Name: הפעלה ומדידה של NLRP3 Inflammasome פעילות באמצעות IL-1β בתאים דנדריטים נגזרות מונוציטים אדם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: למדו כיצד למדוד פעילות של NLRP3 Inflammasome בתאים דנדריטים נגזרים ממונוציטים אדם באמצעות מדידת IL-1β. השיטה משתמשת ב-R848 לפריימינג ובניגריצין להפעלה, עם זיהוי באמצעות immunofluorescence, western blot ו-ELISA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להכיר אוליבייה Manches, Ph.D., דבור Frleta, Ph.D., וMeagan או &#39;בריין, MD לתמיכה והמשוב שלהם. מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחל מדבקות והושלם במימון NIH מענקי פרסים רות ל &#39;Kirschstein שירות הלאומי למחקר למלגות פרט predoctoral (F31) לקידום גיוון במחקר הקשורות לבריאות (AI089030) וRO1 (AI081848 ).

הצהרת אתיקה: דגימות מחקר מתקבלות ומאוחסנות למחקר בהסכמה של תורמים. צריכה להיות מקודדות כל הדגימות או אנונימי לפני השימוש. פרוטוקול זה עוקב אחר הקווים המנחים של דירקטוריון סקירה המוסדית שלנו. 1. בידול של האדם מונוציטים דם ההיקפיים לתאים דנדריטים מונוציטים נגזרו. הערה: מעילים באפי אדם משמשים כמקור של אדם תאי דם היקפי (PBMCs) והתקבלו ממרכז ניו יורק הדם (ניו יורק, ניו יורק). תורמי דם מתנדבים בריאים. ההליך של 5 הימים מתחיל בציפוי של תאים אנושיים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) על גבי תרבית רקמת צלוחיות 35,36. הבדלים ראויים לציון מהפרוטוקולים שפורסמו הם כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 225 סנטימטר 2 צלוחיות תרבית רקמת קלקר שאינו pyrogenic עם מכסה מסנן לדבוק כולל של 2x10 8 PBMCs לכל בקבוק במקום צלחת תרבית רקמת 10 קלקר סנטימטרs (58 סנטימטר 2) (שלב 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תקשורת עם 5% בסרום אדם (PHS; 30 מיליליטר) ונקווה ב500 מיליליטר RPMI-1640 + L-גלוטמין, חיץ 5 מיליליטר 1 M HEPES, ו1.4 מיליליטר 50 מ&quot;ג / מיליליטר גנטמיצין (5% תקשורת PHS) ואחרי סינון דרך סינון 20 מיקרומטר. להוסיף סך של 50 מיליליטר 5% תקשורת PHS ל225 סנטימטר בקבוק תרבות 2 רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים דבקים שלוש פעמים עם 25 מיליליטר RPMI-1640 טריים. לנער במרץ במשך 5 שניות בכל שטיפה ולשאוב תאים חסיד שאינם (שלב 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 190 μl של 400 IU / IL-4 ו380 μl μl של 100 IU / μl GM-CSF לכל בקבוק (שלב 3) ביום 0, 2, ו -4. יום 0 מוגדרת כPBMCs היום לראשונה מצופות בשלב 1 (שלב 8). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 moDCs יום קציר בריכוז של 1x10 6 תאי מיליליטר / (שלב 15). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש moDCs מייד במצב המנוחה שלהם. שלבי 17-22 הם מעולם לא ביצעו. הערה: דוגמאות צריכים להיות מעובד בהקדם האפשרי לאחר איסוף לתוצאות הטובות ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> moDCs aliquot בריכוזtion של 2x10 5 תאים / טוב (200 μl / טוב של 1x10 6 תאים / מיליליטר) ב96 צלחת גם עגול תחתית (כתם מערבי, ELISA, FACS) או על גבי chamberslide פולי-L-ליזין שטופל (מיקרוסקופית) לניסויים . שים לב: יש לפחות 4 תנאים: (בקרה שלילית) לחלוטין unstimulated, תחול רק, הפעלה בלבד, ותחול אחרי הפעלה. ניתן להרחיב תנאים לכלול פקדי diluent לR848 וnigericin אם תרצה בכך. אם assay במורד הזרם הוא ICS, כפילויות נחוצות לפקדי אלוטיפ. </li></ol> . 2 קרקע Inflammasome - 1 איתותים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש R848 lyophilized בDMSO על פי הוראות היצרן. לדלל המניה עובדת ב RT עם RPMI-1640. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת R848 בריכוז סופי 10 מיקרומטר לנכס בארות ל18 שעה. תאי מקום בחממה ב 37 ° C ו-CO 2 של 5%. </li></ol> 3 הפעלת Inflammasome NLRP3 -. איתותים2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש nigericin lyophilized באתנול על פי הוראות היצרן. לדלל המניה עובדת ב RT עם RPMI-1640 לפני הוספה לתנאים המתאימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת nigericin בריכוז סופי 20 מיקרומטר ולחזור לחממה ב 37 ° C ו 5% CO 2 למשך 6 שעות. אין שלבי כביסה להתרחש בין תחול ובמהלך ההפעלה. הערה: ההפרשה של IL-1β מוגברת על ידי הנוכחות של יונופורים סידן, brefeldin chlorophenylhydrazone, monensin, dinitrophenol, או ציאניד קרבוניל 37, 38. לכן, תוספת של מעכבי הפרשה אלה אינן מומלצים בעת ניתוח תחול או פעילות inflammasome שכן הוא ישנה את ההפרשה של IL-1β. </li></ol> 4. אוסף דוגמאות IL-1SS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את הצלחת עם תאים וsupernatants ב974 XG במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבלי להפריע לתא גלולה, לשאוב supernatant ולהעביר כלeparate עגול עם תחתית צלחת על מנת למדוד את הפרשת ציטוקינים מsupernatants. הערה: Supernatants ניתן לאחסן באופן זמני ב -20 מעלות צלזיוס או -80 ° C עבור אחסון לטווח ארוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את כדורים הסלולריים שלוש פעמים עם 200 μl של 1x PBS ב974 XG במשך 3 דקות כדי להסיר כל IL-1β תאיים מהדגימות הסלולריות. שים לב: כאשר שוטפים את כדורי תא מצלחת גם 96, להסיר לשטוף על ידי היפוך צלחת מהיר לפח אוסף, כדי לא להפריע לדוגמה. </li></ol> 5. מדידת IL-1SS מדוגמאות נייד וSupernatant <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאיים ציטוקין מכתים (ICS): פרוטוקול ICS מתואר להלן 39, 40. שים לב: אין להשעות את התאים אם assay במורד הזרם הוא מיקרוסקופית. צריכים לעשות את כל הכביסות והשאיפות מבלי להפריע את שכבת תאים / גלולה (תלוי בassay במורד). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של מדיה PHS 5% 100 μl לתוך בארות מתאימות. להוסיףנפח מתאים (כ 1 μl/2x10 5 תאים, או μl 1 / טוב) של כותרתו fluorescently α-CD11c וα-CD14 (סמני פנוטיפ; שיבוט B-ly6 וMφP9, בהתאמה) או שליטת אלוטיפ התאים 10 דקות ב RT בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים עם 1x PBS ב974 XG במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים על ידי הוספה של 4% PFA 100 μl עבור 20 דקות ב RT בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השהה פוינט: לשטוף עם 100 PBS μl 1x ב974 XG במשך 3 דקות ולאחסן ב 4 ° CO / N ב 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של חיץ permeabilization 100 μl לתאים ל30 דקות. הערה: חיץ permeabilization מורכב של 1x PBS עם 0.3% טריטון X-100, ו -1% אלבומין בסרום שור (BSA) לpermeabilization. נא לא להפריע תאים חסיד כאשר assay במורד הזרם הוא מיקרוסקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נפח מתאים (5 תאים כ 62 antibody/2x10 ng, כ או 2.5 μl / טוב) של α-IL-1β-FITC (שיבוט 8516) או שליטת אלוטיפ עבורשעה 2 באינקובטור ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים שלוש פעמים עם 200 μl של חיץ permeabilization ב974 XG במשך 3 דקות בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: כתם עם DAPI, להוסיף mountant, ומניח coverslip בעדינות על גבי שקופיות זכוכית. לאפשר mountant לרפא O / N לפני צילום תמונות במיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש את הנתונים על ידי FACS או במיקרוסקופ. הערה: השווה את אלוטיפ עבור כל תנאי לצביעה המתאימה בעת ניתוח על ידי FACS או במיקרוסקופ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> FACS: רוכשת את הדגימה אחת בכל פעם. הגדר את / שער SSC FSC בתאים חיים, ואחריו gating על CD11c + CD14 - תאים לפני ניתוח מכתים פרו-IL-1β אוכלוסיית moDC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוסקופית: הגדר את זמן החשיפה באמצעות מדגם מכתים החיובי - R848 שטופל. השתמש DAPI + פרו-IL-1β + וDAPI + פרו-IL-1β - כדי לקבוע אחוז פרו-IL-1β + moDCs להביע. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SDעמוד-S: immunoblotting מבוצע כדי לזהות פרו-IL-1β. הערה: הטכניקה המתוארת להלן משלבת טכניקה סטנדרטית immunoblotting, ג&#39;ל polyacrylamide 4-20% שיפוע, וגילוי ניאון או chemiluminescent 41, 42. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי Lyse ישירות ב10 μl denaturing מאגר תמוגה (5 μl β-mercaptoethanol/950 חיץ מדגם μl Laemmli אחרי דילול 1:01 עם חיץ תמוגה תא). העבר את lysate ל1.5 צינורות מיליליטר Eppendorf. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> lysate חום על צלחת יבשה 10 דקות ב 100 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין lysate ב20,800 XG על minicentrifuge דקות 1 לרכז את נפח הנוזל. השהה נקודה: אפשר להקפיא דגימות ב -20 ° C לאחסון לטווח קצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את הנפח הכולל על ג&#39;ל polyacrylamide. הפעל 140 V דרך תיבת ג&#39;ל למשך כ 1 שעות, או עד שצבען מול בורח תחתית הג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את החלבון מן ג&#39;ל polyacrylamide על membr PVDF Immobilon-FLane ל90 דקות ב100 V. בלוק הקרום עם BSA 5% בטריס בופר / 0.1% Tween-20 (TBS-T) במשך שעה 1. הערה: PVDF Immobilon-FL הוא הטוב ביותר לשימוש בזיהוי ניאון. קרום עם הרכב שונה מומלץ לטכניקות זיהוי אחרות כדי להגדיל את יחס האות לרקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל נוגדנים ראשוניים ומשניים ב10 מיליליטר של BSA 5% / TBS-T. בצע incubations נוגדן הראשוני על 4 מעלות CO / N תוך רעד ונוגדנים משני ב RT עבור שעה 1 ואילו רועדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הממברנה 3 פעמים עם TBS-T במשך 5 דקות תוך כדי הטלטול בין incubations נוגדן הראשוני והמשני ושוב בין incubations והדמיה משני. הערה: ניתן לאתר להקות באמצעות ניאון או זיהוי chemiluminescent. עקוב אחר ההוראות של היצרן לצורך זיהוי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ELISA: דוגמאות שהם קפואים לאחסון צריכה לאזן לRT לפני הניתוח. ספין למטה דגימות בצנטריפוגה כדי לגבש condens supernatantation. עקוב אחר ההוראות של היצרן למדידה של IL-1β. הערה: בפרוטוקול זה IL-1β נמדדים במיוחד; עם זאת, מדידה בו זמנית של TNFα, IL-6, וציטוקינים המערכת החיסונית IL-10 להבטיח את התנאים המתאימים היו דרוכים. </li></ol>

