFACS-סוג 72 שעות לאחר הזיהום להעשיר לאוכלוסייה להביע BAF60C. כאשר התאים מגיעים סביב 70-80% מנקודת המפגש, אנחנו להדביק עם lentivirus MyoD. לאחר ההדבקה הראשונה זה בדרך כלל לוקח יומיים או שלושה לתאים כדי להגיע למפגש הזה. איור 1 מציג את רמות ביטוי של גנים אקסוגניים כמו קיפול אינדוקציה ביחס לhESCs לא נגוע. תרשים 1C מציג את הביטוי והפצה ברמת החלבון של הגורמים הציגו. BAF60C<html> ביטוי מוצג כקרינת ה-GFP, ואילו ביטוי MyoD הוא זוהה על ידי immunofluorescence עם נוגדן MyoD. אנו רואים ביום 0 היום אנחנו מתחילים את הבידול של hESCs הנגוע לתוך אגרגטים כמו EB. לאחר 15 ימים במדיום DM, חלק מmyospheres (בדרך כלל גם כל אחד) מוטבע במתחם אוקטובר 12 ומחולק לבצע immunofluorescence עבור סמני myogenic כדי לבדוק את יעילות המרת myogenic. 1D איור תערוכות מכתים נציג לmyogenin ושרשרת כבדה שרירן ב בידול myogenic אופטימלי. Myospheres יכול לקבל צורות שונות או יוצאות דופן, אולי כתוצאה מהתמזגות עם myospheres קטן יותר. החל מיום 10, אפשר להתבונן התכווצות סדירה בmyospheres (ראה סרט 1 ו -2). &quot;/&gt; 43/51243fig1.jpg איור 1.) סכמטי של הפרוטוקול המשמש לייצור myospheres מhESCs. B) רמות ה-mRNA של גנים אקסוגניים בhESCs נגוע בBAF60C וMyoD (H9-BM) פיקוח על ידי qRT-PCR והביע כאינדוקציה לקפל, כמו לעומת ללעוג hESCs הנגוע תמונות Immunofluorescence (H9-CTR). C) מראים כתמי MyoD (אדום) וקרינת BAF60C (ירוק) בשל אלמנט IRES-GFP בוקטור Immunofluorescence. ד &#39;) שבוצע בסעיפי myosphere המוכתמים עבור Myogenin (MYOG ), שרשרת השרירן כבד (MyHC) וcounterstained לDAPI (ראה פירוט Immunofluorescence). בר סולם הוא 100 מיקרומטר. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51243/51243fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51243/51243fig2.jpg" /> איור 2. תמונות מייצגות של מראה תא בשלבים שונים שלפרוטוקול מהזיהום (חלק I) לבידול (חלק ב &#39;). בר סולם הוא 100 מיקרומטר. ואילו מבנים דמויי-EB מD1 ל D5 הם בעיקר בצורה עגולה (ד &#39;), myospheres גדל מעל 15 ימים על פי התכנית באיור 1 א מציגה צורה בלתי צפויה והן הטרוגנית בתרבות; לראות שתי דוגמאות בE ו-F.

כאן אנו מתארים פרוטוקול המבוסס על תכנות מחדש אפיגנטיים של תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) לכיוון יצירת אוכלוסייה הומוגנית של אבות שלד שריר כי בתנאי תרבות המתירנית יצירת צבירים תלת ממדיים של myofibers ההתכווצות (myospheres), אשר מסכמים תכונות ביולוגיות של אדם שרירי שלד.

