Name: הר immunolabeling השלם של חוש הריח קולטן נוירונים דרוזופילה אנטנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: למדו טכניקת immunostaining שלמות לחישוף נוירוני קולטנים אולפקטוריים בזבובי Drosophila. שיטה זו מאפשרת חקירת מנגנונים מולקולריים של גיוון תאי עצב בחוש הריח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

מחקר זה נתמך על ידי תכנית נתמכת-MEXT לקרן המחקר האסטרטגי באוניברסיטאות פרטיות וJSPs מדען הצעיר ב &#39;המענק לHT ברצוננו להודות לOhtake Norihito כדי לערוך את קטעי וידאו.

1. הכן צלחת תפוחים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 12.5 אגר גרם, 125 מיליליטר 100% מיץ זמין מסחרי תפוח, 12.5 גרם גלוקוז, ו375 מיליליטר H 2 O. מיקרוגל את התערובת במשך 1 עד 2 דקות ויוצקים לצלחת תרבית תאי 3 סנטימטר. חנות ב 4 ° C. </li></ol> 2. צלב גנטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בצלב הגנטי הנציג הבא: </li></ol> Or49a-mCD8 :: ה-GFP / ארגון נוער קתולי x w 1118 3. פרוטוקול Dissection והמכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את הזבוב ולאחר מכן לחתוך את הראש לטוס בצורה אנכית על ידי החזקתו באמצעות מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להניח את חלק האנטנות המכילות בצלחת תפוחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הקטע השלישי של האנטנה באמצעות מספריים לנתיחה בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 90 μl של פתרון הקיבעון (paraformaldehyde 4% בPBST 0.1% (PBS עם 0.1% טריטון X-100)) לאמצע צלחת תרבות תחתית כוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להעביר את antenn גזורAE עם מחט חדה ישירות לפתרון הקיבעון. במידת צורך, מבחינה פיזית להטביע את האנטנות לפתרון באמצעות מחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 40 דקות בטמפרטורת חדר (RT). שטוף את האנטנות בPBST 0.4% (PBS עם 0.4% טריטון X-100), 3x 10 דקות בכל אחד, לשמור אותם באותה הצלחת. השתמש בעצות צהובות כדי להסיר ולהוסיף פתרון PBST. השתמש 90 μl של הפתרון לשטוף בכל פעם. הערה: אין להניח את הצלחת לתוך שייקר במהלך אימונוהיסטוכימיה. לפני הסרה או הוספת הפתרון לתוך הצלחת, להביא את כל האנטנות במרכז הצלחת באמצעות המחט וזהירות להוסיף או להסיר את הפתרון מהקצה של המנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את האנטנות עם 90 μl של 5% בסרום סוס רגיל בPBST 0.1% 20 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסרת חסימת הפתרון, דגירה האנטנות עם 90μl של נוגדנים עיקריים בPBST 0.1% המכילים 5% בסרום סוס ל48 שעות על 4 מעלות צלזיוס במכל לח כפי שתואר לעיל <sעד&gt; 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את אנטנות 6x 10 דקות בPBST 0.4%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה האנטנות עם 90 μl של נוגדנים משני בPBST 0.1% המכיל 5% בסרום סוס ל48 שעות ב 4 ° C. שטוף 6x 10 דקות באמצעות PBST 0.4%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעלות את האנטנות, להסיר PBST ממנת התרבות ככל האפשר ולהציג בהדרגה שני ריכוזים שונים של גליצרול לאנטנות. ראשית להוסיף גליצרול 40% למנה ל1 עד 2 דקות; לאחר מכן להסיר את זה ולהוסיף גליצרול 80%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלץ בזהירות את האנטנות (כולל גליצרול 80%) ממנת התרבות באמצעות קצה צהוב ומניח אותם על גבי שקופיות. מניח בעדינות coverslip על גבי וסוגר את קצות coverslip עם לק. האנטנות מוכנות להיות צילם על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי עכשיו. </li></ol>

