Name: מנסה לאמוד השפלה proteasomal במערכת תא ללא בצמחים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-26T17:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: למדו לנתח יציבות חלבונים במערכת תא ללא באמצעות חילוץ חלבון מעלי צמחים ו-SDS-PAGE. שיטה זו מאפשרת חקר מסלול הדגרדציה הפרוטאזומלית באופן מבוקר ויעיל.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

העבודה שהובילה לפרסום זה קיבלה מימון מתכנית מארי קירי COFUND &quot;U-הניידות&quot;, cofinanced על ידי האוניברסיטה של מלאגה ותכנית האיחוד האירופי 7 מסגרת ה (FP7/2007-2013) תחת GA מס 246,550. העבודה במעבדה שלנו היא נתמכת על ידי מענקים מ-NIH, משרד החקלאות / NIFA, NSF, בארד, וBSF לVC

1. ביטוי חלבון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחירה של מערכת ביטוי בחר במערכת, כלומר, וקטורים ושיטת הצגת וקטור, מתאימה ביותר לביטוי של החלבון של העניין באורגניזם / תא דגם הספציפי. שים לב כי assay שלנו דורש ביטוי של החלבונים שנבדקו בכמויות בקלות detectible, אשר מושגת על ידי מיטב שינוי זמני של מספר הגדול של תאים. בצמחים, למשל, זה הכי טוב מושגת באמצעות פלסמידים ינארי כוקטורי ביטוי וAgrobacterium כמערכת אספקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנייה של וקטורי ביטוי בינארי לשכפל את רצף הקידוד (ים) של החלבון (ים) של עניין לתוך וקטור ביטוי לבד או בשילוב של תרגום לתג epitope. שימוש וקטורים שמתאימים למערכת הביטוי שבחר ונהלי ביולוגיה מולקולרית סטנדרטיים לשיבוט גנטי. למסירת גן בתיווך Agrobacterium, להעסיק וקטורים בינאריים ולהציג אותם, גם באמצעות standaפרוטוקולי rd, למתח Agrobacterium, כגון EHA105, לחיסון הבא של רקמות צמח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחירה של מיני צמחים בחר את מיני צמחים שבו החלבון (ים) של העניין יבוא לידי ביטוי. שימו לב כי, בעוד שניתן להשתמש בם בכל מיני צמחים רגישים לשינוי גנטי בתיווך Agrobacterium, מיני הצמחים שלנו בחירה הוא ניקוטיאנה benthamiana, אשר גדל בקלות, רגיש מאוד לAgrobacterium, ויש לו עלים גדולים שהם מחוסן בקלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גידול צמחים לגדל את הצמח אחת ל -4 עד 6 שבועות בסיר עם Pro-Mix BX בסיר (20 סנטימטר x 20 סנטימטר x 20 סנטימטר) בתנאי סביבה מבוקרים (למשל, תא צמיחה) של יום ארוך (כלומר, 16 שעות של 130 -150 ΜE m-2 אור S-1 ב23 מעלות צלזיוס וחשוכות שעות 8 ב20 מעלות צלזיוס) ו40-65% לחות יחסית. 1.5.2 לדשן מדי פעם עם מוצרים זמינים מסחרי לפי הוראות יצרן. ברגע שהצמח גדל, בחרמשאיר אותך עם הגודל של 50 מ&quot;מ x 70 מ&quot;מ או גדול יותר (מדידות אורך אלה אינן כוללות פטוטרת) עבור חיסון Agrobacterium. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיסון עם Agrobacterium לגדול זן Agrobacterium מחסה המבנה בינארי המבטא את החלבון (ים) נבדק מצעד 1.3 הלילה בשעה 28 מעלות צלזיוס במדיום YEP (peptone 1%, 1% תמצית שמרים, ו0.5% NaCl) בתוספת האנטיביוטיקה מתאימה (למשל, 100 מ&quot;ג / סטרפטומיצין L ו10 ריפאמפיצין מ&quot;ג / ליטר עבור וקטורים מבוססי pPZP-RSC2 24-25). 1.6.2 צנטריפוגה התאים, resuspended לOD 600 = 0.5 במאגר הסתננות [10 מ&quot;מ MgCl 2, 10 Mes מ&quot;מ (pH 5.6), 100 acetosyringone מיקרומטר], ו דגירה עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר. חדור בתרבות לצד abaxial של עלה, באמצעות מזרק מחטים 1 מ&quot;ל; לציין כי העלים מחוסן באתרו, ואילו מצורף למפעל. 