הערכת עמילות phagocytic של מוות של תאים בשבץ ניסויי על ידי בדיקות ניאון Ligatable
27 במאי 2014
אנו מציגים טכניקה חדשה לקרינה סלקטיבית בתיוג באתרו של תאי phagocytic פעילים, אשר ברור מעל גופות תא בשבץ מוחי. הגישה היא חשובה להערכת תגובת המוח לאיסכמיה כי רק חלק קטן מphagocytes נוכח במוח איסכמי להשתתף בפינוי של מוות של תאים.
המטרה הכללית של הליך זה היא לסמן באופן סלקטיבי תאים פגוציים פעילים, המנקים גופות של תאים לאחר שבץ מוחי. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת הרכיבים לתגובת הגברת האות המבוססת על Tite. השלב השני הוא הכנת החתכים.
בשלב הבא, תגובת הסימון מבוצעת באמצעות האנזים vaccinia, טופואיזומראז וגששים פלואורסצנטיים לא יציבים. השלב הסופי הוא הגברה של אות פלואורסצנטי מבוססת IDE. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי להעריך פינוי פגוציטי של תאים מתים בחתכי רקמה של איסכמיה מוקדית במוח.
פינוי תאים מתים על ידי פגוציטים ממלא תפקיד חשוב בהחלמת המוח לאחר איסכמיה. השיטה המוצגת קובעת את יעילותו של תהליך זה על ידי סימון רק של אותם פגוציטים המסירים באופן פעיל תאים מתים. למרות ששיטה זו מספקת תובנות לגבי המוח האיסכמי, ניתן להשתמש בה גם כדי לחקור פגיעה איסכמית באיברים ורקמות אחרים.
במקרים בהם פינוי חומצי של תאים מתים באמצעות FA הוא חשוב. למרות ששלב הגברת אות ה-IDE או ה-TSA מתרחש בשלב הסופי של הסימון, ההכנה לתגובה זו עשויה לארוך יותר משעה. לפיכך, נוח יותר להכין תחילה את ריאגנטים ה-TSA.
השלב הראשון הוא הכנת תמיסת המלאי של fluoro four TYROM על ידי הוספת 300 microliters של DMSO לקבצי ריאגנט ה-tyrom הכלולים בערכת הסימון של ה-TSA. לאחר מכן, הכין את בופר השטיפה TNT כדי להמיס לחלוטין את ריאגנט החסימה. בעת הכנת בופר החסימה TNB, הוסף אותו לאט במנות קטנות תוך כדי ערבוב, וחמם את התמיסה בהדרגה ל-55 degrees Celsius.
בבחישה רציפה, התמיסה תיראה חלבית ויש להביאה לטמפרטורת החדר לפני נטילת אליקוט; לאחסון לטווח ארוך יש לשמור את התמיסה בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. לצורך הליך זה, מכינים מראש סליידים על ידי הרכבת חתכים בעובי של 5 מיקרומטר, שנחתכו מרקמה מקובעת בפורמלין. ראשית, מטפלים בחתכים ב-xylene למשך 15 דקות, מבצעים רהידרטציה לחתכים באמצעות סדרה של שטיפות באתנול, ולאחר מכן שני שטיפות במים.
בשלב הבא, הכינו את תמיסת העבודה של proteinase K על ידי דילול של תמיסת מלאי לריכוז של 50 µg/mL ב-PBS. החלק המורכב ביותר בניסוי זה הוא קביעת משך הזמן האידיאלי לעיכול באמצעות proteinase K; ייתכן ויהיה צורך בבקרה עם זמני עיכול קצרים או ארוכים יותר כדי להבטיח הצלחה, בהתאם לגודל ולסוג הרקמה. הוסיפו את הנפח המתאים של תמיסת העבודה של proteinase K לחתכים והדגירו למשך 15 דקות בטמפרטורה של 23 °C.
לאחר הדגירה, שטפו את הנגדים במים מזוקקים פעמיים, למשך חמש דקות בכל פעם. בזמן שהנגדים מושרים, הכינו את תערובת הסימון המכילה את הגשש הפעיל. להכנת תמיסת הגשש הפעיל, ערבבו את האוליגנוקלאוטידים עם מים, one molar triss, HCL ואת ה-vaccinia topoisomerase המסופק בערכה באמצעות פיפוט עדין, ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות כדי לאפשר את הפעלת הגשש.