יש המחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

ציטוקינים דלקתיים הם חלק בלתי נפרד בהיגוי תגובת החיסון המולדת ובעלי כושר הסתגלות כדי להילחם בזיהום נגיפי. IL-1β מופרשים הוכח להגדיל בשפעת זיהום 3, 43, 44. המנגנון המדויק שבאמצעותו ציטוקינים אלה מעובדים בתגובה להכרה נגיפית בתאים הדנדריטים אנושיים אינם מובנה במלואם. ערכות בידוד DC מיאלואידית יקרות וזמן רב. ערכות בידוד ומיון FAC שלא בכוונה אולי מתח או להפעיל את התאים. בנוסף, יש לעתים קרובות כמות מספקת של תאים מבודדים לניסויים. למרבה המזל, את הביולוגיה של אדם moDCs דגמים מק...

הפעלה של מערכת חיסון מולדת נדרשת לנווט את התגובה חיסונית אדפטיבית במהלך זיהום, מחלה, וחיסון 7. תאים הדנדריטים הם אנטיגן החזק ביותר הצגה בתאים של מערכת החיסון המולדת; הם מתמחים לספיגה של אנטיגנים, הגירה לבלוטות הלימפה, והפעלה של CD4 + נאיבי וcytolytic CD8 + T-תאי 8-10. כדי לאפשר את גילוי פתוגן מהיר מערכת החיסון המולדת מנצלת קולטנים רבים germline מקודד זיהוי תבניות (PRR) שיכירו מוטיבים נגזרו הפתוגן שימור או סמני מארח נגזר של מתח תא ונזק. אגרה כמו קולטנים (TLRs) הן קולטנים זיהוי תבניות קרום מחויבים שמזהים פתוגן phagocytized תאי מסוים הקשורים דפוסים מולקולריים (PAMPs) ודפוסים מולקולריים סכנה קשורה (damps). על ידי הנהון ניגוד כמו קולטנים (NLRs) הם cytosolic ולהגיב למגוון רחב של PAMPs וdamps. תהנהן כמו קולטנים מחדשלהציג קו הגנה שני נגד פתוגנים המפרים את תא שטח וPRRs endocytic. האינטראקציה של הפתוגן נגזר, או &quot;סכנה&quot; קשורה, גורמים עם ligands TLR וNLR מובילים למצב של התבגרות DC וכתוצאה מאינטראקצית DC גדלה עם תאים אחרים של מערכת חיסון וקידום של תא T והפעלת תא הרג טבעי 11. אינטרלויקין 1β הוא מרכיב חיוני של ההגנה המארחת נגד זיהום. בעת ההכרה של מיקרואורגניזם, ציטוקינים מעודדי דלקת מאוד, IL-1β, מופרש ופונקציות כמו attractant הכימותרפיה וactivator של תאי מערכת החיסון מולדים ובעלי כושר הסתגלות. בvivo IL-1β היא אחראית במידה רבה לתגובת השלב החריף, כולל חום וציטוקינים דלקתיים סינתזה 12. רוב NLRs מכיל תחום חוזר עשיר לאוצין מסוף C שהוא חשב לתפקד בחישת יגנד, תחום מרכזי נוקלאוטיד מחייב (נכט) שהוא important לoligomerization NLRP3, ותחום N מסוף מפעיל (PYD בNLRP3) שמתווך הולכים אותות למטרות במורד דרך אינטראקציות חלבון חלבון. חלבון NLRP3 מגדיר מורכב inflammasome הנחקר ביותר בעוצמה. חלבון זה הוא חבר של משפחת NLR ויש לו את היכולת ליצור חלבונים מורכבים מולקולרי רב מורכב מNLRP3, PYCARD חלבון מתאם (הידוע גם בASC), וקרח. עם הפעלת inflammasome PYCARD נקשר לתחומים מסוף NLRP3 N ומגייס ICE באמצעות הפעלת caspase ותחום גיוס תחומים (כרטיס). המרת אנזים אינטרלויקין 1 בתחילה נוצר כאב תסס מכיל מוטיב כרטיס בN-הסופית שלה. תוצאות היווצרות Inflammasome בהבאת שתי מולקולות ICE מספיק קרובה כדי לגרום להפעלת זירוזם. מורכב inflammasome הוא הכרחי להפעלת ICE ובכך מאפשרת לו להמיר-IL-1β פרו cytoplasmic להבשיל ציטוקינים. הפרשה מוצלחת של IL-1β בDCs דורש חישה של שני אותות סכנה שונים ועצמאיים. ראשית, חישת TLR של PAMPs, damps, או ציטוקינים איתות (TNFα או IL-1β) גורמת להגברת ביטוי של ביטוי חלבון פרו IL-1β-cytoplasmic. שנייה, לעתים קרובות שונה, אות נדרשת להיווצרות מורכבת inflammasome במעלה הזרם של התבגרות ICE. Inflammasome כמה מגרה אותות כוללים רעלים נקבוביות קרום חיידק יוצרים (כגון nigericin), גבישי lysosomal שיבוש (כגון גבישי urate גלוטמט, MSU), וה-ATP תאי. המנגנון נגד הזרם המוביל לNLRP3 הפעלת inflammasome ידי מפעילים המגוונים אלה אינם ברור. מחקרים חוקרים במעלה הזרם איתות של היווצרות inflammasome מציע כי אירועים תאיים, כגון אינדוקציה של היפוקלמיה או מיני חמצן תגובתי (ROS) בעקיפין להפעיל inflammasome 13-28. בקרב המפעילים נגיפיים השונים של inflammasome NLRP3 היא שפעת, המספקת בOTH האות הראשונית ומשנית הנדרשת להפרשה IL-1β 3, 29-33. באמצעות מודלים נוקאאוט NLRP3 עכבר נמצא כי הפרשת IL-1β בDCS היא NLRP3 תלויה 32. בנוסף, עכברי נוקאאוט NLRP3 נמשכים פחות לויקוציטים לאתר של זיהום וחוו תמותה גבוהה יותר 2, 5. שני מאמרים אחרונים מציעים מנגנון להפעלת inflammasome NLRP3 במהלך זיהום בנגיף שפעת; הראשון, תחול באמצעות הכרה של רנ&quot;א הנגיפי על ידי TLR7 או TLR8 (תלוי בביטוי TLR של התא להגיב) או באמצעות חישה של חיידקי commensal ידי TLRs האחר כדי לגרום ביטוי פרו IL-1β-cytoplasmic, ואחריו אות שנייה, הפעלה של NLRP3 היווצרות inflammasome ידי חלבון ערוץ יון הנגיפי M2 ברשת טרנס גולג&#39;י 33, 34. בשלב האחרון, מפעילה של inflammasome NLRP3 מושגת על ידי הפרעה של יונית תאיים &lt;em&gt; הסביבה המובילה לייצור ROS, שהוא, בפשטות, חש ידי NLPR3 כאות ליצירת inflammasome. עם זאת, המנגנון המדויק של מעלה זרם הפעלת inflammasome פעילות ICE במהלך זיהום שפעת עדיין אינו ברור. עבודה זו מתארת ​​טכניקת ערך ללימוד inflammasome NLRP3 בmoDCs אדם שיכול לשמש כבסיס לחקירה נוספת של המסלול שבבסיס DC מבוסס הפרשת IL-1β בתגובה לקשירת TLR8 עם R848 ואחרי הפעלה של inflammasome ידי כן activator הידוע של NLRP3, nigericin. וריאציות של שיטה זו ניתן להשתמש בסוגי תאים אחרים, כולל, אך לא מוגבלת ל: מונוציטים, מקרופאגים, תת DC אחר, ותאי אפיתל.

