ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מענק R01NS062842 מהמכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ, המכונים לאומיים לבריאות (VVD) ועל ידי מענקי R21 NS064403 מהמכון הלאומיים להפרעות נוירולוגיות ושבץ, המכונים לאומיים לבריאות באמצעות ערה (VVD) וR21 מכון EB006301 הלאומי ביו הדמיה וההנדסה ביוטכנולוגיה, מכון הלאומי לבריאות (VVD).

השיטה מתאימה ל, סעיפי רקמות פרפין מוטבעים קבוע פורמלדהיד. הטכניקה מודגמת כאן ביישום שלה ללטף ניסיוני בחולדה. 1. רכיבי כנות לקראת מערכת tyramide איתותים ההגברה (TSA) למרות השיפור המבוסס על ה-TSA משמש בשלב הסופי של תיוג, נערך לתגובה זו יכולה לקחת שעות יותר מ 1. לכן זה נוח לעשות את ריאגנטים TSA לפני שמתחיל את התיוג. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך פתרון מניות tyramide fluorophore. השתמש במגיב tyramide fluorophore מסופק בבקבוקונים בודדים עם ערכת תיוג ה-TSA. הוסף 300 DMSO μl לבקבוקון מגיב tyramide. פתרון מניות tyramide Fluorophore הוא יציב במשך לפחות 3 חודשים, כאשר הם מאוחסנים ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך לשטוף חיץ TNT המכיל: 0.1 M טריס-HCl, pH 7.5; 0.15 M NaCl; -20 Tween 0.05%. אם 0.3% נזקקו טריטון X-100 ניתן להחליף לTween-20 0.05%. Alternatively PBS עשוי לשמש כחיץ לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך TNB חסימת מאגר המכיל: 0.1 M טריס-HCl, pH 7.5; 0.15 M NaCl; 0.5% מגיב חסימה (מסופק בערכה). כדי לפזר את החסימה מגיב לחלוטין, להוסיף באיטיות אותו במרווחים קטנים למאגר תוך ערבוב. מחממים את הפתרון הזה בהדרגה ל-C ° 55 עם ערבוב מתמיד. זה יכול לקחת דקות 30-60. הפתרון יופיע חלבי. מביא לטמפרטורת חדר לפני השימוש. Aliquot ולאחסן ב -20 ° C לשימוש לטווח ארוך. </li></ol> 2. הכנת סעיפים השתמש בשקופיות עם 5 סעיפים מיקרומטר בעובי רכובים לחתוך מרקמות קבועות פורמלין. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את החלקים עם קסילן במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רעננותם סעיפים כדלקמן: לטבול ב96% 2x EtOH במשך 5 דקות כל אחד; להשרות בEtOH 80% למשך 5 דקות; לשטוף עם 2x מים במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך פתרון עובד proteinase K על ידי דילול מניות פתרון proteinase K 50 מיקרוגרם / מיליליטר PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת proteinaseK עובד פתרון לחלקים. דגירה 15 דקות ב 23 ° C. היקף הפתרון והזמן של עיכול ייתכן שיצטרכו להיות מותאם בהתאם לגודל של חלקים וסוגי רקמות. לסעיף קטן (מתחת ל -5 מ&quot;מ קוטר) 50 μl של פתרון proteinase יהיה מספיק. סעיף לגודל ממוצע (~ 10 מ&quot;מ קוטר), להוסיף לפתרון proteinase K 100 μl. עבור חלקים גדולים מאוד בנפח של הפתרון וניתן לשנותם. בכל המקרים לטפל כדי למנוע overdigestion סעיפים שמוביל לאובדן מוחלט של אות והורסת את רקמת מורפולוגיה. זה קורה לעתים