הפעלה ומדידה של NLRP3 Inflammasome פעילות באמצעות IL-1β בתאים דנדריטים נגזרות מונוציטים אדם

תאים דנדריטים (DC) להפריש IL-1β בתגובה להכרה TLR8 של פורין הסינתטי, R848, ואחרי הפעלת inflammasome NLRP3 עם nigericin, ולכן, IL-1β יכולים לשמש למדידת פעילות inflammasome NLRP3. צביעה תאית ציטוקינים, immunoblotting, וELISA משמשים למדידת inflammasome NLRP3 תחול והפעלה באמצעות ביטוי IL-1β במדויק.

המטרה הכוללת של הניסויים הבאים היא לצפות בפעילות דלקתית בתאים דנדריטיים אנושיים במבחנה באמצעות מבחני קריאה פשוטים של IL one. ראשית הוסף R 8 48 לתאים כדי לגרום לביטוי בטא אחד של pro IL תוך תאי. לאחר מכן הוסף ניג' כדי להפעיל את היווצרות ה-NLRP שלוש דלקתיות.

זה בתורו מפעיל את הפיצול של פרו IL בטא אחד ל-IL בטא אחד בוגר לפני ההפרשה. לאחר מכן, אספו את הדגימות ומדדו את התוצאות התוך-תאיות pro IL one beta ואת תוצאות הבטא החוץ-תאיות הבוגרות של IL one שהתקבלו על ידי מדידת הפרשת IL one beta מתאים מוכנה ומופעלים על ידי אימונופלואורסצנטיות, כתם מערבי ו-eli. זיהוי מדגים כי תחול DCS אנושי מביא לייצור תוך-תאי pro IL one beta בתאים מוכנים R 8 48 והפרשת IL בטא אחת מתאים הן מוכנים והן מופעלים עם יוריס ניגרי.

שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תפקידו של ה-NLRP שלושת הדלקתיים בתגובת תאים דנדריטיים אנושיים לליגנדים סינתטיים. ניתן ליישם אותו גם על מערכות אחרות שנועדו לבחון טריגרים פיזיולוגיים כגון חיידקים, וירוסים ומחלות אוטו-דלקתיות. Aliquot 200 מיקרוליטר של תאים דנדריטיים שמקורם במונוציטים מבודדים טריים במצב מנוחה בצלחת תחתונה עגולה של 96 באר.

התחל עם ארבעת התנאים הסטנדרטיים של שליטה שלילית ללא גירוי, תחול בלבד, הפעלה בלבד והתחלה ואחריה הפעלה. לאחר מכן, על פי תכנון הניסוי, כלול בקרות מדללות עבור R 8 48 וניסין עבור בדיקות צביעת ציטוקינים תוך-תאיות במורד הזרם כוללות כפילויות עבור בקרות האיזוטיפ כדי לקדם את הדלקת. הוסף R 8 48, הוסף ריכוז סופי של 10 מיקרומולר לבארות המתאימות.

מניחים את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 18 שעות. לאחר מכן כדי להפעיל את ה-NLRP שלוש דלקות, הוסף ניג' בריכוז סופי של 20 מיקרו-מולאר. החזירו את התרביות לחממה למשך שש שעות נוספות כדי לקצור את הדגימות צנטריפוגה את צלחת התרבית ב-974 פעמים G למשך שלוש דקות מבלי להפריע לכדורי התא.

העבירו כל סופרנטנט לצלחת תחתונה עגולה נפרדת על מנת למדוד את הפרשת הציטוקינים על ידי EISA. כעת שטפו את הכדורים התאיים שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר של XPBS אחד כדי להסיר כל IL חוץ-תאי בטא אחד מהדגימות התאיות לניתוח נוסף על ידי מגוון טכניקות לזיהוי כתמים מערביים של pro IL בטא אחד ליס את התאים ישירות ב-10 מיקרוליטר של מאגר ליזיס דנטורינג. לאחר העברת הליזטים לצינורות איינור של 1.5 מיליליטר, יש לחמם את הדגימות למשך 10 דקות בחום של 100 מעלות צלזיוס לזיהוי פלואורסצנטי על ידי זרימה ציטומטרית של IL one beta.

