ייצור רקמת סחוס אנושי באמצעות שלושה ממדי הזרקת דיו טכנולוגיית הדפסה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבנות רקמת סחוס אנושית תלת מימדית כדי לבדוק את ההיתכנות של הדפסת רקמות תלת מימדיות, באמצעות מדפסת הזרקת דיו תרמית שונה עם פילמור פוטו בו זמנית. זה מושג על ידי שינוי ראשון של מדפסת הזרקת דיו תרמית Hewlett Packard Desk Jet 500 הזמינה מסחרית ו-5 1 16 2 6, מחסנית דיו צבעונית בשחור-לבן למדפסת ביו. השלב השני הוא שילוב שלב הדפסת תלת מימד פשוט ומנורת UV באורך גל ארוך כדי לספק פילמור מיידי של דיו ביו מוזרק במהלך תהליך הייצור.

לאחר מכן, מכינים את הדיו הביולוגי על ידי השעיית כונדרוציטים מפרקיים אנושיים מורחבים בתמיסת פוליאתילן גליקול 10% ב-5 מיליון תאים למיליליטר. השלב האחרון הוא הדפסת רקמת הסחוס בצורה שכבה אחר שכבה עם פילמור פוטו בו זמנית. בסופו של דבר מיקרוסקופיה והיסטולוגיה קונפוקלית.

צביעה משמשת להצגת התפלגות אחידה של כונדרוציטים מודפסים בהידרוג'ל תלת מימדי וייצור מטריצת סחוס חוץ-תאית מעולה בסחוס הניאו ההומוגני במהלך התרבית. היתרון העיקרי של טכנולוגיה זו על פני אמצעים קיימים כמו פילמור לאחר ייצור ידני או תאי ישיבה לאחר סריקה לייצור הוא שהתאים המודפסים מועברים במדויק למיקום המישוש ונשארים במקומם במטריצה. במקום לחשוב לתחתית הפיגום בגלל כוח הכבידה, כך שהוא יוצר מחסנית הומוגנית.

שינוי המדפסת המודגם בסרטון זה מבוסס על מדפסת הזרקת דיו תרמית של Hewlett Packard Desk Jet 500 ומחסנית דיו שחורה 5 1 6 2 6. התחל בהסרת מכסה הפלסטיק העליון של המדפסת וניתוק זהיר של לוח הבקרה מהכיסוי. נתק את שלושת חיבורי הכבלים בין החלק העליון של המדפסת לבסיס.

לאחר מכן הסר את החלק העליון של המדפסת מהבסיס. לאחר מכן, אביזרי הפלסטיק והגומי הקטנים המרכיבים את מערכת ניקוי ראש ההדפסה מוסרים מהחלק העליון של המדפסת. הסר את בסיס מגש הנייר עם קפיצים.

יש להסיר גם את הצלחת המתכתית המכסה את מוט הזנת הנייר מפלסטיק. בנוסף, יש לחתוך את מוט הזנת הנייר מפלסטיק במצב גלגל ההזנה האמצעי ולהסיר את שני גלגלי הזנת הנייר. לצורך סרטון זה, רכיבים אלה כבר הוסרו.

לאחר ניקוי האבק והפסולת באמצעות שימורי אוויר ומגבוני אתנול, חבר את החלק העליון של המדפסת לבסיס לפני השימוש ב-UV. עיקר את המדפסת ששונתה למשך שעתיים לפחות במכסה זרימה למינרית. כדי לשנות את מחסנית הדיו חתוך תחילה את המכסה שלה.

בעזרת מסור ידני רוקנו את הדיו והסירו את המסנן המכסה את מאגר הבאר התחתון של המחסנית. שטפו היטב את המחסנית במי ברז זורמים כדי להסיר את שאריות הדיו אולטראס. סוניקציה של המחסנית במים נטולי יונים למשך 10 דקות.

בדוק את המחסנית כדי לוודא שכל הדיו הוסר. יש לרסס את המחסנית ביסודיות עם אתנול 70% לעיקור, ואחריו מים מעוקרים נטולי יונים. לבסוף, הגדר מנורת UV באורך גל ארוך מעל פלטפורמת ההדפסה כדי לספק יכולת פילמור צילום בו זמנית.

מדוד את עוצמת ה-UV בפלטפורמת ההדפסה באמצעות מד אור UV. התאם את המרחק בין מנורת ה-UV לפלטפורמת המדפסת, כך שהעוצמה בנושא ההדפסה תהיה בין ארבעה לשמונה מילי-וואט לסנטימטר מרובע. מרחק זה בין המנורה לפלטפורמת המדפסת צריך להיות כ -25 סנטימטרים.