קרובות, אם זמן דגירה עולה 25 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים ב2x מים מזוקקים במשך 5 דקות כל אחד. מכין את תערובת התיוג המכילה בדיקה פעילה בזמן שחלקים נמצאים במים. </li></ol> 3. מכתים מבוסס TOPO VACC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון הבדיקה הפעיל על ידי שילוב של הפעולות הבאות: מים - 11.75 μl 1 M טריס-HCl, pH 7.4-1.25 μl של oligonucleotide התאבדות הסככה 12 בסיס 100 pmol - 1 μl של oligonucleotide מתאם 100 pmol - 1 μl TOPO VACC 50 pmol - 10 μl </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים בעדינות על ידי pipetting. דגירה בטמפרטורת חדר (23 מעלות צלזיוס) במשך 15 דקות, כדי לאפשר הפעלת חללית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח חלקים מצנצנת לשטוף ולשאוב את המים הנותרים. לאחר מכן להחיל את פתרון הבדיקה הפעיל מוכן בשלב 3.1 (25 μl ל~ סעיף מ&quot;מ 10 x 10). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslip סעיפי דגירה במשך 15 דקות ב23 ° C. טובלים שקופיות במים כדי להסיר בעדינות coverslips. לשטוף במי 3x במשך 5 דקות כל אחד. </li></ol> 4. TSA איתותים שיפור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כסה סעיפי רקמות עם TNB חסימת חיץ שהוכן קודם לכן ודגירת שקופיות בחדר humidified ל30 דקות בטמפרטורת חדר (23 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דילול 1:100 של conjugates peroxidase streptavidin-החזרת (SA-HRP) בTNB חסימת מאגר. לשאוב TNBחסימת החיץ וליישם פתרון SA-HRP. דגירה שקופיות עם SA-HRP ל30 דקות בטמפרטורת חדר. השתמש נאות מגיב נפח כדי לכסות את קטע הרקמה, לכל סעיף בדרך 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות 3x עבור 5 דקות כל אחד במאגר TNT לשטוף (או PBS) בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דילול 1:50 של מניית tyramide fluorophore ב1x הגברה ממסה מהערכה. פיפטה הפתרון עובד tyramide fluorophore על כל שקופית. השתמש פתרון עובד מספיק כדי לכסות את קטע הרקמה, לכל סעיף בדרך 100 μl לחלוטין. הפוך פתרון עובד tyramide fluorophore מייד לפני כל תיוג. הפתרון לא ניתן לעשות שימוש חוזר, כך לבטל את כל חלק בשימוש שלו לאחר תיוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השקופיות בטמפרטורת חדר במשך 3 עד 10 דקות. לפקח על עליית הקרינה תחת מיקרוסקופ עד הרמזים הראשונים של מבנים שניתן לראות. מהר להמשיך לשטוף את הצעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות 3x עבור 5 דקות כל אחד במאגר TNT לשטוף (או PBS) בזמן t החדרemperature עם תסיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף את פתרון antifading עם DAPI וcoverslip. שים לב תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כדי להמחיש DAPI וקרינת FITC להשתמש בערכת מסנן להקה עוברת: D490/40 עירור FITC, פליטת 520/10; D360/40 DAPI עירור, פליטת 460/20, או דומה. </li></ol>

