שימוש בBiosensors האופטי ללא תווית לזיהוי מודולציה של תעלות אשלגן על ידי קולטנים מצמידים G-חלבון

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לזהות מודולציה של קולטנים מצומדים לחלבון G על ידי תעלות אשלגן, תוך שימוש בחיישנים ביו-אופטיים של דירוג אורך גל רזוננטי ללא סימון כדי להשיג זאת; תאי HEK 293 ותאי HEK 293 המבטאים באופן יציב את תעלת האשלגן slack B המופעלת על ידי נתרן של חולדה מושבים על פלטת חיישנים ביו-אופטיים בעלת 384 בארות ומושלמים להדגרה למשך הלילה. לאחר מכן, מבוצעת מדידת בסיס (baseline) של המסה בקרבת ממברנת הפלזמה, ומוספים אגוניסטים של קולטנים אנדוגניים מצומדים לחלבון G או GPCRs. כשלב סופי, נמדד השינוי באות כתוצאה מהפעלת ה-GPCR, ומחושבת המודולציה של תעלת האשלגן בתגובה זו.

בסופו של דבר, שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחומי מדעי המוח והסיגנלינג התאי, באמצעות מדידה כמותית של מנגנוני הסיגנלינג בין קולטנים מצומדים לחלבון G לבין תעלות אשלגן. היתרונות העיקריים של שימוש בטכניקה זו על פני השיטות הקיימות כיום לבחינת האינטראקציות בין תעלות לחלבונים, כגון CO ובדיקות שיקוע, הם שניתן לבצע את הבדיקה בתאי חיים. היא אינה דורשת שימוש בסימונים חיצוניים, שעלולים לשנות את המבנה של החלבון המעורב באינטראקציה.

ולבסוף, בתוך תאים חיים, ניתן למעשה לעקוב אחר האינטראקציות בזמן אמת. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי השהאות בין GPCRs לתעלות אשלגן, ניתן להשתמש בה גם כדי לחקור תגובות תאיות הנובעות משינויים בהיצמדות תאים ופריסתם המושרים על ידי ליגנד, רעילות, פרוליפרציה, נדידה, וכל שינוי בקרבתה של ממבנאת הפלסמה לביוסנסור האופטי.

לטכניקה יש גם פוטנציאל לשימוש בגילוי גישות טיפוליות חדשות למחלות הנגרמות מהפרעות בתעלות יונים או ברצפטורים, כגון רבות מהצ'אנלופתיות (channelopathies), מכיוון שניתן להשתמש בה כשיטה בעלת תפוקה גבוהה לבחינת ההשפעות של חומרים פרמקולוגיים על חלבוני התעלה. אינטראקציות בין חלבונים. הרעיון להשתמש בשיטה זו עלה לראשונה כאשר הבנו כי יש צורך לפתח בדיקה שתוכל לבחון אינטראקציות בין חלבוני תעלה בתאים חיים.

התחילו את ציפוי פלטת החיישן הביולוגי האופטית בעלת 384 בארות על ידי הידרציה של פלטת טיטניום דיאוקסיד באמצעות 20 µL של מים סטריליים בדרגת תרבית רקמה לכל בארה למשך 15 דקות. לאחר מכן, השתמשו בפיפט רב-ערוצי (16 ערוצים) כדי לשטוף את הפלטה פעם אחת עם 50 µL של תמיסת PBS או phosphate buffered saline לכל בארה.

בשלב הבא, הוסף 20 µL של תמיסת עבודה מוכנה של פיברונקטין לכל באער לפני הדגרה למשך שעתיים בטמפרטורת החדר ליצירת המטריקס החוץ-תאי או ECM לאחר ההדגרה. שטוף את הפלטה פעם אחת עם 50 µL של PBS לכל באער, ולאחר מכן הוסף 40 µL של תמיסת עבודה מוכנה של אובלבמין לכל אחד.