הדיו הביולוגי מוכן מכונדרוציטים אנושיים להרחבת כונדרוציטים בצלחת חד-שכבתית. 5 מיליון כונדרוציטים אנושיים לכל בקבוק תרבית רקמה T 1 75 להרחבת תאים ב-DMEM בתוספת 10% סרום עגל ותאי תרבית גלוטמין סטרפטומיצין x פניצילין ב-37 מעלות צלזיוס עם אוויר לח המכיל 5% פחמן דו חמצני. החלף את מדיום התרבית כל שלושה ימים עד שהתאים יהיו 85% מתלכדים.

השתמש בתאים מאותו מעבר. הכן את תמיסת הפוליאתילן גליקול DL או פדה. ממיסים את הפדה ב-PBS לריכוז סופי של 10% משקל לנפח.

הוסף את יוזם התמונות I 2 9 5 9 לריכוז סופי של 0.05% משקל לכל מסנן נפח. עקר את התמיסה כאשר הכונדרוציטים האנושיים המתורבתים הם 85% מתלכדים. אסוף את התאים לאחר חישוב ריכוז התאים.

העבירו את נפח תרחיף התאים הדרוש להכנת ביו ב-5 מיליון תאים למיליליטר לצנטריפוגה של צינור חרוטי ב-1200 סל"ד למשך חמש דקות. כדי לגלול את התאים, שאפו את הסופרנטנט ותלו את התאים בתמיסת ה-Pega המוכנה ליצירת הדיו הביולוגי. כדי להתחיל בהליך זה, הפעל את המדפסת והמחשב הנייד באמצעות Microsoft Word, צור דפוס הדפסה של עיגול מוצק בקוטר של ארבעה מילימטרים.

הנח את תבנית הפלסטיק לתוך המדפסת. התאם את מיקום התבנית וודא שהיא תודפס בדיוק לתוך תבנית הפלסטיק. חשב את מספר ההדפסים הדרושים כדי להגיע לעובי הרצוי של הפיגום.

לגובה של ארבעה מילימטרים נדרשים 220 הדפסים ליצירת הפיגום הרצוי. טען את הדיו הביולוגי למחסנית הדיו. כסו את המחסנית בנייר אלומיניום כדי להגן מפני חשיפה ישירה ל-UUV.

במהלך ההדפסה, שלח את פקודת ההדפסה למדפסת. כאשר המדפסת מתחילה להדפיס, משוך את חיישן הנייר כדי להמשיך להדפיס. בהיעדר נייר העובר דרך המדפסת, כל תהליך ההדפסה אמור להימשך פחות מארבע דקות עבור פיגום בקוטר ארבעה מילימטרים וגובה ארבעה מילימטרים.

העבירו סחוס ניאו מודפס לצלחת של 24 בארות והוסיפו 1.5 מיליליטר של מדיום תרבית לכל באר. כדי להעריך את כדאיות התאים, דגרו על סחוס הניאו המודפס בכדאיות מתים חיים. פתרון עבודה ציטוטוקסיות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות בחושך, חתוך את ההידרוג'ל עמוס התאים לשניים לאחר רכישת תמונות פלואורסצנטיות של אזור החיתוך, בקש ממשקיף עיוור לספור תאים חיים ומתים בחמש תמונות שצולמו באקראי כדי לחשב את כדאיות התא.

רקמת סחוס ניאו מודפסת מייצגת בקוטר של ארבעה מילימטרים וגובה של ארבעה מילימטרים מוצגת בתמונה זו על סמך המאפיינים של מדפסת הזרקת הדיו התרמית ששונה. עבור מבנה בגודל זה, הנפח והעובי של כל שכבה מודפסת במהלך בניית שכבה אחר שכבה היו 0.23 מיקרוליטר ו-18 מיקרון בהתאמה. כל תהליך ההדפסה לבניית רקמת הסחוס הניאו ארך פחות מארבע דקות.

תמונות אלה הן של כונדרוציטים המסומנים בצבעי פלואורסצנט ירוקים וכתומים. לוח A מציג התפלגות תאים אחידה של כונדרוציטים מודפסים בפיגום התלת-ממדי. עקב פילמור פוטו בו זמנית של הפיגום שמסביב במהלך שקיעת התא, תהליך ההדפסה והפילמור הפוטו הושלם תוך ארבע דקות עם כדאיות תא של 90%לעומת זאת, פאנל B מראה שללא פילמור פוטו בו זמנית, במקום להישאר במיקומים הראשונים שלהם, התא שקע לממשק האופקי התחתון בגלל כוח הכבידה.

נדרשו 10 דקות של חשיפה UV לג'ל, מבנה בגודל זהה ל-A עם כדאיות תאים של 63% זעפרן וצביעה o של כונדרוציטים מודפסים בהידרוג'ל PEG מראה עלייה הדרגתית בייצור פרוט גליקן במהלך התרבית, מה שמעיד על הפנוטיפ הקונגני של כונדרוציטים מודפסים בתלת מימד והיווצרות סחוס ניאו הומוגני. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש במדפסת הזרקת דיו תרמית שונה כדי ליצור רקמה מחושבת תלת מימדית עם פיזור תאים אחיד בפיגום תלת מימדי.