<ol><li>Jin, R., Yang, G., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+mechanisms+in+ischemic+stroke%3A+role+of+inflammatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells.</a> J Leukoc Biol. 87, 779-789 (2010).</li>
<li>Schilling, M., Besselmann, M., Müller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predominant+phagocytic+activity+of+resident+microglia+over+hematogenous+macrophages+following+transient+focal+cerebral+ischemia%3A+an+investigation+using+green+fluorescent+protein+transgenic+bone+marrow+chimeric+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice.</a> Exp Neurol. 196 (2), 290-297 (2005).</li>
<li>Faustino, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+cells+contribute+to+endogenous+brain+defenses+after+acute+neonatal+focal+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglial cells contribute to endogenous brain defenses after acute neonatal focal stroke.</a> J Neurosci. 31 (36), 12992-13001 (2011).</li>
<li>Thored, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+accumulation+of+microglia+with+proneurogenic+phenotype+concomitant+with+persistent+neurogenesis+in+adult+subventricular+zone+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Long term accumulation of microglia with proneurogenic phenotype concomitant with persistent neurogenesis in adult subventricular zone after stroke.</a> Glia. 57 (8), 835-849 (2009).</li>
<li>Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Janus-faced+microglia%3A+beneficial+and+detrimental+consequences+of+microglial+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis.</a> Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).</li>
<li>Samejima, K., Earnshaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trashing+the+genome%3A+Role+of+nucleases+during+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis.</a> Nat.Rev. Mol. Cell Biol. 6 (9), 677-688 (2005).</li>
<li>Minchew, C. L., Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+probes+detecting+the+phagocytic+phase+of+apoptosis%3A+enzyme-substrate+complexes+of+topoisomerase+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA.</a> Molecules. 16 (6), 4599-4614 (2011).</li>
<li>Shuman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+classes+of+DNA+end-joining+reactions+catalyzed+by+vaccinia+topoisomerase%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Two classes of DNA end-joining reactions catalyzed by vaccinia topoisomerase.</a> Sci. Rep. 267, 16755-16758 (1992).</li>
<li>TSA Fluorescence Systems. , Available from: 
 