1.6.3 לאחר החדירה, מגדל את הצמח ל72 שעות תחת משטר אור 16 h &amp; 130-150181 #; m-2 אור E S-1 ב23 ° כהה h C / 8 ב20 מעלות צלזיוס לפני הקציר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישום של מעכבי proteasomal תומכים ברעיון כי החלבון (ים) שנבדק הוא מושפל על דרך מסלול proteasomal, השתמש MG132 מעכבי proteasomal הספציפי וlactacystin 28-29, שאמור להפחית או אפילו לחסום השפלה. ארבע שעות לפני קצירת (ראה שלב 2.1), לחדור לאזורי עלים מחוסן Agrobacterium עם 10 מיקרומטר MG132 (EMD Millipore) או 10 lactacystin מיקרומטר (סיגמא אולדריץ &#39;) או מדומה לטפל עלה עם הממסים בהתאמה, כלומר, DMSO 0.1% או מים מזוקקים. </li></ol> 2. הכנת תמציות תא ללא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קצירה ליף קציר האזורים מחוסן של העלה, בדרך כלל CA. 200-400 מ&quot;ג של משקל טרי, וטוחנים אותם לאבקה דקה בחנקן נוזלי. לחלופין, חרוז-לנצח את הרקמות, באמצעות כל חרוז-מקצף (למשל, Biospec) או amalgamator שיניים (למשל, TPC מתקדם<html> טכנולוגיות) ישירות למאגר השפלה (ראה שלב 2.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפקת חלבון הכן כוללת תמצית חלבון על ידי הצבת רקמות קרקע ל500 μL של חיץ השפלה [50mm טריס-HCL (pH 7.5), 100 mM NaCl, 10 מ&quot;מ MgCl 2, 5 מ&quot;מ DTT, 5 מ&quot;מ אדנוזין 5&#39;-טריפוספט, ומעכבי פרוטאז 1x קוקטייל (סיגמא אולדריץ &#39;)]. שים לב כי מעכבי פרוטאז הקוקטייל משפיע בעיקר על סרין, ציסטאין, אספרטית, וmetalloproteases ואינו מפריע לפרוטאז 26S. להבהיר את התמצית על ידי שתי centrifugations הרציף ב12,000 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תגובת פירוק חלבונים העבר את הכמויות שווה של תמציות, בדרך כלל 20 μL, לmicrofuge צינורות דגירה אותם בטמפרטורת חדר להגדלת פרקי זמן. בדרך כלל, זמן מדגם אפס, ו5, 10, 15, 20, ו30 נקודות זמן דקות. לעצור תגובות על ידי רתחה בחיץ ג&#39;ל מדגם SDS, ולנתח אותם על ידי מערבי סופג. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 3. זיהוי פירוק חלבונים על ידי immunoblotting <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ג&#39;ל אלקטרופורזה 3.1.1 לפתור דגימות חלבון על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה SDS-polyacrylamide וelectrotransfer החלבונים החליטו קרום ניטרוצלולוזה על פי הפרוטוקול הסטנדרטי 30. 3.1.2 קביעת ריכוז חלבון בשיטת ברדפורד (Bio-Rad), ולטעון 50-80 מיקרוגרם של חלבון בסך הכל לכל נתיב. ודא כי כל הדגימות נטענות באותה מידה. עבור פקדי טעינה, להשוות עוצמות של מיני חלבון נמצאים בכל מקום, כגון רשתות גדולות המשוערת RuBisCO אשר נודדות כלהקה גדולה עם ניידות electrophoretic יחסי של כ 50 kDa, הם יכולים להיות מזוהים על ג&#39;לים המוכתם הכחול Coomassie או על Ponceau S-או ניאון SYPRO רובי מוכתם קרומי ניטרוצלולוזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסימה לחסום את הקרום עם 5% חלב דל שומן ב TBST (10 מ&quot;מ טריס-HCl, 140 mM NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4) עבור h 1 בטמפרטורת חדר. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוגדן ראשוני מדולל נוגדנים נגד epitope עיקריים ב1% חלב דל שומן ב TBST לריכוז המומלץ על ידי היצרן ודגירה עם הקרום החסום עבור h 1 בטמפרטורת חדר או ללילה ב 4 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטיפה יש לשטוף את הממברנה היא שטפה ב20 TBST מיליליטר במשך 15 דקות פעם אחת, ופעמים במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוגדנים משני מדולל נוגדנים משני (למשל, IgG נגד ארנב) מצומד עם peroxidase סוס צנון (HRP) ב 1% חלב דל שומן ב TBST כפי שהומלץ על ידי היצרן ו דגירה עם הקרום עבור h 1 בטמפרטורת חדר עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איתור יש לשטוף את הקרום שוב כפי שמתואר בשלב 3.4. לאחר השטיפה הסופית ב TBST, לדמיין את החלבונים של עניין עם מצע chemiluminescent HRP, לרוב באמצעות ערכת ECL. </li></ol>