הוסף 100 מיקרוליטר של 5% PHS לדגימות התאיות ומיקרוליטר אחד של נוגדנים עם תווית פלואורסצנטית לסמני הפנוטיפ או בקרת איזוטיפ דגירה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר שלוש שטיפות PBS, תקן את התאים עם 100 מיקרוליטר של 4% PFA למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר חדיר למשך 30 דקות, ואחריו 62 ננוגרם של נוגדן אנטי IL אחד בטא FSE או בקרת איזוטיפ דגימות דגירה למשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס.

שטפו את התאים שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר של מאגר חדיר והשעו מחדש ב-XPBS אחד. עוטפים את הדגימות בנייר כסף ושומרים בארבע מעלות צלזיוס. אם מזהים IL בטא אחד על ידי מיקרוסקופ תאי כתמים עם dappy, הוסף הר והנח פתק כיסוי בעדינות על גבי מגלשת זכוכית.

אפשר להר להתרפא בן לילה לפני צילום תמונות מיקרוסקופיה לזיהוי פלואורסצנטי על ידי ציטומטריית זרימה. רכוש נתונים דגימה אחת בכל פעם. הגדר את השערים המפוזרים קדימה וצדדית על התאים החיים השער הבא על CD 11 C חיובי CD 14 תאים שליליים.

לבסוף, נתח את אוכלוסיית MODC על סמך צביעת בטא פרו IL אחת ברכישת נתוני מיקרוסקופיה. הגדר את זמן החשיפה עם הדגימה המטופלת R 8 48 הצביעה החיובית. לאחר מכן קבע את אחוז הבטא של pro IL one המבטא קלות MO dcs לזיהוי כתמים מערביים.

טען את נפח הדגימה הכולל על ג'ל הפולי אקרילאמיד. הפעל ב-140 וולט עד שחזית התבנית נגמרת מהג'ל. העבירו את החלבון מג'ל הפולי אקרילאמיד ל-A-P-V-D-F immo על קרום FL.

חסום את הממברנה עם 5% BSA ב-TBST למשך שעה. דגירה עם הנוגדן העיקרי תוך כדי טלטול בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר שלוש שטיפות TBST וחמש דקות, דגירה עם הנוגדן המשני בטמפרטורת החדר למשך שעה, לאחר שלוש שטיפות נוספות של TBST, דמו את הממברנה, בעת מדידת ציטוקינים מופרשים על ידי ELI SA, אזנו את הדגימות בטמפרטורת החדר.

סובב דגימות כדי לאחד את עיבוי הסופרנטנט ופעל לפי הוראות היצרן למדידת צביעת ציטוקינים תוך-תאיים IL one beta עבור pro IL one beta מאפשר מיקרוסקופיה וקריאות עובדות מ-CD 11 C חיובי CD 14 תאים דנדריטיים שליליים שמקורם במונוציטים. ניתן לכמת את שתי הטכניקות ביחס לבקרת תאים שאינה ראשונית או במנוחה וכן בקרת איזוטיפ. אחוז תאי כתם בטא פרו IL אחד מוכפל בחציון הגיאומטרי של אוכלוסייה זו כדי לספק את עוצמת הפלואורסצנט החציונית.

ה-MFI דומה לכמות הבטא הפרו-IL הקיימת בתאי הכתם החיוביים. הנה. טכניקות ספיגה חיסונית משמשות למדידת בטא פרו IL אחד מהליזטים של התאים. נתונים כמותיים באים לידי ביטוי ביחס לבקרה תאית פנימית כגון בטא טובולין כצפוי.

ספיגה חיסונית עבור פרו IL בטא אחד בתאים שטופלו ב-NI ניגריה מגלה ירידה בבטא פרו IL אחד. לכך מתווספת עלייה מקבילה ב-IL one beta בסופרנטנטים, שנמדדה על ידי E ELI a רק R 8 48, ואחריה התנאים הניגריים של NI. מדידה סימולטנית של ציטוקינים דלקתיים אחרים כגון T, NF, אלפא, IL 10 ו-IL 6 מבטיחה כי ניז'ר ספציפי בגרימת הפרשת IL one beta.

רמת ההתחלה תלויה בזמן ובמינון. ניסויים נוספים כגון מדידת ריכוז חלבון חוץ-תאי, זיהוי כימילומינסנציה מדור בטא אחד בוגר או חסימת הדלקת יעזרו לקבוע אם IO חוץ-תאי אחד בטא הוא הצורה הבוגרת והאם הפרשת בטא אחת של IO היא nlrp. שלוש פעילות דלקתית תלויה.