 <a target="_blank" href="http://www.perkinelmer.com/CMSResources/Images/44-73609man_TSAFluorescenceSystems.pdf">http://www.perkinelmer.com/CMSResources/Images/44-73609man_TSAFluorescenceSystems.pdf</a> Forthcoming.</li>
<li>Barcia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK%2FCdc42-mediated+microglial+motility+and+gliapse+formation+lead+to+phagocytosis+of+degenerating+dopaminergic+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep.+%22%5BJournal%5D)">ROCK/Cdc42-mediated microglial motility and gliapse formation lead to phagocytosis of degenerating dopaminergic neurons in vivo.</a> Sci. Rep. . 2, 809(2012).</li>
<li>Didenko, V. V., Ngo, H., Minchew, C. L., Boudreaux, D. J., Widmayer, M. A., Baskin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+irreparable+ischemic+damage+in+brain+by+selective+labeling+of+double-strand+blunt-ended+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Visualization of irreparable ischemic damage in brain by selective labeling of double-strand blunt-ended DNA breaks.</a> Mol. Med. 8, 818-823 (2002).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

בסרטון הזה אנחנו מדגימים, בפורמט קטע רקמה, איך לתייג phagocytes הפעיל שמוות של תאים ברורים באיסכמיה המוחית המוקדים. הטכניקה המוצגת הינה הגישה הראשונה בי במיוחד תוויות רק אלה תאי פסולת הניהול שפקד את ופעיל לעכל גופות סלולריות. זה עושה את זה יתרון ביחס לשיטות קיימות אחרות לתיוג של תאי phagocytic, אשר אין להם יכולת זו. השיטה משתמשת בסמן כללי וסלקטיבית המבוססת על ה-DNA של פעילות phagocytic - גדילים כפולים, להקהות הפס...