לאחר תקופת השטיפה השנייה, הוציאו את החתכים מהצנצנת ושאבו את השאריות של המים. כאשר תהיו מוכנים, מרחו את תמיסת הגשש הפעילה שהוכנה קודם לכן כך שתכסה את הדגימות. החליקו את החתכים והדגירו אותם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 23 °C.
לאחר הדגירה, טבל את השקופיות במים כדי להסיר בעדינות את זכוכית הכיסוי. שטוף את השקופיות במים שלוש פעמים למשך חמש דקות בכל פעם. לאחר השטיפה האחרונה, כסה את נתחי הרקמה בבופר חסימה TNB והדגר את השקופיות בתא לחות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
במהלך זמן זה, הכין מהיל של 1:100 של קונג'וגטים של סטריפטאווידין-HRP (S-A-H-R-P) בתוך חוצץ TNB. הוצא את השקופיות ושאב החוצה את חוצץ ה-TNB. לפני יישום תמיסת ה-S-A-H-R-P, השתמש בכמות ריאגנט מספקת כדי לכסות את כל נתח הרקמה.
לאחר הכיסוי, דגרו את השקופיות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, שטפו את השקופיות שלוש פעמים, חמש דקות בכל פעם. בבופר שטיפה TNT, הכינו דילול של 1:50 של מלאי fluoro four TY IDE בדילול amplification diluent בריכוז 1x מיד לפני השימוש. טפטפו את התמיסה על השקופיות כך שתכסה לחלוטין את חתך הרקמה.
מכיוון שלא ניתן להשתמש בתמיסה שוב, יש להשליך כל חלק שנותר שלא נעשה בו שימוש. יש להדגיר את השקופיות בטמפרטורת החדר למשך 3 עד 10 דקות. יש לנטר את הפלואורסצנציה.
הגבירו את ההגדלה במיקרוסקופ עד שיופיעו הרמזים הראשונים למבנים. עברו במהירות לשלב השטיפה. שטפו את השקופיות שלוש פעמים למשך חמש דקות בכל פעם.
בבופר TNT Wash בטמפרטורת החדר עם ערבוב. לאחר השטיפה, הוסף את תמיסת ה-anti fading עם DPI ומסך זכוכית (cover slip). בחן את התוצאות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה.
תמונות אלו מציגות שתי דוגמאות של פינוי חומצי של PHA. צביעת הגרעין dappy מוצגת בפלואורסצנציה כחולה והגשושה הליאבילית vac topo מוצגת בפלואורסצנציה ירוקה. דיאגרמות של האירועים המוצגים בתמונות אלו מראות גרעינים של פגוציטים וגרעינים חיצוניים שנבלעו בשלבים שונים של עיכול. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בערך תוך שלוש שעות, אם היא מבוצעת כה properly.
לאחר צפייה בסרטון זה, תדעו כיצד להשתמש בגששים פלואורסצנטיים חיים בחתכי רקמה. תוכלו גם לסמן באופן סלקטיבי תאים פעילים תוך סינון תאים מתים במוח איסכמי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג טכניקת פלואורסצנציה חדשנית לסימון סלקטיבי של תאי פגוציטוזה פעילים המעורבים בפינוי שאריות תאים לאחר שבץ מוחי. שיטה זו היא קריטית להבנת תגובת המוח לאיסכמיה, שכן רק חלק קטן מהפגוציטים משתתפים בתהליך פינוי זה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי העצבים
- ביולוגיה של התא
- מיקרוסקופיית פלואורסצנציה
רקע
- פינוי פגוציטי של תאים מתים חיוני להחלמת המוח לאחר איסכמיה.
- רק תת-קבוצה של פגוציטים משתתפת באופן פעיל בתהליך זה.
- הבנת מנגנון זה עשויה לסייע בגיבוש אסטרטגיות טיפוליות.
- ניתן להחיל את השיטה המוצגת גם על איברים ורקמות אחרים.
מטרת המחקר
- פיתוח טכניקה לסימון סלקטיבי של פגוציטים פעילים.
- הערכת היעילות של פינוי פגוציטי ברקמת מוח איסכמית.
- מתן תובנות לגבי הדינמיקה של פינוי תאים מתים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת רכיבי תגובת הגברת האות המבוססת על Tite.
- תגובת סימון באמצעות vaccinia, טופואיזומראז וגששים פלואורסצנטיים.
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית להדמיות של תאים מסומנים.
- אופטימיזציה של זמני עיכול ב-proteinase K עבור חתכי רקמה.
תוצאות עיקריות
- סימון מוצלח של פגוציטים פעילים ברקמת מוח איסכמית.