<table><tbody><tr><td>IL-4</td><td>מו"פ D</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>Genzyme</td><td>NDC 58468-0180-2</td><td>אנו רוכשים פריט זה דרך בית המרקחת המקומי שלנו עם מרשם</td></tr><tr><td>RPMI 1640 עם L-גלוטמין</td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>תאים חד-גרעיניים בדם היקפי</td><td>מרכז</td><td></td><td>הדם של ניו יורק PBMCs בודדו מדמם של תורמים בריאים</td></tr><tr><td>12 צלחות תרבית רקמות באר</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>96 לוחות תרבית רקמה תחתונה עגולים היטב</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-IL-1&beta;-FITC</td><td>R& D</td><td>IC201F</td><td></td></tr><tr><td>FITC איזוטיפ בקרת</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-213</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-&beta;-tubulin</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9014</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-IL-1&beta;</td><td>מו"פ D</td><td>mab201</td><td></td></tr><tr><td>PVDF Immobilon-FL ממברנה</td><td>Millipore</td><td>IPFL00010</td><td></td></tr><tr><td>שיפוע 4-12% ג'ל פוליקרילאמיד</td><td>Bio Rad</td><td>161-1159</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli מאגר דגימה</td><td>Bio Rad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Equitech Bio Inc</td><td></td><td>30% תמיסה סטרילית/מסוננת</td></tr><tr><td>PFA</td><td>מיקרוסקופיה אלקטרונית מדעי</td><td>15710</td><td>16% פתרון</td></tr><tr><td>ערכת מערך חרוזי ציטוקינים דלקתיים אנושיים</td><td>BD</td><td>551811</td><td></td></tr><tr><td>ניגריצין Invivogen</td><td></td><td>tlrl-nig</td><td></td></tr><tr><td>R848</td><td>3M Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-CD14</td><td>BD</td><td>340436</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>TBS</td><td></td><td></td><td>באתר חדר מלאי</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287-100mL</td><td></td></tr><tr><td><a>Nunc EasYFlask 225 ס"מ2, מכסה מסנן, נפח עבודה 70 מ"ל, 30/Cs</a></td><td>Thermo מדעי</td><td>159933</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; M יחידות סינון חד פעמיות סטריליות</td><td>Thermo Scientific</td><td>569-0020</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>עז &alpha;-עכבר IRDye 800CW</td><td>Licor</td><td>926-32210</td><td></td></tr><tr><td>חמור &אלפא ארנב IRDye 680RD</td><td>Licor</td><td>926-68073</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרה צבעוני סולם חלבון רחב טווח</td><td>Thermo Scientific</td><td>26634</td><td></td></tr><tr><td>טריס גליצין SDS 10x</td><td>ביו ראד</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>טריס גליצין 10x</td><td>ביו ראד</td><td>161-0734</td><td></td></tr><tr><td>מתנול - 4 ליטר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A433P-4</td><td></td></tr><tr><td>8 תאים תרבית רקמת כלי פוליסטירן מטופלת שקופית זכוכית</td><td>BD פלקון</td><td>354108</td><td></td></tr><tr><td>פולי-ליזין</td><td>סיגמא</td><td>P4707</td><td></td></tr></tbody></table>

הפעלה ומדידה של nlrp3 inflammasome פעילות באמצעות il-1β בתאים דנדריטים נגזרות מונוציטים אדם

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

תהליכים דלקתיים כתוצאה מההפרשה של אינטרלויקין (IL) -1 ציטוקינים על ידי תאי מערכת החיסון משפחה להוביל לדלקת מקומית או מערכתית, שיפוץ ותיקון רקמות, ושליטה virologic 1, 2. אינטרלויקין 1β הוא מרכיב חיוני של תגובת החיסון המולדת ותורמים לחיסול פולש פתוגנים תוך מניעת הקמתה של זיהום המתמשך 1-5. Inflammasomes הוא פלטפורמת האיתות המרכזית להפעלה של אנזים אינטרלוקין 1 המרה (ICE או caspase-1). Inflammasome NLRP3 דורש לפחות שני אותות בDCs לגרום להפרשת IL-1β 6. ביטוי חלבון Pro-IL-1β מוגבל ב נח תאים; לכן אות תחול נדרש לשעתוק IL-1β וביטוי חלבון. אות שנייה חשה ידי תוצאות NLRP3 בהיווצרות inflammasome NLRP3 חלבון רב. היכולת של תאים הדנדריטים לresponד לאותות הנדרשים להפרשת IL-1β ניתן לבדוק באמצעות פורין סינטטי, R848, אשר חש ידי TLR8 במונוציטים אדם נגזרים תאים דנדריטים (moDCs) לתאי ראש, ואחרי הפעלה של inflammasome NLRP3 עם רעלן החיידק ו ionophore אשלגן, nigericin. DCs נגזר מונוציטים מיוצרים בקלות בתרבות ולספק יותר באופן משמעותי מאשר תאי DCs מיאלואידית האנושית מטוהר. השיטה המוצגת כאן שונה ממבחני inflammasome אחרים בכך שהוא משתמש באדם חוץ גופית, במקום עכבר נגזר, DCS ובכך מאפשר לחקר inflammasome במחלות וזיהומים אנושיים.

טכניקות אלה מודדים TLR8 תחול עם R848. מכתים ציטוקינים תאיים לפרו-IL-1β מאפשר למיקרוסקופיה וFACS קריאות מCD14 - CD11c + moDCs. ניתן לכמת את שני הטכניקות ביחס למי שאינו דרוך, או מנוחה, בקרת תא, כמו גם שליטת אלוטיפ (איורים 1 ו -2). אחוזים של תאים פרו-IL-1β + צביעה מוכפל בחציון הגיאומטרי של אוכלוסייה זו כדי לספק את עוצמת הניאון החציונית (MFI). MFI ניתן להשוות לסכום של Pro-IL-1β הווה בתאים מכתים החיוביים. <p class="jove_content" sty...

תאים דנדריטים (DC) להפריש IL-1β בתגובה להכרה TLR8 של פורין הסינתטי, R848, ואחרי הפעלת inflammasome NLRP3 עם nigericin, ולכן, IL-1β יכולים לשמש למדידת פעילות inflammasome NLRP3. צביעה תאית ציטוקינים, immunoblotting, וELISA משמשים למדידת inflammasome NLRP3 תחול והפעלה באמצעות ביטוי IL-1β במדויק.