שבץ איסכמי גורם לשינויים עמוקים ברקמת המוח שנפגעה. הוא יוזם מוות של תאים מסיבי, מה שמוביל להפעלה המהירה של תאי phagocytic תושב ממוצא microglial. הוא גם מגדיר את חדירה של מוח איסכמי על ידי סוגים שונים של phagocytes המקצועי דם נגזרות כוללים נויטרופילים, מקרופאגים, הדנדריטים, ותאי פיטום 1,2. הוא עדיין התלבט אם את התגובה הזאת לפגיעה איסכמית משחקת תפקיד חיובי או שלילי. למרות phagocytosis לאחר שבץ יכול להיות מועיל, כי זה מנקה את תאים מתים ומדכא דלקת, היא גם מייצרת מיני חמצן תגובתי רעילים המשפיעה על הישרדות עצבית ומחריפה את נזק לרקמות 1-5. בעוד מספר סוגים של תאי phagocytic לחדור מוח איסכמי, לא כולם להשתתף בפסולת ניהול על ידי האופפת גופות תא ופינית את הדרך לתהליכי התחדשות 1-3. CR זהeates דרישה לזיהוי סלקטיבי של תאי פסולת ניהול המבצעות סליקת phagocytic של מוות של תאים בשבץ מוחי. כאשר תאי הדמיה פסולת ניהול פעילים כזה, זה גם חשוב כדי לענות על השאלה של מידת יעילותם לבזות את גופות תא אפופות. השפלה היעילה ומלאה של ה-DNA של התא למות בphagocytosis היא חיונית משום שהוא מונע חיסון עצמי ושחרורו של חומר גרעיני פתולוגי 6. כאן אנו מציגים בדיקות חדשות העושות שימוש בהפסקות DNA ספציפיות כסמנים של תאי phagocytic פעילים. הפסקות חתימה אלה מיוצרות באופן בלעדי במהלך הפירוק של גרעינים נבלעו בתוך תאים פונקציונליים פסולת ניהול. לכן הבדיקות באופן סלקטיבי רק את תווית phagocytes כי לבלוע ולעכל באופן פעיל גופות סלולריות. הם גם מאפשרים התבוננות בעוצמה והשלמת פירוק ה-DNA לאחר הבליעה. הבדיקות מועילות בהערכות של אינטנסיביות וefficiency של פינוי phagocytic. הבדיקות חדשות מסתמכות על סמן שאינו מבוסס על חלבון ולכן יכולות להיות יתרון במיוחד במחקרים של שבץ, שבו נזק איסכמי נרחב יכול לשבש את המורפולוגיה תאית או לרוקן סמנים המבוססים על חלבונים, בעיקר בתוך אזור איסכמי הליבה. העיקרון של הטכניקה מוצג באיור 1. איור מציג בדיקות oligonucleotide בצורת סיכת ראש ligated ידי topoisomerase vaccinia האנזים (VACC TOPO) ל5&#39;OH DNA מסתיים נוצר על ידי lysosomal DNase השני במהלך עיכול ה-DNA 7.

<table><tbody><tr><td>Xylene</td><td>JT Baker</td><td>9490-22</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פרוטאינאז K</td><td>Roche</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>PBS Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>Vaccinia Topoisomerase I</td><td>Vivid Technologies</td><td></td><td>5 pmol/&mu; l מלאי</td></tr><tr><td>12-Base Overhang Suicide Oligonucleotide</td><td>IDT DNA</td><td></td><td>5'-AAG GGA CCT GCB GCA GGT CCC TTG ATA CGA TTC TA -3'; B &ndash; ביוטין-dT; 100 pmol/&mu; l מלאי ב-ddH2O&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>מתאם אוליגונוקלאוטיד</td><td>IDT DNA</td><td></td><td>5'-TAG AAT CGT ATC-3'; 100 pmol/&mu; l מלאי ב-ddH2O</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, PH 7.4</td><td>Lonza</td><td>51237</td><td></td></tr><tr><td>TSA, מערכת פלואורסצאין&nbsp;</td><td>פרקיןאלמר&nbsp;</td><td></td><td></td>NEL701A001KT</tr><tr><td>1 מ' NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td></td><td></td></tr><tr><td>טווין-20&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield עם DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>כיסויים</td><td></td><td></td><td>22 x 22 מ"מ או 22 x 40 מ"מ זכוכית או פלסטיק. כיסויי פלסטיק עדיפים במהלך התגובה, מכיוון שקל יותר להסיר אותם מהקטע.</td></tr><tr>קטעי <td></td><td></td><td>מוח של חולדה</td><td>מוח חולדה שנלקח 48 שעות לאחר רבייה של שבץ איסכמי כמתואר ב-Didenko et al11. 5-6 &mu; קטעים בעובי M שנחתכו מגושי רקמה קבועים בפרפורמלדהיד, משובצים בפרפין. השתמש בשקופיות טעונות ונקיות מראש.&nbsp;</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך</td><td>אולימפוס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מצלמת וידאו דיגיטלית ותוכנה</td><td>Micromax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תוכנה</td><td>Metamorph</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הערכת עמילות phagocytic של מוות של תאים בשבץ ניסויי על ידי בדיקות ניאון ligatable