<ol><li>Christensen, T. A., White, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChristensen%2C+TA+%22Representation+of+olfactory+information+in+the+brain+In+The+Neurobiology+of+Taste+and+Smell%22">Representation of olfactory information in the brain In The Neurobiology of Taste and Smell</a>. , New York. 201-232 (2000).</li>
<li>Ache, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+common+strategy+for+transducing+olfactory+information%5BTitle%5D)+AND+%22Sem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Towards a common strategy for transducing olfactory information.</a> Sem. Cell Biol. 5, 55-63 (1994).</li>
<li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction%5BTitle%5D)+AND+%22C.+elegans.+Cell%22%5BJournal%5D)">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction.</a> C. elegans. Cell. 13, 515-527 (1993).</li>
<li>Barth, A. L., Justice, N. J., Ngai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asynchronous+onset+of+odorant+receptor+expression+in+the+developing+zebrafish+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Asynchronous onset of odorant receptor expression in the developing zebrafish olfactory system.</a> Neuron. 16, 23-34 (1996).</li>
<li>Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+olfactory+system+makes+sense+of+scents%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">How the olfactory system makes sense of scents.</a> Nature. 413, 211-218 (2001).</li>
<li>Stockinger, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuitry+that+governs+Drosophila+male+courtship+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Neural circuitry that governs Drosophila male courtship behavior.</a> Cell. 121, 795-807 (2005).</li>
<li>Endo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modification+of+Notch+targets+in+olfactory+receptor+neuron+diversification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Chromatin modification of Notch targets in olfactory receptor neuron diversification.</a> Nat Neurosci. 15, 224-233 (2011).</li>
<li>Karim, M. R., Moore, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+analysis+of+Drosophila+larval+peripheral+sensory+neuron+dendrites+and+axons+using+genetic+mosaics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Suh, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+population+of+olfactory+sensory+neurons+mediates+an+innate+avoidance+behaviour+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single population of olfactory sensory neurons mediates an innate avoidance behaviour in Drosophila.</a> Nature. 431, 854-859 (2004).</li>
<li>Sachse, S., Galizia, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+inhibition+for+temporal+and+spatial+odor+representation+in+olfactory+output+neurons%3A+A+calcium+imaging+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Role of inhibition for temporal and spatial odor representation in olfactory output neurons: A calcium imaging study.</a> J Neurophysiol. 87, 1106-1117 (2002).</li>
<li>Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+odor+coding+in+the+Drosophila+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna.</a> Cell. 117, 965-979 (2004).</li>
<li>Vosshall, L. B., Wong, A. M., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+olfactory+sensory+map+in+the+fly+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An olfactory sensory map in the fly brain.</a> Cell. 102, 147-159 (2000).</li>
<li>Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular%2C+anatomical+and+functional+organization+of+the+Drosophila+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular, anatomical and functional organization of the Drosophila olfactory system.</a> Curr Biol. 15, 1535-1547 (2005).</li>
<li>Clyne, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+response+of+individual+sensilla+on+the+Drosophila+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Invert+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Odorant response of individual sensilla on the Drosophila antenna.</a> Invert Neurosci. 3, 127-135 (1997).</li>
<li>Vosshall, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spatial+map+of+olfactory+receptor+expression+in+the+Drosophila+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna.</a> Cell. 96, 725-736 (1999).</li>
<li>Wang, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112, 271-282 (2003).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

דיסקציה של אנטנת דרוזופילה אנו מתארים היא פשוט וקל לביצוע בסביבת מעבדה. כדי להבטיח לנתיחה מוצלחת, חיוני לנצל מספריים עדינים עם קצוות. בעוד immunostaining האנטנה גזור, חשוב כדי לדגור אותם במכל המלא בלחות, כדי למנוע אידוי של פתרון הנוגדן. יש האנטנה גזור נטייה לצוף בפתרון. שימוש 0.1% טריטון ב-PBS במהלך הקיבעון וחסימת צעדים תקל על הטמעה של האנטנה בפתרון ועל מנת להבטיח צביעה טובה יותר. באמצעות &quot;תרבות צלחת זכוכית התחתונה&quot; יכול להפחית את האובדן של אנטנות במהלך immunost...

מערכת חוש הריח משמשת להבחין בין מגוון עצום של מולקולות ריח ולאחר מכן לשלוח את המידע וכתוצאה מכך למרכזי המוח גבוהים יותר. קלט זה משמש לשלוט במדויק התנהגות בעלי חיים בסיסית, כגון האכלה והזדווגות 1-6. כמו כל סוג תא עצב חוש הריח קשור לקבוצה מסוימת של ריחות, הפיזור של תאי עצב קולטני ריח (orn) ים הוא חיוני לתפקוד התקין של מערכת חוש הריח נכון 7. הגנטיקה דרוזופילה מאפשרת לנו לבצע חקירה ברמת התא בודדת מעורבת מנגנונים מולקולריים הקשורים בהתפתחות orn ותפקוד פיסיולוגי 8-16. immunostaining ההר השלם של אנטנות דרוזופילה אפשר לנו להבין בפירוט רב יותר את המנגנונים המולקולריים המעורבים בפיזור של תאי עצב קולטני ריח (orn) של 7. במסמך זה אנו מספקים תיאור מקיף של שיטה פשוטה לachieve זה.