הפעלה ומדידה של NLRP3 Inflammasome פעילות באמצעות IL-1β בתאים דנדריטים נגזרות מונוציטים אדם

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

המטרה הכללית של הניסויים הבאים היא לצפות בפעילות אינפלאסומית בתאי דנדריטיים אנושיים in vitro באמצעות בדיקות קריאה פשוטות של IL-1β. ראשית, יש להוסיף R848 לתאים כדי להשרות ביטוי תוך-תאי של pro-IL-1β. לאחר מכן, יש להוסיף nigericin כדי להפעיל את היווצרות האינפלאסומ NLRP3.תהליך זה מפעיל בתורו את השסוע של pro IL-1β ל-IL-1β בוגר לפני הפרשתו. לאחר מכן, אספו את הדגימות ומדדו את רמות ה-pro IL-1β התוך-תאיים ואת תוצאות ה-IL-1β הבוגר החוץ-תאיים, שהושגו על ידי מדידת הפרשת IL-1β מתאים שעברו priming והפעלה באמצעות אימונופלורסנציה, western blot ו-ELISA. גילוי זה מדגים כי priming של תאי DCs אנושיים מוביל לייצור תוך-תאי של pro IL-1β בתאים שעברו priming עם R848, ולהפרשה של IL-1β מתאים שעברו גם priming וגם הפעלה באמצעות nigericin.שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי תפקידו של האינפלמסום NLRP3 בתגובת תאי דנדריטיים אנושיים לליגנדים סינתטיים. ניתן ליישמה גם במערכות אחרות שנועדו לבחון טריגרים פיזיולוגיים כגון חיידקים, נגיפים ומחלות אוטואינפלמטוריות. העבירו מניה (aliquot) של 200 µL של תאים דנדריטיים המופקים ממונוציטים שבודדו טרי, במצב מנוחה, לפלטה בעלת 96 בארות עם תחתית עגולה.התחל עם ארבעת התנאים הסטנדרטיים של ביקורת שלילית ללא גירוי, פריימינג בלבד, אקטיבציה בלבד, ופריימינג ולאחריו אקטיבציה. לאחר מכן, בהתאם למערך הניסוי, הוסף ביקורות מדלול עבור R 8 48 ו-nissin; עבור בדיקות של צביעה תוך-תאית של ציטוקינים בהמשך, כלול כפילויות עבור ביקורות האיזוטייפ להפעלת הפריימינג של האינפלאסום. הוסף R 8 48 בריכוז סופי של 10 micromolar לבארות המתאימות.העבירו את התאים לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO2 למשך 18 שעות. לאחר מכן, להפעלת האינפלאסוזום NLRP3, הוסיפו nigericin בריכוז סופי של 20 µM. החזירו את התרביות לאינקובטור לשישה שעות נוספות. כדי לאסוף את הדגימות, סבבו את פלטת התרבית בצנטריפוגה ב-974 ×g למשך שלוש דקות, תוך הקפדה על אי-הפרעה למשקעי התאים.העבירו כל עליית נוזל (supernatant) לצלחת תחתית עגולה נפרדת לצורך מדידת הפרשת ציטוקינים בשיטת EISA. כעת שטפו את משקעי התאים שלוש פעמים עם 200 µL של XPBS כדי להסיר IL-1β חוץ-תאי מדגימות התאים לצורך ניתוח נוסף במגוון טכניקות; לגילוי pro-IL-1β בשיטת western blot, בקעו את התאים ישירות ב-10 µL של תמיסת ליזיס דנטורציה (denaturing lysis buffer). לאחר העברת הליזאטים לשפופרות אפנדורף של 1.5 mL, חממו את הדגימות במשך 10 דקות ב-100 °C לצורך גילוי פלואורסצנטי של IL-1β באמצעות ציטומטריית זרימה.הוסף 100 µL של מצע 5%PHS לדגימות התאים ו-1 µL של נוגדנים המסומנים פלואורסצנטית לסמני הפנוטיפ או בקרת isotype, והדגרה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחשיכה. לאחר שלושה שטיפות PBS, קבע את התאים עם 100 µL של 4%PFA למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר בחשיכה. לאחר מכן, הוסף 100 µL של בופר חדירות (permeable buffer) למשך 30 דקות, ולאחריו 62 ng של נוגדן anti IL one beta FSE או בקרת isotype; הדגר את הדגימות למשך שעתיים ב-37 °C.