Assessing Phagocytic Clearance of Cell Death in Experimental Stroke by Ligatable Fluorescent Probes

אנו מתארים גישת histochemical חדשה להדמיה של פינוי phagocytic באיסכמיה המוחית המוקדים. הגישה מאפשרת הלימוד של חיסול של תאים מתים בשבץ מוחי על ידי phagocytes פסולת הניהול של כל שושלת סלולרית. למרות מספר רב של תאים ממקורות שונים כי הם מסוגלים phagocytosis נמצאים במוח איסכמי, רק חלק מהם באופן פעיל לבלוע ולעכל את גופות תא. ההדמיה סלקטיבית, כימות והניתוח של פסולת ניהול phagocytic פעיל אלה מסייעים בהערכת תגובת המוח לאיסכמיה. ניקוי יעיל מוות של תאים חשוב להתאוששות מפציעה המוח איסכמי, כפי שהוא פותח את הדרך לתהליכי התחדשות שלאחר מכן. אי לנקות את הגופות יביאו לתגובה רעילה הנגרמת על ידי דנ&quot;א וחלבונים שאינם מושפלים. ההליך המתואר משתמש בבדיקות ניאון ligated אופן סלקטיבי על ידי topoisomerase נגיפי להפסקות DNA אופייניות המיוצרים בכל phagocytes במהלך היבלעותועיכול של תאים שניזוקו באופן בלתי הפיך על ידי איסכמיה. השיטה היא כלי חדש לחקירה של תגובת המוח לפגיעה איסכמית.

העיקרון של השיטה לתיוג phagocytes הפעיל פסולת ניהול מוצג באיור 1. סכמטי מוכיח כי תמורת זיהוי בשלושה שלבים. הצעד הראשון כולל הפעלת בדיקה (איור 1 א); בשלב השני הבדיקה הופעלה גבעול להפסקות DNA ספציפיות בסעיפי רקמות (איור 1 ג); השלב השלישי כולל הגברה אות ניאון (1D איור). בהסבר מפורט יותר, זיהוי הולך כדלקמן: 1. הפעלת בדיקה. לפני תגובת ...

אנו מציגים טכניקה חדשה לקרינה סלקטיבית בתיוג באתרו של תאי phagocytic פעילים, אשר ברור מעל גופות תא בשבץ מוחי. הגישה היא חשובה להערכת תגובת המוח לאיסכמיה כי רק חלק קטן מphagocytes נוכח במוח איסכמי להשתתף בפינוי של מוות של תאים.

הערכת עמילות phagocytic של מוות של תאים בשבץ ניסויי על ידי בדיקות ניאון Ligatable