דור של Myospheres מhESCs על ידי תכנות מחדש אפיגנטיים

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להפיק myos spheres, מבנים דמויי EB המורכבים מתאי שריר שלד המופקים מתאי גזע עובריים אנושיים. הדבר מושג על ידי תכנות מחדש של התאים באמצעות זיהום לנטיבירי של Baf 60 C. השלב השני של הפרוצדורה הוא הדבקת אותם תאים בנגיף שני, הלנטיבירוס myo D.לאחר מכן, התאים המודבקים עוברים השראה ליצירת אגרגטים דמויי גופי אמבריו (EB) למשך חמישה ימים במצע גידול מבוסס סרום. לאחר מכן, מצע ה-EB מוחלף במצע דיפרנציאציה נטול סרום, והאגרגטים גודלים למשך שבועיים נוספים עד להפיכתם לספירות שריר (myospheres). לבסוף, נעשה שימוש באימונופלורסצנציה כדי להדגים חתכים של אגרגטים המוטמעים ב-OCT.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא התפוקה הגבוהה של התמיינות תאי שריר שלד, שביוצאי מקור מזנכימלי או מזודרמלי היא אינה דורשת מיון תאים, ולכן היא תואמת למערכת תרבית תלת-ממדית. יום לפני ההדבקה של תאי גזע עובריים אנושיים בלוחיות של שש בארות, הוסיפו למצע תוסף התאוששות ושכפול של תאי גזע עובריים אנושיים בריכוז 1000x, כדי להגיע לריכוז סופי של 2 µM. למחרת, הדביקו את תאי הגזע העובריים האנושיים עם lentivirus מסוג 60 CGFP בעל תיתר גבוה. ראשית, פרקו בארת תאים לסספנזיה של תאים בודדים על ידי הוספה של 1 mL trypsin ודגירה של הלוחית למשך חמש דקות. לאחר מכן, אספו והעבירו את הסספנזיה לשפופרה של 15 mL.הוסיפו תשעה מיליליטרים מהמדיום שהוכן וסובבו את התאים במהירות של 1, 200 RPM למשך חמש דקות, ובזמן ההמתנה הכינו מיליליטר אחד של mt. SIR. הוסיפו poly brain בריכוז סופי של ששה מיקרוגרם למילליטר ואת תוסף ההתאוששות של תאי גזע עובריים אנושיים בריכוז של שני מיקרומולר.לאחר מכן, השביה מחדש את התאים בתמיסה זו והעבר אותם לבאר אחת של פלטה בעלת שישה בארות עם הידבקות נמוכה (low attachment plate). כעת, הוסף את הווירוס המרוכז ב-60 C בריבוי הדבקה (multiplicity of infection) של 100 מיליון. הדגר את הפלטה עם הווירוס למשך שלוש שעות.לאחר מכן אספו את התאים וחלקו אותם לשתי בארות של פלטה מצופה ב-matrigel. לכל פלטה, הוסיפו 2 mL של mt, SIR, אחת עם תוספת של 2 µM, ולאחר מכן דגרו את התאים למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C. למחרת, החליפו את המדיום במדיום טרי.התאים ייראו כמי שכבר הצטמרו לאחר 48 שעות מרגע תחילת הזיהום. בדקו את הפלואורסצנציה כדי להעריך את יעילות הזיהום. המשיכו בהחלפות התווך היומיות עד שהתאים יגיעו ל-80% Confluence, לאחר מכן בצעו דיסוציאציה לתאים ולהוסיפו את נגיף myo D לתאים לפי אותו פרוטוקול.יש לתחזק את התאים המודבקים באמצעות החלפות מדיום יומיות עד שיגיעו ל-80% confluence ביום שלפני נקודת גדילה זו. יש לזרוע MES על פלטות מצופות matrigel בריכוז של 1000 תאים לסנטימטר רבוע כדי להעביר את התאים המודבקים לפלטת ה-ME'S. למחרת.השתמש ב-trip ALI כדי להפריד ביניהם והעבר את התאים למבחנה של 15 מיליליטר. הוסף תשעה מיליליטר של מצע תאי גזע עובריים אנושיים וסבב אותם בצנטריפוגה. הגדר 1,200 RPM למשך חמש דקות.סספנדו את התאים שהשקילו ב-6 mL טריים של מצע גידול לתאי גזע עובריים אנושיים. כעת, הסירו את המצע משתי פלטות של mes והוסיפו אליהן את התאים המודבקים. הדגירו את התאים למשך מספר ימים.