שטפו את התאים שלוש פעמים עם 200 µL של בופר חדיר (permeable buffer) ותלו אותם שוב ב-XPBS אחד. עטפו את הדגימות בנייר אלומיניום ושמרו בטמפרטורה של 4 °C. לצורך זיהוי IL-1β באמצעות מיקרוסקופיה, צבעו את התאים ב-DAPI, הוסיפו Medium וניחו בעדינות זכוכית כיסוי על גבי למסת זכוכית.הנח לדגימה להתייצב למשך הלילה לפני לקיחת תמונות מיקרוסקופיות לזיהוי פלואורסצנטי באמצעות ציטומטריית זרימה. רכוש נתונים מדגם אחד בכל פעם. הגדר את השערים של הפיזור הקדמי והצדי (forward and side scattered gates) על תאים חיים. הגדר את השער הבא על תאים חיוביים ל-CD 11 C ושליליים ל-CD 14.לבסוף, נתח את אוכלוסיית ה-MODC על בסיס צביעת pro IL one beta ברכישת נתוני מיקרוסקופיה. הגדר את זמן החשיפה באמצעות הדגימה שעובדה עם R 8 48 שגילתה צביעה חיובית. לאחר מכן, קבע את אחוז ה-MO dcs המבטאים pro IL one beta לצורך זיהוי ב-western blot.טען את נפח הדגימה הכולל על ג'ל פוליאקרילאמיד. הרץ במתח של 140 volts עד להגעה של חזית הצבע לקצה הג'ל. העבר את החלבון מג'ל הפוליאקרילאמיד לממברנת A-P-V-D-F immo on FL.חסמו את הממברנה באמצעות 5% BSA ב-TBST למשך שעה אחת. דגרו עם הנוגדן הראשוני תוך כדי ניעור בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך לילה. לאחר שלושה שטיפות של חמש דקות ב-TBST, דגרו עם הנוגדן המשני בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת; לאחר שלוש שטיפות TBST נוספות, דמיינו את הממברנה. בעת מדידת ציטוקינים מוקרשים באמצעות ELISA, הביאו את הדגימות לשיווי משקל בטמפרטורת החדר.סובבו את הדגימות בצנטריפוגה כדי לרכז את עיבוי הנוזל העליון (supernatant) ופעלו לפי הוראות היצרן למדידה של IL-1β. צביעה תוך-תאית של cytokine עבור pro IL-1β מאפשרת מיקרוסקופיה וקריאות נתונים מתאי דנדריטיים המופקים ממונוציטים, שהם CD11c-positive ו-CD14-negative. ניתן לכמת את שתי הטכניקות ביחס לבקרת תאים שאינם מעוררים (non-prime) או תאים במצב מנוחה, וכן ביחס לבקרת isotype. אחוז התאים הצבועים עבור pro IL-1β מוכפל בחציון הגאומטרי של אוכלוסייה זו כדי לספק את עוצמת הפלואורסצנציה החציונית (median fluorescent intensity).ה-MFI תואם לכמות ה-pro IL-1β שנמצאת בתאים הצבועים חיובית. כאן, נעשה שימוש בטכניקות של Immuno blotting כדי למדוד את רמות ה-pro IL-1β מליזאטים של תאים. נתונים כמותיים מבוטאים ביחס לבקרת תאים פנימית, כגון beta tubulin, כפי שצפוי.בדיקת אימונו-בלוטינג (Immuno blotting) של pro IL one beta בתאים שעובדו עם NI Nigerian מעלה ירידה ברמות ה-pro IL one beta. ממצא זה נתמך על ידי עלייה מקבילה של IL one beta בתעלילים (supernatants), שנמדדה באמצעות E ELI a בלבד ב-R 8 48, ולאחר מכן בתנאי NI Nigerian. מדידה סימולטנית של ציטוקינים דלקתיים אחרים כגון T NF alpha, IL 10 ו-IL six מבטיחה כי Niger גורם באופן ספציפי להפרשת IL one beta.רמת ההפעלה המקדמת (priming) תלויה בזמן ובמינון. ניסויים נוספים, כגון מדידת ריכוז חלבון חוץ-תאי, גילוי כימילומניסנציה של IL-1β בוגר או חסימה של האינפלאסום, יעזרו לקבוע האם ה-IL-1β החוץ-תאי הוא הצורה הבוגרת והמנוגבת, והאם הפרשת IL-1β תלויה בפעילות של אינפלאסום NLRP3.