<ol><li>Patton, E. E., Willems, A. R., Tyers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+control+in+ubiquitin-dependent+proteolysis%3A+don%E2%80%99t+Skp+the+F-box+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Combinatorial control in ubiquitin-dependent proteolysis: don’t Skp the F-box hypothesis.</a> Trends Genet. 14, 236-243 (1998).</li>
<li>Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF+and+cullin%2Fring+H2-based+ubiquitin+ligases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">SCF and cullin/ring H2-based ubiquitin ligases.</a> Annu. Rev. Cell Biol. 15, 435-467 (1999).</li>
<li>Callis, J., Vierstra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+degradation+in+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein degradation in signaling.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 3, 381-386 (2000).</li>
<li>Hellmann, H., Estelle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+development%3A+regulation+by+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Plant development: regulation by protein degradation.</a> Science. 297, 793-797 (2002).</li>
<li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin system.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 425-479 (1998).</li>
<li>Dharmasiri, S., Estelle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+regulated+protein+degradation+in+auxin+response%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of regulated protein degradation in auxin response.</a> Plant Mol. Biol. 49, 401-409 (2002).</li>
<li>Devoto, A., Muskett, P. R., Shirasu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+ubiquitination+in+the+regulation+of+plant+defence+against+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of ubiquitination in the regulation of plant defence against pathogens.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 6, 307-311 (2003).</li>
<li>Itoh, H., Matsuoka, M., Steber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+ubiquitin-26S-proteasome+pathway+in+gibberellin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">A role for the ubiquitin-26S-proteasome pathway in gibberellin signaling.</a> Trends Plant Sci. 8, 492-497 (2003).</li>
<li>Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+26S+proteasome+system+in+the+signaling+pathways+of+TGF-beta+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">The 26S proteasome system in the signaling pathways of TGF-beta superfamily.</a> Front. Biosci. 8, 1109-1127 (2003).</li>
<li>Pagano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+DNA+synthesis+and+mitosis+by+the+Skp2-+p27-Cdk1%2F2+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Control of DNA synthesis and mitosis by the Skp2- p27-Cdk1/2 axis.</a> Mol. Cell. 14, 414-416 (2004).</li>
<li>Magori, S., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hijacking+of+the+host+SCF+ubiquitin+ligase+machinery+by+plant+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Hijacking of the host SCF ubiquitin ligase machinery by plant pathogens.</a> Front. Plant Sci. 2, 87 (2011).</li>
<li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+plant+transformation%3A+the+biology+behind+the+%26%2334%3Bgene-jockeying%26%2334%3B+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the &#34;gene-jockeying&#34; tool.</a> Microbiol. Mol Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).</li>
<li>Lacroix, B., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+bacterial+and+host+plant+factors+in+Agrobacterium-mediated+genetic+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation.</a> Int. J. Dev. Biol. 57, (2013).</li>
<li>Schrammeijer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+the+virulence+protein+VirF+of+Agrobacterium+tumefaciens+with+plant+homologs+of+the+yeast+Skp1+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Interaction of the virulence protein VirF of Agrobacterium tumefaciens with plant homologs of the yeast Skp1 protein.</a> Curr. Biol. 11, 258-262 (2001).</li>
<li>Zaltsman, A., Krichevsky, A., Loyter, A., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+induces+expression+of+a+plant+host+F-box+protein+required+for+tumorigenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium induces expression of a plant host F-box protein required for tumorigenicity.</a> Cell Host Microbe. 7, 197-209 (2010).</li>
<li>Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+targeted+proteolysis+in+plant+genetic+transformation+by+Agrobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Involvement of targeted proteolysis in plant genetic transformation by Agrobacterium.</a> Nature. 431, 87-92 (2004).</li>