דגרו את הפלטה למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C כדי לחסום את הפלטה לאחר קישור האובאלבומין. שטפו את הפלטה שלוש פעמים עם 50 µL של PBS לכל באר. ניתן לשמור פלטות מצופות ECM בטמפרטורה של 4 °C למשך עד 48 שעות.

הסיר את מצע הגידול הן מתאי HEK 2 93 שאינם שעברו רזקציה והן מתאי HEK 2 93 המבטאים באופן יציב את slack B אשר תורבעו כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, הוסף tripsin כדי לשחרר את התאים מהפלטה. אסוף את התאים בצנטריפוגה ב-1000 ×g למשך דקה אחת.

הסיר את מצע ה-tripsin ושחזר את התאים במצע גידול. באמצעות המוסימטר (hemocytometer) או סופר תאים אוטומטי, קבע את ריכוז התאים; כדי למזער את השפעות האידוי במהלך האינקובציה, מהל את התאים כדי להגיע למספר התאים הרצוי לכל באר. בניסויים אלו, השתמש בנפח של 50 µL של מצע גידול עבור 1000 תאים לבאר.

התאים נזרעו על הביוסנסור לאחר פבט של 50 µL מהתאים המדוללים לכל באר; יש להניח לתאים השקעים להדגירה למשך לילה במצע גידול בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO2. להכנת בדיקת ביוסנסור אופטי של מדבב אורך גל רזוננסי (RWG), יש להסיר את מצע הגידול מהתאים לאחר ההדגירה.

שטפו את התאים פעם אחת עם תמיסת מלח מאוזנת של הנק (Hank's balanced salt solution) ולאחר מכן הוסיפו 25 µL מהתמיסה לכל באר. הניחו את פלטת הביוסנסור על סורק הקישור (bind scanner) והמתינו שהתאים יגיעו לשיווי משקל בטמפרטורת החדר במשך שעה עד שעתיים. בינתיים, הכינו פלטת תרכובות נפרדת ממנה יתווספו ליגנדים רלוונטיים לפלטת הביוסנסור במהלך הבדיקה.

עבור בדיקות אלו, 25 µL של תמיסה המכילה את התרכובת הוספו לכל באר בלוח הביוסנסור, לנפח כולל של 50 µL. לביצוע בדיקת הביוסנסור האופטי מסוג RWG, בצעו מדידת קו בסיס באמצעות מערכת הסריקה עבור בארות A1 עד P12, המהוות מחצית מלוח ה-384 בארות; השתמשו ברזולוציה מרבית של 3.75 microns per pixel עבור 1.5 mm המרכזיים של כל באר באמצעות תוכנת ה-bind scan. סריקת קו בסיס זו תארך כ-30 דקות.

לאחר מכן, הוסף 25 µL מתמיסות התרכובות לכל באער, עבור באערים A 1 עד P 12. לאחר מכן, בצע מדידת בסיס לבאערים A 13 עד P 24. בעקבות מדידת הבסיס של באערים אלו, הוסף 25 µL מתמיסות התרכובות לכל אחד מהבאערים A 13 עד P 24.

כשלב סופי, בצעו מדידה לאחר הוספת התרכובת עבור בארות A1 עד P12, וחזרו על הפעולה עבור בארות A13 עד P24. כדי לנתח את נתוני הבדיקה, פתחו את נתוני בדיקת הקישור (bind assay) עבור מדידת קו הבסיס בחלונות, ולחצו על כפתור עורך הגריד (grid editor) כדי לאפשר בחירת תאים. התוכנה תחשב מדדים רלוונטיים שהוגדרו על ידי המשתמש; פתחו את התוספים (plugins), הכוללים את מאתר התאים (cell finder) וקו הבסיס, או הגדירו את פרמטרי הפונקציה במאתר התאים כך שהתאים יהיו ניתנים להבחנה מרקע הביוסנסור.