activation-measurement-nlrp3-inflammasome-activity-using-il-1-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אנו מתארים immunoassay פשוט למדוד את הייצור של ציטוקינים דלקתיים הפרו, כגון ייצור IL-1 בטא, בחולים עם הצגת פנוטיפים autoinflammatory. על ידי הפעלת התאים בתרביות דם שלם עם הפתוגן הקשורים דפוסי מולקולרית, במיוחד עם lipopolysaccharide, הפרשת ציטוקינים ניתן להעריך בנוחות supernatants הדם כולו.

מדידה מדויקת ופשוטה 1β-IL Pro-ציטוקין דלקתי באמצעות גירוי Assay Whole Blood

אנו מתארים שימוש בטכנולוגיה ImageStream...

הדמיה כמותי של שושלת ספציפית חיוג כמו קולטן בתיווך איתות מונוציטים ותאים דנדריטים של דגימות קטנות של דם אנושי

סרטון זה מדגים שיטה לזיהוי הפעלה דלקתית של NLRP3 במקרופאגים באמצעות בדיקות כתב פלואורסצנטי. התאים מטופלים ביונופורים של אשלגן וגליצין כדי לגרום להרכבה דלקתית ולהפעלת קספאז-1. גשושיות כתב פלואורסצנטיות מדמיינות קספאז-1 פעיל, ותאים מוכתמים בצבע פלואורסצנטי להדמיית גרעינים.