<li>Zaltsman, A., Lacroix, B., Gafni, Y., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disassembly+of+synthetic+Agrobacterium+T-DNA-protein+complexes+via+the+host+SCFVBF+ubiquitin-ligase+complex+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Disassembly of synthetic Agrobacterium T-DNA-protein complexes via the host SCFVBF ubiquitin-ligase complex pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 169-174 (2013).</li>
<li>Zhou, P., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitination+and+degradation+of+the+substrate+recognition+subunits+of+SCF+ubiquitin-protein+ligases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitination and degradation of the substrate recognition subunits of SCF ubiquitin-protein ligases.</a> Mol. Cell. 2, 571-580 (1998).</li>
<li>Galan, J. M., Peter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-dependent+degradation+of+multiple+F-box+proteins+by+an+autocatalytic+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-dependent degradation of multiple F-box proteins by an autocatalytic mechanism.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 9124-9129 (1999).</li>
<li>Ayad, N. G., Rankin, S., Murakami, M., Jebanathirajah, J., Gygi, S., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tome-1%2C+a+trigger+of+mitotic+entry%2C+is+degraded+during+G1+via+the+APC%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tome-1, a trigger of mitotic entry, is degraded during G1 via the APC.</a> Cell. 113, 101-113 (2003).</li>
<li>Guardavaccaro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+meiotic+and+mitotic+progression+by+the+F+box+protein+b-Trcp1+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Control of meiotic and mitotic progression by the F box protein b-Trcp1 in vivo.</a> Dev. Cell. 4, 799-812 (2003).</li>
<li>Magori, S., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+counteracts+host-induced+degradation+of+its+F-box+protein+effector%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector.</a> Sci. Signal. 4, (2011).</li>
<li>Margottin-Goguet, F., Hsu, J. Y., Loktev, A., Hsieh, H. M., Reimann, J. D., Jackson, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prophase+destruction+of+Emi1+by+the+SCFbTrCP%2FSlimb+ubiquitin+ligase+activates+the+anaphase+promoting+complex+to+allow+progression+beyond+prometaphase%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Prophase destruction of Emi1 by the SCFbTrCP/Slimb ubiquitin ligase activates the anaphase promoting complex to allow progression beyond prometaphase.</a> Dev. Cell. 4, 813-826 (2003).</li>
<li>Tzfira, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pSAT+vectors%3A+a+modular+series+of+plasmids+for+fluorescent+protein+tagging+and+expression+of+multiple+genes+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants.</a> Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).</li>
<li>Goderis, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+set+of+modular+plant+transformation+vectors+allowing+flexible+insertion+of+up+to+six+expression+units%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units.</a> Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).</li>
<li>Lee, L. Y., Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-DNA+binary+vectors+and+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">T-DNA binary vectors and systems.</a> Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).</li>
<li>Dafny-Yelin, M., Tzfira, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+multiple+transgenes+to+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Delivery of multiple transgenes to plant cells.</a> Plant Physiol. 145, 1118-1128 (2007).</li>
<li>Yang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+the+Arabidopsis+26+S+proteasome%3A+biochemical+and+molecular+analyses+revealed+the+presence+of+multiple+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification of the Arabidopsis 26 S proteasome: biochemical and molecular analyses revealed the presence of multiple isoforms.</a> J. Biol. Chem. 279, 6401-6413 (2004).</li>
<li>Fenteany, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+proteasome+activities+and+subunit-specific+amino-terminal+threonine+modification+by+lactacystin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Inhibition of proteasome activities and subunit-specific amino-terminal threonine modification by lactacystin.</a> Science. 268, 726-731 (1995).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Current Protocols in Molecular Biology</a>. Ausobel, F. M., et al. , Wiley-Interscience. New York. (1987).</li>
<li>Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from:
 