כאשר תגיע התרבית ל-80% confluence, הסר את כל המדיום והוסף מיליליטר אחד של collagenase four. לאחר חמש דקות בחשיפה ל-collagenase בטמפרטורה של 37 °C, הוסף מיליגרם אחד למילילטר.החליפו את הקולגנאז (collagenase) במיליליטר אחד של מצע גידול לתאי גזע עובריים אנושיים. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ דיסקציה, גרדו את המושבות באמצעות טיפ של פפיטה של 10 מיליליטר, העבירו את המושבות לפפיתה של 15 מיליליטר והמתינו לשקיעתן. לאחר שלוש דקות, הסירו את הנוזל העליון (supernatant) ושספנדו מחדש את התאים במצע גידול לתאי גזע עובריים אנושיים.לאחר מכן, זרעו את התאים ביחס של 1:4 לצלחות meth. התאים המודבקים צריכים להיות במספר גבוה ולהוות מושבות באיכות טובה לצורך הליך זה. הסירו את המצע מכל באר והוסיפו 1 mL של collagenase.Four.הוסיפו ריכוז של מיליגרם אחד למילילטר כפי שנעשה קודם לכן, ועצרו את תגובת הקולגנאז לאחר חמש דקות על ידי החלפת התמיסה במדיום EB. לאחר מכן, השתמשו במהירות במיקרוסקופ כדי לגרד את המושבות. באמצעות טיפ של פיפט למשק 10 מילילטר, ניתן לפרק את התאים לצבירי תאים קטנים.אספו אגריגטים אלו לשפופרת של 15 מיליליטר, ולאחר שהשקיעו למשך כသုံး דקות, הסירו את הנוזל העליון (supernatant), השתה את התאים בשלושה מיליליטר של מצע EB והעבירו את הכל לבאר אחת של פלטה בעלת שש באערים עם הידבקות נמוכה (low attachment plate). הגריעו פלטה זו למשך הלילה. בדקו אותם לאיתור גושי מושבות גדולים.במידה ונמצאו כאלה, יש לפרק אותם על ידי העברתם דרך פיפט של 5 mL מספר פעמים. אם ישנם תאים בודדים רבים הצפים, יש לאסוף את האגרגטים על ידי שיקוע ולהחליף את המדיום במדיום EB טרי.החליפו את המצע מדי יומיים לאחר חמישה ימי תרבית. אספו את מקבצי התאים ושטפו אותם פעם אחת עם 2 milliliters של PBS, תוך מתן אפשרות לתאים לשקוע תחת כבידה רגילה. לאחר מכן, החליפו את ה-PBS ב-3 milliliters של מצע DM והחזירו את התאים לאותם בארות של הפלטה במהלך 15 ימי התרבית הבאים.יש להחליף את המצע מדי שלושה ימים. במהלך זמן זה, ייווצרו מסוסירות. תאי גזע עובריים אנושיים הוזנקו ב-bath 60 C הנושא פלואורסצנציית GFP.לאחר 72 שעות, התאים עברו מיון באמצעות FACS. תאים המבטאים BAF 60 C גודלו עד לצפיפות של כ-75% ואז הודבקו עם לנטיווירוס של myo D. ביטוי גן אקסוגני זוהה בתאים המודבקים באמצעות quantitative real-time PCR.נבדקו הביטוי וההפצה ברמת החלבון. GFP תואם לביטוי של baf 60 C, ונוגדן myo D שימש לבדיקת ביטוי של myo D. 15 ימים לאחר שתאי גזע עובריים אנושיים החלו להוות אגרגטים דמויי EB.חלק מהכדורי המיוס (myos spheres) הוטמנו בתרכובת OCT ונחתכו; החתך נצבע באופן חיובי לסממנים מיוגניים ולסממני שרשראות כבדות של מיוזין. החל מהיום ה-10, ניתן היה להבחין בהתכווצויות ספורדיות בכדורי המיוס. חלק מכדורי המיוס קיבלו צורות שונות או חריגות, ייתכן בשל התמזגות בין כדורי מיוס.טכניקה זו תקדם את המחקר בתחום מידול מחלות וטיפולים, מכיוון שניתן לייצר myo spheres מתאי גזע פלוריפוטנטיים של מטופלים הסובלים מהפרעות שרירים שונות. מסיבה זו, myo spheres מספקים מודל של מחלה in vitro המתאים לסקרים של תרופות ולמחקר פתוגנזה של מחלות.