<table><tbody><tr><td>מיקרוסקופ דיסקציה Stemi DV4</td><td>Zeiss</td><td>Stemi DV4</td><td></td></tr><tr><td>כלי תרבית תחתית זכוכית&nbsp;</td><td>תאגיד MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>מספריים דיסקציה</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>עכברוש אנטי-ELAV</td><td>מחקרים התפתחותיים בנק היברידומה</td><td>7E8A10</td><td>דילול 1:200</td></tr><tr><td>עכבר אנטי-GFP</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td>דילול 1:400</td></tr><tr><td>חמור נגד ארנב IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>711-225-152</td><td>דילול 1:200</td></tr><tr><td>דונקי נגד חולדות IgG</td><td>מעבדות ג'קסון למחקר חיסוני</td><td>712-165-150</td><td>דילול 1:200</td></tr></tbody></table>

הר immunolabeling השלם של חוש הריח קולטן נוירונים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אנטנה

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

מולקולות odorant נקשרות לקולטנים היעד שלהם באופן מדויק ומתואם. כל קולטן מזהה אות מסוימת ומעביר מידע זה למוח. ככזה, קביעת אופן בו מידע הרחה מועבר למוח, שינוי הן תפיסה והתנהגות, חקירה ראויה. מעניין לציין, כי יש ראיות המתעוררות כי גורמי התמרה ותעתיק תאיים מעורבים בפיזור של עצב קולטני ריח. כאן אנו מספקים כולה חזקים הר שיטת תיוג חיסוני לassay in vivo ארגון תא עצב קולטני ריח. באמצעות שיטה זו, זיהינו את כל תאי העצב קולטני הריח עם נוגדן אנטי ELAV, סמן פאן עצבי ידוע וOr49a-mCD8 :: ה-GFP, נוירון קולטני ריח במיוחד לידי ביטוי בנוירון-NBA באמצעות נוגדן אנטי-GFP.

הבטחה כי גם הנתיחה והקיבוע מבוצעים במהירות היא גורם מפתח בהשגת הצלחה בפרוטוקול זה. בעזרת מספריים ומלקחיים עדינים הוא גם חיוני. לאחר immunostaining, אנטנות ניאון שכותרתו נבדקו תחת מיקרוסקופ confocal. בדרך כלל אנחנו לוקחים את חלקי 1μm באמצעות עדשת 20x. אנו כותרת-NBA 7 ORNs באמצעות GFP :: Or49a-mCD8 וספרנו את מספר-NBA ORNs באנטנת wild-type. כתב mCD8-GFP הוא מקומי קרום תא ולכן הביטוי לראות באיור 2 מוצג על קרום התא של OR49a ORNs להביע GFP. באיור 2 מראה ביטוי ORNs-NBA באמצעות...

כאן אנו מתארים את התהליך של צביעה חיסונית שלמה של אנטנות דרוזופילה, המאפשר לנו להבין טוב יותר את המנגנונים המולקולריים המעורבים בגיוון נוירונים של קולטני ריח (ORN).

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להדמיות של נוירוני קולטני הריח באמצעות צביעת מחושים בשיטת whole mount. ראשית, הרדמו את הזבוב כדי לחתוך את ראשו בצורה אנכית. לאחר מכן, הנח את ראש הזבוב המנותח על לוחית תפוח.לאחר מכן, חתכו את המקטע השלישי של הממשש והניחו אותו בתוך צלחת תרבית עם תחתית זכוכית לצורך ביצוע אימונוהיסטוכימיה. לאחר קיבוע הממששים על זכוכית של שקף, נוכל להדמיות את הסוגים השונים של נוירונים קולטני ריח באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי. אנו עובדים על מערכת הריח של ה-do.מערכת הריח משמשת להבחנה בין מגוון רחב של מולקולות שונות. המגוון הרחב של נוירונים ריחיים מובחנים הקיימים במערכת זו מאפשר העברה מדויקת ומתואמת של מידע מקולטני מטרה לנוירונים בתוך המוח. היום נתאר את שיטת הצביעה של קרן המישוש (antenna) כשלמה (whole mount) כדי לזהות את הגיוון של נוירונים ריחיים אלו.על מנת להבטיח הצלחה בצביעת תכשיר שלם (whole mount) וצביעת מחוש, קריטי להכין מנה טרייה של מקבע מיד לפני תחילת הפרוטוקול. הרדימו את הזבוב ולאחר מכן חתכו את ראש הזבוב באופן אנכי תוך כדי החזקת גופו באמצעות פינצטה. כעת, הניחו בזהירות את המחוש המבודד על פלטת תפוחים.גזרו את המקטע השלישי של המחוש (antenna) באמצעות מספרי דיסקציה עדינים. העבירו 90 Microliters של תמיסת קיבוע למרכז הצלחת. באמצעות מחט חדה, העבירו בעדינות את המחוש הגזור ישירות אל

whole-mount-immunolabeling-olfactory-receptor-neurons-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו מתארים טכניקה הוקמה כדי למדוד ולנתח ריח עוררו תגובות סידן באונה מחושים...