 <a target="_blank" href="imagej.nih.gov/ij">imagej.nih.gov/ij</a> (1997).</li>
<li>Kim, J. H., Kim, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+RING+E3+ubiquitin+ligase+AtAIRP3%2FLOG2+participates+in+positive+regulation+of+high+salt+and+drought+stress+responses%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis RING E3 ubiquitin ligase AtAIRP3/LOG2 participates in positive regulation of high salt and drought stress responses).</a> Plant Physiol. 162, 1733-1749 (2013).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

assay זה מסתמך על הביטוי של החלבונים שנבדקו ברקמות צמח, ולכן תהליך התדרדרות proteasomal הפוטנציאל ברור שמתרחש כבר בתוך רקמות החיות. אנו assay יציבות חלבון, לעומת זאת, רק בתמציות, בזמן אפס מדגם המשמש כנקודת התייחסות הראשונית. לפיכך, אנו מגדירים אותו כassay ללא תא. אחד היבטים חשובים להצלחה של assay זה הוא הבחירה הנכונה של וקטור הביטוי שממנו החלבון (ים) נבדק יופק. אלא אם כן נוגדנים ספציפיים נגד החלבון נבדק זמינים, ז...

המסלול הפרוטאזום ubiquitin/26S מתגלה כמנגנון נפוץ לבקרה של תגובות ביולוגיות שונות, כוללים תקנת תעתיק, התקדמות מחזור התא והולכים אותות, קולט למטה תקנה או אנדוציטוזה, בין השאר מעבד 1-4. במסלול זה, חלבון המטרה מתויג על ידי יוביקוויטין שאריות אשר מחוברות ראשונה באמצעות אג&quot;ח thiolester לאנזים שמפעיל את היוביקוויטין E1 ולאחר מכן translocated לשאריות חומצת אמינו ציסטאין של אנזים היוביקוויטין-נטיית E2, סוף סוף, E2 אינטראקציה עם האנזים E3 יוביקוויטין , וכתוצאה מכך polyubiquitination של מצע החלבון. סופו של דבר, חלבוני polyubiquitinated מוכרים ומושפלים על ידי הפרוטאזום 26S. במנגנון זה, אנזים E3 מציין את המצע ומשמש כמרכיב הרגולציה המרכזי של מערכת ubiquitin/26S הפרוטאזום (UPS). ligases E3 יכול לפעול באופן עצמאי, כגון ligases תחום RING, או כחלק מSCF multisubunit (Sמורכב kp1/Cullin/F-box חלבון), כגון ligases תחום ה-F-התיבה. מסלולי השפלה proteasomal תיווך SCF מעורבים ברגולציה של שעתוק, מחזור תא, העברת אותות 5-10 ופונקציות רבות הסלולר גדולים אחרות. חוץ מתפקידים אלה קריטיים בויסות תהליכים תאיים, UPS לוקח את הבמה המרכזית ביחסי גומלין הצמח לפתוגן רבים. לדוגמא, ראיות מצביעות על כך שהגדלת מספר פתוגנים צמח, כוללים tumefaciens Agrobacterium, מסתמכים על UPS המארח לכדי להקל על תהליך ההדבקה 11. Agrobacterium מעורר גידולי neoplastic על צמחים, המייצגים את המארחים הטבעיים שלה, וזה גם יכול להפוך מגוון רחב של אאוקריוטים אחרים, מפטריות 1,2 לתאים אנושיים 12,13. במהלך ההדבקה שלו, Agrobacterium מייצא אלמנט ה-DNA (T-DNA) וכמה ארסיות חלבונים (Vir) לתוך התא המארח 12-13. אחד מהחלבונים האלה הוא VirF, חלבון ה-F-התיבה הראשונה שנמצאכדי להיות מקודד על ידי הגנום פרוקריוטים 14. כחלק ממכלול SCF ubiquitin האנזים, VirF, וhomolog המארח הפונקציונלי שלה 15 VBF, להקל על זיהום Agrobacterium באמצעות פירוק חלבונים בתיווך UPS, אשר ככל הנראה מאפשר uncoating של T-DNA חיידקים הפולש מחלבונים החיידקים ומארח הנלווים לה, VirE2 וVIP1, בהתאמה 16,17. מעניין לציין, כי חלבוני ה-F-תיבה רבות, כולל VirF, הם מיסודם לא יציבים בשל proteolysis שלהם, שמתווך על ידי פעילות autoubiquitination 18,19 או על ידי ligases E3 אחר שחלבוני ה-F-תיבה עשויים לשמש כמצעי 20-23. כאשר לומדים את פעילות הביוכימית של חלבוני ה-F-תיבה, ligases היוביקוויטין אחר, ו / או מצעים שלהם, זה יהיה מאוד שימושי כדי להעסיק assay פשוט ואמין לשפלת proteasomal. כאן אנו מתארים פרוטוקול אחד כזה לניתוח יציבות חלבון בתאללא מערכת. ב assay זה, היציבות של מצע UPS הוא ניתח בנוכחותו או היעדריו של אחד מהמרכיבים החיוניים של מסלול proteasomal השפלה, כגון חלבון ה-F-תיבה, במערכת ללא תא. באופן כללי, אנו מביעים את החלבון (ים) שנבדק ברקמות צמח, להכין תמציות תא ללא מרקמות אלה ולפקח על הכמויות של החלבון (ים) של עניין על ידי מערבי סופג. מנגנון UPS תלוי של פירוק חלבונים מודגם על ידי הכללתם של מעכבי proteasomal ספציפיים ו / או שימוש coexpression של צורה דומיננטית שלילית של מרכיב SCF, Cullin. הואיל ואנו להמחיש assay זה באמצעות השפלה proteasomal של חלבון ארבידופסיס VIP1 17 על ידי חלבון ה-F-תיבת 15 VBF, זה עשוי להיות מועסק על מנת לחקור את היציבות של כל מצעי proteasomal אחרים.