generation-of-myospheres-from-hescs-by-epigenetic-reprogramming

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

וידאו זה מציג את התהליך להפקת המושרה בתאי גזע pluripotent באמצעות lentivirus ועין מתנהלת המבטאים Oct4, Sox2, c-myc ו Klf4.

יצירת iPS תאים MEFS דרך ביטוי מאולץ של סוקס-2, אוקטובר-4, c-myc, ו Klf4

אנו מציגים פרוטוקול תכנות מחדש יעיל של האדם התאים הסומטיים אל האדם המושרה בתאי גזע pluripotent (hiPSC) באמצעות וקטורים retroviral קידוד Oct3 / 4, Sox2, Klf4 ו-c-myc (OSKM) וזיהוי של hiPSC לתכנות מחדש בצורה נכונה על ידי צביעה חיה עם Tra למוצרי 1-81 נוגדנים.

בחירה בידוד מושבות של בתאי גזע pluripotent מושרה לתכנות מחדש של Fibroblasts למבוגרים

כאן אנו מציגים פרוטוקול פשוט ויעיל עבור הדור של iPSCs אדם ממ"ל של 3-4 דם היקפי באמצעות וקטור תכנות מחדש lentiviral אחת. תכנות מחדש של תאי דם זמינים ונגישים מבטיח להאיץ את הניצול של טכנולוגית iPSC ידי ההפיכה לנגישה לקהילת מחקר רחבה יותר.

דור של תאים אנושיים מושרים pluripotent גזע מדם היקפי באמצעות STEMCCA lentiviral הווקטור

כאן אנו מתארים פרוטוקול להפקת תאי גזע pluripotent אנושי הנגרם מהדם היקפי באמצעות אסטרטגית תכנות מחדש episome מבוסס ומעכבי היסטון deacetylase.

דור יעיל iPS תא מהדם באמצעות Episomes וHDAC המעכבים

תאים מושרה pluripotent גזע (iPSCs) מהווים מקור של רקמות מטופל ספציפי ליישומים קליניים ומחקר בסיסי. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לתכנת מחדש תאים אנושיים היקפיים mononuclear הדם (PBMNCs) המתקבלים ממעיילי אפים קפואים לiPSCs הנגיפי ללא שימוש בפלסמידים episomal הלא שילוב.

דור של גזע תאים המושרה pluripotent מקפוא באפי מעילים באמצעות Episomal פלסמידים ללא שילוב

הפרוטוקול המתואר כאן מפרט את השראת תוכנית המוגנית בפיברובלסטים עובריים של עכברים באמצעות ביטוי יתר של קבוצה מינימלית של גורמי שעתוק. טכנולוגיה זו עשויה להיות מתורגמת למערכת האנושית כדי לספק פלטפורמות למחקר עתידי של המטופואיזה, מחלות המטולוגיות והשתלת תאי גזע המטופויאטיים.

תכנות מחדש עכבר עוברי פיברובלסטים עם גורמי שעתוק כדי לגרום תכנית Hemogenic

פרוטוקול זה מתאר שיטה מפורטת לייצור יעיל של iPSCs ללא אינטגרציה מתאי דם היקפיים אנושיים בוגרים. עם שימוש בארבעה וקטורים אפיזומליים מבוססי oriP/EBNA כדי לבטא את גורמי התכנות מחדש, KLF4, MYC, BCL-XL, או OCT4 ו-SOX2, ניתן להשיג אלפי מושבות iPSC מ-1 מ"ל של דם היקפי.

דור של תאי גזע מושרים אינטגרציה נטולה מן אדם הדם ההיקפי mononuclear תאי שימוש וקטורי Episomal

פרוטוקול זה ממחיש את האינדוקציה של תוכנית המטוגניים בתוך הגוף האנושי פיברותקיעות על ידי ביטוי נאכף של הגורמים שעתוק GATA2, GFI1B ו-FOS כדי ליצור גזע המטפאות ובתאי קדמון.

הומוגניים מתיכנות מראש של האדם פיברותקיעות על ידי ביטוי שנאכף של גורמים שעתוק

וידאו זה מדגים כיצד לגדול בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) על העכבר עובריים (MEF) תאים פיברובלסטים מזין. חלק 1 מתוך 3.

מ MEFs כדי Matrigel אני: hESCs Passaging בנוכחות MEFs

וידאו זה מדגים כיצד לשמר את הצמיחה של בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) בתא ללא תנאים מזין וכיצד ברציפות hESCs מעבר במזין תא ללא תנאים. אישור hESC pluripotency גדל מזין תאים ללא תנאים על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence באה לידי ביטוי גם. חלק 2 מתוך 3.

מ MEFs כדי Matrigel 2: hESCs פיצול מן MEFs על Matrigel

למד ליצור מיוספירות מתאי גזע עובריים אנושיים באמצעות תכנות מחדש אפיגנטי. הפרוטוקול מייצר תאי שריר שלד מכווצים ללא מיון FACS לחקר ביולוגיית שריר ורפואה רגנרטיבית.

דור של Myospheres מhESCs על ידי תכנות מחדש אפיגנטיים

גלה סרטונים נוספים