We describe a new histochemical approach for visualization of phagocytic clearance in focal brain ischemia. The approach permits the study of elimination ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לסמן באופן סלקטיבי תאים פגוציים פעילים, המנקים גופות של תאים לאחר שבץ מוחי. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת הרכיבים לתגובת הגברת האות המבוססת על Tite. השלב השני הוא הכנת החתכים.בשלב הבא, תגובת הסימון מבוצעת באמצעות האנזים vaccinia, טופואיזומראז וגששים פלואורסצנטיים לא יציבים. השלב הסופי הוא הגברה של אות פלואורסצנטי מבוססת IDE. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי להעריך פינוי פגוציטי של תאים מתים בחתכי רקמה של איסכמיה מוקדית במוח.פינוי תאים מתים על ידי פגוציטים ממלא תפקיד חשוב בהחלמת המוח לאחר איסכמיה. השיטה המוצגת קובעת את יעילותו של תהליך זה על ידי סימון רק של אותם פגוציטים המסירים באופן פעיל תאים מתים. למרות ששיטה זו מספקת תובנות לגבי המוח האיסכמי, ניתן להשתמש בה גם כדי לחקור פגיעה איסכמית באיברים ורקמות אחרים.במקרים בהם פינוי חומצי של תאים מתים באמצעות FA הוא חשוב. למרות ששלב הגברת אות ה-IDE או ה-TSA מתרחש בשלב הסופי של הסימון, ההכנה לתגובה זו עשויה לארוך יותר משעה. לפיכך, נוח יותר להכין תחילה את ריאגנטים ה-TSA.השלב הראשון הוא הכנת תמיסת המלאי של fluoro four TYROM על ידי הוספת 300 microliters של DMSO לקבצי ריאגנט ה-tyrom הכלולים בערכת הסימון של ה-TSA. לאחר מכן, הכין את בופר השטיפה TNT כדי להמיס לחלוטין את ריאגנט החסימה. בעת הכנת בופר החסימה TNB, הוסף אותו לאט במנות קטנות תוך כדי ערבוב, וחמם את התמיסה בהדרגה ל-55 degrees Celsius.בבחישה רציפה, התמיסה תיראה חלבית ויש להביאה לטמפרטורת החדר לפני נטילת אליקוט; לאחסון לטווח ארוך יש לשמור את התמיסה בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. לצורך הליך זה, מכינים מראש סליידים על ידי הרכבת חתכים בעובי של 5 מיקרומטר, שנחתכו מרקמה מקובעת בפורמלין. ראשית, מטפלים בחתכים ב-xylene למשך 15 דקות, מבצעים רהידרטציה לחתכים באמצעות סדרה של שטיפות באתנול, ולאחר מכן שני שטיפות במים.בשלב הבא, הכינו את תמיסת העבודה של proteinase K על ידי דילול של תמיסת מלאי לריכוז של 50 µg/mL ב-PBS. החלק המורכב ביותר בניסוי זה הוא קביעת משך הזמן האידיאלי לעיכול באמצעות proteinase K; ייתכן ויהיה צורך בבקרה עם זמני עיכול קצרים או ארוכים יותר כדי להבטיח הצלחה, בהתאם לגודל ולסוג הרקמה. הוסיפו את הנפח המתאים של תמיסת העבודה של proteinase K לחתכים והדגירו למשך 15 דקות בטמפרטורה של 23 °C.לאחר הדגירה, שטפו את הנגדים במים מזוקקים פעמיים, למשך חמש דקות בכל פעם. בזמן שהנגדים מושרים, הכינו את תערובת הסימון המכילה את הגשש הפעיל. להכנת תמיסת הגשש הפעיל, ערבבו את האוליגנוקלאוטידים עם מים, one molar triss, HCL ואת ה-vaccinia topoisomerase המסופק בערכה באמצעות פיפוט עדין, ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות כדי לאפשר את הפעלת הגשש.לאחר תקופת השטיפה השנייה, הוציאו את החתכים מהצנצנת ושאבו את השאריות של המים. כאשר תהיו מוכנים, מרחו את תמיסת הגשש הפעילה שהוכנה קודם לכן כך שתכסה את הדגימות. החליקו את החתכים והדגירו אותם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 23 °C.לאחר הדגירה, טבל את השקופיות במים כדי להסיר בעדינות את זכוכית הכיסוי. שטוף את השקופיות במים שלוש פעמים למשך חמש דקות בכל פעם. לאחר השטיפה האחרונה, כסה את נתחי הרקמה בבופר חסימה TNB והדגר את השקופיות בתא לחות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.במהלך זמן זה, הכין מהיל של 1:100 של קונג'וגטים של סטריפטאווידין-HRP (S-A-H-R-P) בתוך חוצץ TNB. הוצא את השקופיות ושאב החוצה את חוצץ ה-TNB. לפני יישום תמיסת ה-S-A-H-R-P, השתמש בכמות ריאגנט מספקת כדי לכסות את כל נתח הרקמה.לאחר הכיסוי, דגרו את השקופיות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, שטפו את השקופיות שלוש פעמים, חמש דקות בכל פעם. בבופר שטיפה TNT, הכינו דילול של 1:50 של מלאי fluoro four TY IDE בדילול amplification diluent בריכוז 1x מיד לפני השימוש. טפטפו את התמיסה על השקופיות כך שתכסה לחלוטין את חתך הרקמה.מכיוון שלא ניתן להשתמש בתמיסה שוב, יש להשליך כל חלק שנותר שלא נעשה בו שימוש. יש להדגיר את השקופיות בטמפרטורת החדר למשך 3 עד 10 דקות. יש לנטר את הפלואורסצנציה.הגבירו את ההגדלה במיקרוסקופ עד שיופיעו הרמזים הראשונים למבנים. עברו במהירות לשלב השטיפה. שטפו את השקופיות שלוש פעמים למשך חמש דקות בכל פעם.בבופר TNT Wash בטמפרטורת החדר עם ערבוב. לאחר השטיפה, הוסף את תמיסת ה-anti fading עם DPI ומסך זכוכית (cover slip). בחן את התוצאות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה.תמונות אלו מציגות שתי דוגמאות של פינוי חומצי של PHA. צביעת הגרעין dappy מוצגת בפלואורסצנציה כחולה והגשושה הליאבילית vac topo מוצגת בפלואורסצנציה ירוקה. דיאגרמות של האירועים המוצגים בתמונות אלו מראות גרעינים של פגוציטים וגרעינים חיצוניים שנבלעו בשלבים שונים של עיכול. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בערך תוך שלוש שעות, אם היא מבוצעת כה properly.לאחר צפייה בסרטון זה, תדעו כיצד להשתמש בגששים פלואורסצנטיים חיים בחתכי רקמה. תוכלו גם לסמן באופן סלקטיבי תאים פעילים תוך סינון תאים מתים במוח איסכמי.