<table><tbody><tr><td>ערכת בדיקת חלבון</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0001</td><td></td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאינאז&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ</td><td>' S8820</td><td></td></tr><tr><td>מערכת מיני-פרוטיאן</td><td>Bio-Rad</td><td>165-8000</td><td></td></tr><tr><td>Semi-Dry Western Blotting SD electrotransfer system</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3940</td><td></td></tr><tr><td>Affinity Purified Rabbit Anti-Ha</td><td>מעבדת ICL</td><td>RHGT-45A-Z</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד ארנב IgG Peroxidase Conjugate</td><td>Thermo Scientific</td><td>31460</td><td></td></tr><tr><td>BioTrace, NT קרום העברת ניטרוצלולוז</td><td>Pall Corporation</td><td>27377-000</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon מערבי כימי HRP מצע EMD</td><td>Millipore</td><td>WBKL S0 050</td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>EMD Millipore</td><td>474790-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Lactacystin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6785</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate</td><td>Pierce</td><td>35055</td><td></td></tr></tbody></table>

מנסה לאמוד השפלה proteasomal במערכת תא ללא בצמחים

Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

מסלול היוביקוויטין-proteasome לפירוק חלבונים התפתחה כאחד מהמנגנונים החשובים ביותר לרגולציה של קשת רחבה של תפקודים תאיים כמעט בכל יצורי אוקריוטים. באופן ספציפי, בצמחים, במערכת ubiquitin/26S הפרוטאזום (UPS) מסדירה פירוק חלבונים ותורמת באופן משמעותי לפיתוח של מגוון רחב של תהליכים, כולל תגובה חיסונית, פיתוח ומוות תאים מתוכנת. יתר על כן, ראיות מצביעות על כך שהגדלת פתוגנים רבים צמח, כגון Agrobacterium, לנצל את UPS המארח לזיהום יעיל, תוך שימת דגש על החשיבות של UPS באינטראקציות הצמח לפתוגן. הספציפיות המצע של UPS מושגת על ידי האנזים יוביקוויטין E3 שפועל בתיאום עם E1 ו-E2 ligases לזהות ולסמן את מולקולות חלבון ספציפיות המיועדות לפירוק על ידי הצמדת אליהם שרשרות של מולקולות יוביקוויטין. סוג אחד של ligases E3 הוא SCF (Skp1 / Cחלבון מורכב Ullin / F-box), שדווקא מכיר במצעי UPS ומטרותיהם לubiquitination באמצעות מרכיב חלבון ה-F-התיבה שלו. כדי לחקור את התפקיד פוטנציאלי של UPS בתהליך ביולוגי של עניין, חשוב לתכנן assay פשוט ואמין לפירוק חלבונים בתיווך UPS. כאן, אנו מתארים assay אחד כזה באמצעות מערכת ללא תא צמח. assay זה יכול להיות מותאם למחקרים של התפקידים של פירוק חלבונים מווסת בתהליכים תאיים שונים, עם דגש מיוחד על אינטראקציות חלבון מצע F-box.

איור 1, שהותאם מזלצמן ואח&#39;. 17, מדגים ניסויי נציג לצורך זיהוי של השפלה proteasomal במערכת ללא תא. באופן ספציפי, אנחנו מדגימים יציבות של VIP1 חלבון הקשורות להגנת צמח על ידי חלבון ה-F-תיבת VBF דרך מסלול SCF VBF בנ benthamiana. VBF ארבידופסיס וחלבונים מתויגים-HA VIP1 (ר &#39;VIP1) היו coexpressed transiently, וחלבון תוכן HA-VIP1 בתוך תמציות של העלים להביע נותח על ידי מערבי סופג. ניתוח זה הראה כי כמויות VIP1 הופחתו ...