זיהוי הפעלה דלקתית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

סרטון זה מדגים טכניקה לחקר היווצרות קולטנים דמויי NOD ממשפחת הקולטנים פירין המכילים 3 (NLRP3) במקרופאגים ראשוניים באמצעות אימונופלואורסנציה. המקרופאגים מקבלים תחילה ליפופוליסכריד חיידקי (LPS) כדי לווסת את ביטוי החלבון NLRP3. חשיפת המקרופאגים לניגריצין – אשלגן יונופור – מובילה להפעלת NLRP3 ולהיווצרות של דלקתיות, אשר מודגמות באמצעות אימונופלואורסנציה.

טכניקת מבחנה לחקר היווצרות קומפלקס דלקתי במקרופאגים

פרוטוקול זה מציג שיטה יעילה ואמינה לtransfect מקרופאגים THP-1 אנושיים עם siRNA או DNA פלסמיד על ידי electroporation עם יעילות transfection גבוהה תוך שמירה על חיוניות תא גבוהה ויכולת מקרופאג מלאה לבידול וקיטוב.

Transfection יעיל ביותר של של אדם המקרופאגים THP-1 על ידי nucleofection

פרוטוקול נוכחי זה משתמש במדווחים פלואורסצנטיים, תיוג in vivo וטכניקות הדמיה תוך-חיוניות כדי לאפשר ניטור של התהליך הדינמי של תחול נויטרופילים בבעלי חיים חיים.

הדמיה Intravital של Priming נויטרופילים שימוש IL-1β מונחה יזם עכברים Reporter DsRed

נגזר מונוציט DC (MoDC) יכול לחוש כמויות זעירות של מולקולות הקשורות סכנה, ולכן טענתי בקלות. אנו מספקים פרוטוקול מפורט בידודו של MoDC של דם וגידולים שלהם הפעלה עם מכלולים חיסוניים תוך הדגשת מפתח הזהירות הנחשבות על-מנת למנוע הפעלה מוקדמת שלהם.

בידוד פרוטוקול של העכבר נגזר מונוציט תאים דנדריטים והפעלה שלהם עוקבות במבחנה עם מכלולים חיסוניים הגידול

אנו מתארים את הגילוי של הפעלת inflammasome NLRP3 על בסיס הסלולר באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות, צביעת עבור קספאז פעיל-1 ואת המתאם, עולה. Assay שחרורו לקטט דהידרוגנאז מוצג כדי לזהות פירוק pyroptotic על בסיס האוכלוסייה. טכניקות אלו ניתן להתאים ללמוד היבטים רבים של ביולוגיה inflammasome.

זיהוי של Inflammasome ההפעלה ומוות תא Pyroptotic של מקרופאגים הנגזרות מח עצם מאתר

MALT1 מסדיר מולדת חסינות אך איך זה מתרחש נשאר מעורפל. השתמשנו החומר המדכא paracaspase סלקטיבית MALT1 הטכנולוגי-827 לפענח את התרומה של MALT1 איתות מולדת במורד הזרם של קולטני לקטין דמוי כמו אגרה או C-type, הוכחת MALT1 מסדיר את הייצור של תאים מיאלואידים ציטוקינים, ויוצאת של קולטני לקטין דמוי C-type, באופן סלקטיבי.

תאים מיאלואידים מולדת איתות לשביל רגולציה על-ידי פעילות Paracaspase MALT1

פרוטוקול זה מספק לחוקרים עם שיטה מהירה, עקיפה של מדידת tlr תלויי-NF-кb/AP-1 הפעילות שעתוק בשורה מקרופאג cell מורה בתגובה למגוון של משטחים פולימריים ושכבות חלבון נספחת כי המודל ביומיהמיקרוסביבה השתל ביומטריה.

תא עיתונאי מקרופאג שיטה לבחון קולטן שיחת כמו-תיווך NF-kB/AP-1 איתות על שכבות חלבון Adsorbed על משטחים פולימריים

פרוטוקול זה מתאר את זרימת העבודה להשגת מקרופאגים שמקורם במונוציטים (MDM) מדגימות דם אנושיות, שיטה פשוטה להחדרה יעילה של כתבי השלמה פלואורסצנטית דו-עינית (BiFC) של קספאזה דלקתית ל-MDM אנושי מבלי להתפשר על הכדאיות וההתנהגות של התאים, וגישה מבוססת הדמיה למדידת הפעלת קספאזה דלקתית בתאים חיים.

הדמיה של קספאזות דלקתיות המושרות קרבה במקרופאגים שמקורם במונוציטים אנושיים

למדו כיצד למדוד פעילות של NLRP3 Inflammasome בתאים דנדריטים נגזרים ממונוציטים אדם באמצעות מדידת IL-1β. השיטה משתמשת ב-R848 לפריימינג ובניגריצין להפעלה, עם זיהוי באמצעות immunofluorescence, western blot ו-ELISA.

הפעלה ומדידה של NLRP3 Inflammasome פעילות באמצעות IL-1β בתאים דנדריטים נגזרות מונוציטים אדם

גלה סרטונים נוספים