- הדמיה של פעילות פגוציטית באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה.
- הדגמת התאימות של השיטה לרקמות אחרות.
- תובנות לגבי התזמון והיעילות של פינוי פגוציטי.
מסקנות
- הטכניקה שפותחה משפרת את ההבנה של תהליכי פגוציטוזה באיסכמיה.
- היא מספקת כלי בעל ערך לחקר מנגנוני פינוי תאים.
- יישומים עתידיים עשויים להתרחב למערכות איברים שונות המושפעות מאיסכמיה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
כימות סלקטיבי של פינוי פגוציטי פעיל בשבץ ניסיוני מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית של מסלולים נוירו-דלקתיים ומספק מידע לתיקוף מטרות עבור אסטרטגיות להתאוששות של ה-CNS. שיטה זו, המבוססת על גשש פלואורסצנטי ניתן לקישור, מספקת ביטחון חיזוי בהערכת היעילות של פגוציטים לניהול פסולת, ותומכת ברציפות תרגומית משלב הגילוי למחקר פרה-קליני. יכולתה להבחין בין פגוציטים פעילים לבלתי פעילים משפרת את קבלת ההחלטות לגבי תיקי תוכניות טיפוליות נוירו-פרוטקטיביות ורגנרטיביות.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה של מנגנוני פינוי פגוציטיים ברקמת מוח רלוונטית למחלה.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי הבחנה בין פגוציטים פעילים לבין תאים שאינם מעורבים בתהליך (bystanders).
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים במסלולים נוירו-דלקתיים ורגנרטיביים.
- מספק נתונים כמותיים לביטחון חיזוי בתוכניות CNS בשלבים מוקדמים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- מכין חתכי רקמה שעברו תיקוף עבור תהליכי עבודה של דימוי כמותי בהמשך.
- מנstandardize (מתקנן) את זיהוי אירועי פגוציטוזה פעילים לצורך קבלת תוצאות בדיקה הדירות.
- מאפשר סריקה ניתנת להרחבה (scalable) של מודולטורים המשפיעים על יעילות הפינוי הפגוציטרי.
- תומך בהערכה מהימנה של השפעות תרכובות על פינוי תאי מוות in situ.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים רלוונטיים למחלה של פגיעה איסכמית לצורך פיתוח ביומרקרים טרנסלציונליים.
- מספק רצף מגילוי מנגנוני ועד לתיקוף פרה-קליני של אסטרטגיות להתאוששות של ה-CNS.
- מסייע בקבלת החלטות על קידום מועמדים לנוירופרוטקציה ורגנרציה בהתאם לסיכונים.
- מציע הפחתת סיכונים חזויה עבור ליאביליות ביולוגיות בשלבים מאוחרים הקשורות לכשל בפינוי תאים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
שיטה זו משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות להערכה כמותית של פינוי פגוציטוטית במודלים של איסכמיה במוח, ובכך היא תומכת הן בתיקוף של מטרות טיפוליות והן בהלימה של ביומרקרים תרגומיים.
- ביולוגיה של התגליות: תומך בבדיקת השערות לגבי פינוי המתווך על ידי פגוציטים והבהרת מסלולים ברקע של רקמה איסכמית.
- סריקה: מספק תוצאות כמותיות וניתנות לשחזור של אירועי פגוציטוזה פעילים לצורך פיתוח בדיקות.
- אנליטיקה: מספק מדידות מבוססות פלואורסצנציה להשוואת יעילות הפינוי בין תנאים ניסיוניים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים מכניסטיים למודלים פרה-קליניים הרלוונטיים לפגיעה והחלמה במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר לחקר פינוי פגוציטי בהקשרים מגוונים של רקמות ומחלות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של כימות פינוי פגוציטי לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של go/no-go ויעילות הון על ידי הבהרת הסיכון הביולוגי בשלב מוקדם.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של תוכניות נוירו-דלקתיות וregenerative.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיית פלואורסצנציה ובהכנת חתכי רקמה.
- דורש גישה לריאגנטים ייעודיים, כולל גששים פלואורסצנטיים הניתנים לקישור וערכות אנזימים.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הסימון והדימיג לצורך הדירות.
- ניתן להתאמה לסוגי רקמות שונים, אך עשוי לדרוש אופטימיזציה של שלבי העיכול והסימון.
- תלוי בבקרה מדויקת של תגובות אנזימטיות ופרמטרי דימיג לקבלת תוצאות כמותיות.