פירוק חלבונים ממוקד מייצג מנגנון רגולציה עיקרי לתפקוד תא. היא מתרחשת באמצעות מסלול היוביקוויטין-proteasome נשמרים, אשר מייחס רשתות polyubiquitin לחלבון המטרה שלאחר מכן ישמש &quot;תגים&quot; מולקולריים להפרוטאזום 26S. כאן, אנו מתארים assay תא ללא פשוט ואמין לשפלת proteasomal של חלבונים.

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לנתח יציבות חלבונים במערכת ללא תאים. דבר זה מושג על ידי ה接種 של Oceana Biana עם זני agrobacterium שונים, הנושאים את החלבון המבוקש המכיל מבנה בינארי.לאחר מכן מחלצים את החלבון הכולל מעלי הצמח. העלים מועברים לאنبובות מיקרו-צנטריפוגה ומודגמים בטמפרטורת החדר למשך פרקי זמן עולים. לאחר מכן, דגימות החלבון מופרדות באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל SDS-Acrylamide, ומועברות חשמלית לממברנת ניטרוסלולוז.על מנת לזהות את החלבון המבוקש באמצעות נוגדן ספציפי, מתקבלים תוצאות המראות את יציבות החלבון בנוכחות או בהיעדר מעכב פרוטאוזומלי ספציפי, בהתבסס על ניתוח western blotting. אנו מתארים כאן מתודולוגיה פשוטה לבדיקת היציבות של סובסטרט הציסטה של ה-INE protosome בנוכחות או בהיעדר אחד הרכיבים החיוניים של מסלול הפירוק הפרוטאוזומלי במערכת חסרת תאים. שיטות אלו יכולות לספק תובנות לגבי פירוק פרוטאוזומלי בטוח יותר.ניתן להחיל זאת גם על מערכות אחרות, כגון מחקרים על תפקידיה של דגרדציה מבוקרת של חלבונים בתהליכים תאיים מגוונים. בהדגמה זו נעשה שימוש ב-NCOA hamana. הצמח גדל בקלות, רגיש מאוד ל-agrobacterium ובעל עלים גדולים שניתן להחדיר בהם פתוגנים בקלות.גדלו צמח אחד במשך ארבעה עד שישה שבועות בעציץ עם promix B בתנאים סביבתיים מבוקרים של יום ארוך ולחות יחסית של 40% עד 65%. דמנו את הצמח מדי פעם במוצרי

assaying-proteasomal-degradation-in-a-cell-free-system-in-plants

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטה כדי לעקוב אחר פעילות היוביקוויטין-הפרוטאזום בתאי חיים מתוארת. Degron-מעורער GFP-(GFP-DGN) וחלבון היתוך יציב GFP-dgnFS נוצר וtransduced לתוך התא באמצעות וקטור ביטוי lentiviral. טכניקה זו מאפשרת ליצור קו יציב GFP-dgn/GFP-dgnFS להביע תא שבו פעילות היוביקוויטין-הפרוטאזום ניתן להעריך בקלות באמצעות epifluorescence או cytometry זרימה.

ניטור של פעילות יוביקוויטין-הפרוטאזום בתאי חיים באמצעות ערער-חלבון Degron (DGN) ירוק פלורסנט חלבון (GFP)-מבוסס כתב

בסרטון זה, אנו מדגימים בדיקת צבירת חלבונים מבוססת תאים באמצעות מעכבי פרוטאזום, אשר חוסמים את פעילות הפרוטאזום, ומונעים מחלבונים מוטנטיים שאינם מקופלים כהלכה, מאוחים לתווית פלואורסצנטית, לעבור פירוק פרוטאזומלי תלוי יוביקוויטין, המוביל להצטברותם בתוך הציטופלסמה של התא. לאחר מכן מדמיינים את צברי החלבונים ומכמתים אותם במיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Protein Aggregate Formation Assay: שיטה לזיהוי וכימות צבירת חלבונים בתאים בתרבית עם אינדוקציה על ידי מעכב פרוטאזום

סרטון זה מתאר בדיקת פירוק עבור חלבונים שאינם מקופלים כהלכה באמצעות טיפול cycloheximide יחד עם שבר דטרגנט. שיטה זו מסייעת בחקר הדינמיקה של חלבונים שאינם מקופלים כהלכה ובחשיפת המנגנונים המעמיקים של תחלופת החלבונים.