assessing-phagocytic-clearance-cell-death-experimental-stroke

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

בסרטון זה, אנו מדגימים את בדיקת האפרוציטוזיס כדי לחקור את פינוי התאים האפופטוטיים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. אפרוציטוזה היא תהליך רב-שלבי שבו תאים אפופטוטיים נבלעים על ידי פגוציטים ומתפרקים בתוך שלפוחיות הנקראות אפרוזומים. פרוטוקול זה מספק שיטה לדמיין חלקים מופנמים ולא מופנמים של תאים אפופטוטיים בודדים ולכמת אפרוציטוזה.

בדיקת אפרוציטוזה של תאים קבועים: שיטה לחקר ספיגה אפרוציטית של תאים אפופטוטיים על ידי מקרופאגים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

חקר Phagolysosome Biogenesis בהמקרופאגים בשידור חי

מיקרוגליה הם התאים חיסוניים תושב של מערכת העצבים המרכזית (CNS) עם קיבולת גבוהה לphagocytose או לבלוע את חומר בסביבה תאית שלהם. הנה, assay החלים רחב, אמין, וכמותי מאוד להדמיה ומדידת היבלעות בתיווך מיקרוגליה של רכיבים סינפטיים מתואר.

Assay היבלעות: פרוטוקול להעריך אינטראקציות בין מערכת העצבים המרכזית וPhagocytes נוירונים

phagocytosis microglial הוא קריטי לשמירה על הומאוסטזיס רקמות ותפקוד לקוי phagocytic הייתה מעורב פתולוגיה. עם זאת, להערכת תפקוד microglia in vivo מבחינה טכנית מאתגרת. פתחנו טכניקה פשוטה אך חזקה לניטור בדיוק וכימות פוטנציאל phagocytic של microglia בסביבה פיזיולוגית.

להערכת תפקוד רשתית microglial Phagocytic<em&gt; In vivo</em&gt; שימוש cytometry זרימה מבוסס Assay

אנו מציגים שיטות כדי להעריך את יכולת phagocytic של ראשי מאתר הנגזרות מח עצם מקרופאגים באמצעות פסולת מיאלין fluorescently שכותרתו השומנים תאיים droplet מכתים.

במבחנה Phagocytosis של המיאלין פסולת על ידי מקרופאגים הנגזרות מח עצם

Efferocytosis, הסרת phagocytic בתאים אפופטוטיים להיפגע, הוא נדרש כדי לשמור על הומאוסטזיס, בהנחייתם של רצפטורים, איתות המסלולים המאפשרים זיהוי, היבלעות של הפנמה של מוות תאים. במסמך זה, אנו מציגים מיקרוסקופ פלורסצנטיות פרוטוקול עבור כימות של efferocytosis וכן את פעילותם של efferocytic איתות המסלולים.

כימות של Efferocytosis על-ידי קרינה פלואורסצנטית תא בודד מיקרוסקופ

מחלות ניווניות קשורות לתפקודי מיקרוגליה דיסרגטיים. מאמר זה מתאר במבחנה של פאגוציטוזיס של תאי נוירובלסטומה על ידי iPSC-מקרופאגים. קריאות מיקרוסקופיה כמותית מתוארות הן עבור הדמיה בזמן-זמן של תאים חיים והן עבור הדמיה בעלת תוכן גבוה של תאים קבועים.

במבחנה הדמיה כמותית אסאי עבור פאגוציטוזיס של תאי נוירובלסטומה מתים על ידי iPSC-מקרופאגים

מודלים של חולדה in vivo הם כלים הכרחיים לחקירת המנגנונים הפתולוגיים והמטרות הטיפוליות לשבץ איסכמי. עבודה זו תתאר ביצוע צביעה אימונופלואורסצנטית בפרוסות מוח עם אוטם לאחר חסימת עורק המוח האמצעי (MCAO) בחולדות.

הערכת איתות מוות תאי על ידי אימונופלואורסצנציה במודל חולדה של שבץ איסכמי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להערכת תפקוד תאי החיסון לאחר שבץ איסכמי באמצעות ניתוח זרימה ציטומטרי במודל מיני שבץ. שיטה זו מאפשרת בחינה מפורטת של אינטראקציות נוירואימוניות וניתן להתאים אותה לחקר מחלות ניווניות אחרות, מה שמשפר את ההבנה שלנו לגבי תגובות חיסוניות בפתולוגיה של שבץ מוחי.

בידוד והערכה ציטומטרית של זרימה של אינטראקציות נוירואימוניות במודל עכברי מיני שבץ

פילמנטיות חסימה של עורק המוח התיכון הוא מודל משותף לחקר שבץ איסכמי בעכברים.

דוגמנות שבץ בעכברים - העורקים התיכון ספיגה מוחין עם דגם נימה

למד טכניקת סימון פלואורסצנטית לתאים פאגוציטיים פעילים המנקים תאים מתים לאחר שבץ מוחי. השיטה משתמשת במיקרוסקופיית פלואורסצנס להערכת יעילות הניקוי הפאגוציטי ברקמת מוח איסכמית ומסייעת להבנת מנגנוני ההתאוששות הנוירולוגית.

הערכת עמילות phagocytic של מוות של תאים בשבץ ניסויי על ידי בדיקות ניאון Ligatable

גלה סרטונים נוספים