ייצאו את קובץ מפת התאים, המכיל את נתוני איתור התאים עבור מדידת הבסיס (baseline). חזרו על שלבים אלו עבור נתונים לאחר הוספת התרכובת. לאחר מכן, פתחו את הבסיס או את התוסף (plugin) וייבאו את מפת התאים ממדידת הבסיס.

התוכנה תחשב את ההיסט בערך אורך גל השיא, או PWV, בין נתוני הרקע לנתונים לאחר הוספת התרכובת. בחר ב-delta cell mean כדי לקבל כפלט את ההיסט הממוצע ב-PWV עבור תאים. לאחר מכן ניתן לייצא את הנתונים ל-Microsoft Excel לצורך ניתוח נוסף.

תאי HEK 2 93 שעברו טרנספקציה יציבה של Slack b ותאי HEK 2 93 שאינם רסקטיביים כביקורת, הונחו בריכוז של 1000 תאים לבאר בלוחות ביו-סנסור RWG עם ציפוי ECM בעלי 384 בארות; מפות מדרג צפיפות של מסה הופקו לפני ו-30 דקות לאחר הוספת התרכובת באמצעות bind scan.

אזורי התוכנה המוצגים באדום מייצגים פיקסלים שזוהו כשייכים לתאים, וקווים צהובים מפרידים בין התאים לרקע האפור של הפלטה. תוכנת ה-bind view שימשה לקביעת השינוי ב-PWV בעקבות הוספת אגוניסט של GPCR, וזאת על ידי חיסור ה-PWV לאחר הוספת התרכובת מה-PWV בקו הבסיס. נתון זה מוצג באמצעות מדרג צבעים, שבו אדום מייצג שינוי חיובי בערך אורך הגל של השיא (peak wavelength value) וכחול מייצג היעדר שינוי.

הקולטן המוסקריני M1 האנדוגני נגד carbahol הוחל הן על תאי HEK 2 93 של ביקורת שלא עברו טרנספקציה והן על תאי HEK 2 93 המבטאים באופן יציב את slack B, והביא לעלייה חיובית בערך אורך הגל בשיא בהשוואה לתאי הביקורת. בתאים שעברו טרנספקציה ב-slack B נרשמה עלייה גדולה יותר בערך אורך הגל בשיא. S-F-L-L-R NH two, tri fluoro acetate salt ופפטיד פנטה-פפטיד המפעיל קולטן תרומבין קטעי, המפגין פעילות אגוניסטית נגד GPCR הפרוטאיז-מופעל receptor one האנדוגני, הראו אף הם תגובות שונות בתאים שלא עברו טרנספקציה ובתאים שעברו טרנספקציה ב-slack B.

תוצאות אלו מראות כי נוכחותו של תעלת Slack B מגבירה משמעותית את השינוי ב-PWV המתרחש עם הפעלת G PCR אנדוגני בתאי he K, ומדגימה את ההיתכנות של שימוש במבחן זה לחקר אינטראקציות בין חלבוני תעלות. לאחר צפייה בסרטון זה, תגמירו להבנה טובה של אופן הפיתוח והביצוע של מבחן ביו-סנסור אופטי ללא סימון. לאחר שליטה בטכניקה, ניתן לבצעה במהלך יומיים, בתנאי שהתאים והריאגנטים הוכנו בקפידה במהלך ביצוע הפרוטוקול.

חשוב לזכור כי יש לבצע אופטימיזציה של פרמטרי הבדיקה עבור קווי תאים שונים, כגון מספר התאים להזרעה, זמן אינקובציה של ליגנדים וכדומה. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון R ו-AI, כדי לנסות ולקבוע אילו חלבונים ספציפיים נדרשים לשינוי שנצפה באות. אין לשכוח כי עבודה עם תרביות תאים אנושיות עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון עבודה במכנס בטיחות ביולוגית (biosafety hood), בעת ביצוע הליך זה.