בדיקת פירוק חלבון נוטה לקיפול שגוי: טכניקה לניטור פירוק חלבון מקופל בצורה שגויה באמצעות טיפול בציקלוהקסימיד ושבירת חומרי ניקוי

אנו מתארים כאן פרוטוקול לטיהור והאפיון של קומפלקסי חלבוני צמח. אנו מראים כי על ידי immunoprecipitating חלבון יחיד בתוך מתחם, כדי שנוכל לזהות לאחר translational השינויים שלה והשותפים באינטראקציה שלה.

זיהוי לאחר translational השינויים של קומפלקסי חלבוני צמח

כאן אנו מתארים בדיקה ביולוגית חזקה לכימות השיעור היחסי של פרוטאוליזה על ידי מערכת היוביקוויטין-פרוטאזום. קריאת הבדיקה היא קצב גידול השמרים בתרבית נוזלית, התלוי ברמות התאיות של חלבון מדווח הכולל אות פירוק המותך לסמן מטבולי חיוני.

Assay צמיחה מבוסס כתב ניתוח שיטתי של פירוק חלבונים

מאמר זה מתאר בדיקה מבוססת גידול שמרים לקביעת הדרישות הגנטיות לפירוק חלבונים. הוא גם מדגים שיטה למיצוי מהיר של חלבוני שמרים, המתאימה לכתמים מערביים כדי לאשר ביוכימית את דרישות הפירוק. ניתן להתאים טכניקות אלה לניטור פירוק של מגוון חלבונים.

קביעה מבוססת צמיחה ואישור ביוכימית של דרישות גנטיות לפירוק חלבונים ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

דוח זה מתאר פרוטוקולים למדידת שיעורי פירוק של חלבונים לא מקופלים על ידי כתם מערבי או מבחנים מבוססי פלואורסצנטיות. ניתן ליישם את השיטות לניתוח של חלבונים אחרים שקופלו בצורה לא נכונה ולסינון תפוקה גבוהה.

מבחנים עבור הפירוק של חלבונים בתאים Misfolded

כאן, אנו מציגים פרוטוקול האינטראקציה ללכוד להחיל על Arabopopsis thaliana עלה mesophyll protoplasts. שיטה זו מסתמכת באופן קריטי על vivo UV crosslinking ומאפשר בידוד וזיהוי של חלבונים mRNA מחייב הצמח מסביבה פיזיולוגית.

MRNA Interactome ללכוד מן Protoplasts הצמח

פרוטוקול זה מתאר שיטה לקביעת חלבון מחצית החיים של תאים חסיד חי אחד, באמצעות הדופק תיוג פלורסצנטיות הדמיה בצילום מואץ של חלבונים פיוז'ן SNAP-תג.

תא בודד כימות של חלבון השפלה המחירים על-ידי קרינה פלואורסצנטית זמן לשגות מיקרוסקופ בתרבות תא חסיד

אינטראקציות חלבון-חלבון, חלבון-מטבוליט מכריעים עבור כל פונקציות הסלולר. במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול המאפשר ניתוח מקביל של אינטראקציות אלה עם חלבון של בחירה. פרוטוקול שלנו היה אופטימיזציה עבור הצמח תרביות תאים, והוא משלב טיהור זיקה עם חלבון מבוסס ספקטרומטר מסה וזיהוי מטבוליט.

2 ב 1: בשלב אחד טיהור זיקה לניתוח מקבילים של חלבון, מתחמי חלבון-מטבוליט

מוצג כאן היא גישה זרחנית, כלומר לעצור וללכת מיצוי קצה מבוסס פוספופרוטומית, אשר מספק תפוקה גבוהה כיסוי עמוק של ערבידופסיס phosphoproteome. גישה זו מתווה את הסקירה של איתות מתח אוסמוטי ב Arabidopsis.

אסטרטגיה פוספוטומית ליצירת פרופיל של איתות מתח אוסמוטי ב- Arabidopsis

למדו לנתח יציבות חלבונים במערכת תא ללא באמצעות חילוץ חלבון מעלי צמחים ו-SDS-PAGE. שיטה זו מאפשרת חקר מסלול הדגרדציה הפרוטאזומלית באופן מבוקר ויעיל.

מנסה לאמוד השפלה proteasomal במערכת תא ללא בצמחים

גלה סרטונים נוספים