סידן הדמיה של ריח עוררו התגובות תסיסנית מחושים האונה

כדי להבין כיצד צורות תאים מורכבים, כגון דנדריטים עצביים, מושגות במהלך הפיתוח, חשוב להיות מסוגל הארגון במדויק microtubule assay. כאן אנו מתארים את שיטת תיוג חזקים immunohistological לבחון ארגון microtubule הדנדריטים של נוירון דנדריטים arborization חושית, קנה הנשימה, שריר,...

תיוג Immunohistological של microtubules ב דנדריטים Neuron חושי, Tracheae, והשרירים של תסיסנית גוף Larva הכותל

סרטון זה מדגים פרוטוקול חיסוני מפורט כדי להמחיש פגמים פנוטיפיים בגופי הפטריות של מוחות דרוזופילה מוטנטיים. הפרוטוקול כולל שימוש בנוגדנים נגד Fas2, חלבון המעורב בהנחיה אקסונלית המאפשרת התפתחות מורפולוגית ותפקודית תקינה של גוף הפטרייה.

הדמיה של תאי עצב בגוף פטריות במוחות דרוזופילה באמצעות צביעת מערכת החיסון

אנו מציגים טכניקה לסימון תאי עצב בודדים במערכת העצבים המרכזית (CNS)...

תיוג של תאים בודדים במערכת העצבים המרכזית של<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

ריסים של נוירונים חושי ריח מכילים חלבונים של מפל העברת האותות, אך ניתוח מרחבי מפורט של התפלגותם קשה בהקפאות. אנו מתארים כאן גישה אופטימלית לתיוג הר שלם והדמיה פנים של חלבונים ריסניים.

הר תיוג כל צילה במערכת חוש הריח העיקרית של עכברים

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להדגים כיצד להציג odorants של התנודתיות נמוכה להקלטת single-sensillum מ נוירונים קולטן תסיסנית חוש הריח המגיבים שרשרת פרומונים ארוכים שרשרת.

הקלטה אלקטרופיזיולוגית מ<em&gt; תסיסנית</em&gt; Trichoid Sensilla בתגובה ריחות של תנודתיות נמוכה

פרוטוקול זה מתאר את הקרע של immunostaining של המבוגרים דרוזופילה melanogaster רקמות המוח. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מדגיש את השימוש נוירונים הגוף, קולט אור פטריות דרוזופילה בתור דוגמה עצביים קבוצות משנה יכול לשמש באופן מדויק לחשוף את עקרונות כלליים שבבסיס היבטים רבים של ההתפתחות העצבית.

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

התאים להציג מורפולוגיות שונות, ליצור מגוון רחב של אינטראקציות עם שכניהם. פרוטוקול זה מתאר איך לחשוף את המורפולוגיה של תאים בודדים כדי לחקור את תא-תא אינטראקציה באמצעות מערכת ביטוי Gal4/UAS ומבוססת.

יישום טכניקת FlpOut ססגוניות ללמוד ברזולוציה גבוהה תא בודד מורפולוגיות ו תא אינטראקציות של עכשיו, דונלד ב דרוזופילה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול שלב ומנתחים לפתח חוש הריח רקמות ממינים דרוזופילה . הרקמה ביתור מאוחר יותר ניתן להשתמש עבור ניתוחים מולקולריים, כגון כמותיים RT-PCR (הפוך תמלול-תגובת שרשרת פולימראזית) או RNA רצף (RNAseq), כמו גם ניתוחים ויוו כגון אימונוהיסטוכימיה או בחיי עיר הכלאה.

הכנת לפתח רקמות היקפיים חוש הריח עבור מולקולרית וניתוח Immunohistochemical ב דרוזופילה

פרוטוקול זה מתאר את הליך הנתיחה, מצב התרבית וההדמיה החיה של מערכת אקספלנט של אנטנות-מוח לצורך חקר מכלול מעגלי חוש הריח.

מערכת אקספלנט למחקרי הדמיה בהילוך מהיר של מכלול מעגלי חוש הריח בדרוזופילה

מאמר זה מתאר פרוטוקול יעיל לפירוק דיסק דמיוני וצביעת נוגדנים, שהוא חסכוני עם מגיבים ומקל על טיפול בדיסקים דמיוניים במספרים קטנים.

כריתה בקנה מידה קטן וצביעת נוגדנים של דיסקים דמיוניים באנטנות העיניים והכנף מ-Drosophila melanogaster

למדו טכניקת immunostaining שלמות לחישוף נוירוני קולטנים אולפקטוריים בזבובי Drosophila. שיטה זו מאפשרת חקירת מנגנונים מולקולריים של גיוון תאי עצב בחוש הריח.

הר immunolabeling השלם של חוש הריח קולטן נוירונים

גלה סרטונים נוספים