ניתוח של תגובות RNA עיבוד באמצעות מערכות חינם ניידים: 3 'סוף המחשוף של Pre-mRNA מצעים במבחנה
3 במאי 2014
RNA פולימראז II מסנתז RNA מבשר שמשתרע מעבר לקצה '3 של ה-mRNA הבוגרת. סוף RNA הבוגר מופק cotranscriptionally, באתר מוכתב על ידי רצפי הרנ"א, באמצעות פעילות endonuclease של מתחם המחשוף. הנה, אנחנו פירוט את השיטה ללמוד תגובות מחשוף במבחנה.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לבחון בהצלחה שלושה מחשוף mRNA ראשוני במבחנה. זה מושג על ידי יצירת תמצית גרעינית פעילה שעתוק מתאים הגדלים בתרחיף. השלב השני של ההליך הוא יצירת מצעי RNA מסומנים ברדיו באמצעות שעתוק במבחנה.
השלב השלישי הוא טיהור ג'ל של מצעי ה-RNA המסומנים בתווית. השלב האחרון הוא הרכבת תגובת המחשוף, כולל התמצית הגרעינית ומצע ה-RNA המסומן. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות שלושה mRNA ראשוניים, מצעים שסועים UNC ותוצר שסוע באמצעות אלקטרופורזה אנכית של ג'ל רדיואקטיבי.
הדגמה חזותית של שיטה זו חשובה, למרות שהיא מבוצעת מאז שנות השמונים, היא אינה מבוצעת בקלות מכיוון שיש הרבה שלבים ספציפיים לאורך ההליך שהם מאתגרים. יש תאים שטופים, כדורים ומוכנים לליזוף. כדי להתחיל פרוטוקול זה לגלולת התא, הוסף מאגר עם DTT טרי.
הוסף חמישה נפחים של ה-CPV המשוער והשתמש בפיפטה כדי לפרק את הגלולה ולאפשר לתרחיף להתקרר על קרח. לאחר 10 דקות, סובבו את התאים בארבע מעלות צלזיוס בדלי מתנדנד. צנטריפוגה שואבים בזהירות מהסופרנטנט.
הגלולה תספוג תמיסה כלשהי ותנפח בגודלה. לאחר מכן הוסף CPV אחד של מאגר A, ושבר בעדינות את הגלולה עם קצה פיפטה. יוצקים את התרחיף להומוגניזטור צונן, ועם חמש עד 12 משיכות של עלי הדוק את התאים.
הסר אליקוט קטן, החל טריאן כחול ובדוק את התאים כדי לקבוע את שלמות הליזיס שלהם. במידת הצורך, המשיכו להומוגניזציה של התאים עד שהם יעברו ליזה של 90%, אך אל תגזימו. כעת העבירו את הליזאט לצינור אולטרה-צנטריפוגה שקוף במיוחד.
רשום את הנפח הכולל וסובב אותו כפי שנעשה קודם לכן. שאפו את הסופרנטנט העכור ושמרו אותו על קרח. ולניתוח ציטוזול, היזהר לא להפריע לגלולה.
הוא מכיל את הגרעינים. לאחר מכן, סובב את הכדור במהירות גבוהה למשך 15 דקות. הסר את הנפח הקטן של הסופרנטנט שנותר ואגד אותו עם אוסף הציטוזול.
לאחר מכן קבע את הנפח הגרעיני של PACT. הוסף נפח שווה ערך למאגר C לגלולה. לאחר מכן עקור את הגלולה באמצעות הפיפטה בהומוגנייזר נקי.
השתמש בחמש עד 10 משיכות עלי הדוקות כדי להחיות אותו. השעו את הגלולה. מעבירים את ההומוגנאט לצינור צונן ומערבבים אותו בהיפוך למשך 30 דקות.
בארבע מעלות צלזיוס מותר להשתמש בצלחת ערבוב. אם הנפח גדול מספיק, העבירו את הליזט לצינור אולטרה-צנטריפוגה UltraClear ובארבע מעלות צלזיוס, סובבו אותו למשך 30 דקות. במשקל של כ-25,000 גרם, הסופרנטנט הוא התמצית הגרעינית.
בהתאם לפרוטוקול הטקסט, השלם את הדיאליזה ממיקרוגרם אחד בלבד של תבנית. הכן את הגשושית על ידי שעתוק במבחנה באמצעות ערכה עם מקדם תואם SP six או T 7. בעת טעינת הדף, השתמש בשלושה מיקרוליטרים של סמן ובכל 25 המיקרוליטרים של התגובה עבור כל מצע RNA.
מנע גם זיהום צולב על ידי ריווח הנתיבים של תמלילים בגודל דומה. הפעל את הג'ל כך שבדיקה של 600 נוקלאוטידים תפעל ב-25 וואט במשך כשעתיים לאחר מכן. כדי לסמן את מיקום רצועות הג'ל, האירו את הסרט החשוף בקופסת אור והניחו את הג'ל העטוף מעל.
יישר את סמן הראד האוטומטי ואת הסמן החשוף על הסרט. ואז סמן את מיקומי הלהקה בטוש שחור כדי להסיר את הרצועות פתח את הג'ל. ובעזרת להב נקי מסירים את חלקי הרצועה של הג'ל מעבירים כל חלק לצינור משלו ומסירים את ה-RNA החוצה בהתאם לנהלים הסטנדרטיים.
לאחר הכנת כל הריאגנטים, מחממים את ה-RNA המסומן ל-80 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות. לאחר מכן העבירו את ה-RNA למערבולת קרח, ה-10% PVA, ואז סובבו אותו במהירות גבוהה למשך כמה דקות כדי להסיר בועות, ואז המשיכו להכין את תערובות המאסטר עבור כל תגובה. עבור כל תגובה, יש להוציא 5.25 מיקרוליטר של תערובת מאסטר אחת.
לאחר מכן, הוסף 6.25 מיקרוליטר מתערובת התמצית הגרעינית. לאחר מכן הוסף מיקרוליטר של מצע RNA מסומן מדולל ל -50 אנו מולר בסך הכל. כל תגובה משתמשת בפחות מחמש מולאריות המסומנות RNA.
כעת, מערבולת בעדינות וסובב במהירות את תערובות התגובה. אפשר לתגובה להתרחש עד שעתיים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס. לקיחת מהלך זמן של התגובה תספק את התוצאות הטובות ביותר לאחר שימוש בפרוטאינאז K לעיכול החלבון בתגובה ולאחר מכן טיהור התגובה בשיטת פנול כלורופורם, הפעל את המוצרים בעומס עמודים של 6%, שלושה מיקרוליטר סמן או חמישה מיקרוליטר לכל תוצר תגובה לכל נתיב.
לאחר מכן הפעל את הג'ל ובהמשך פרק בזהירות את מנגנון הג'ל. כדי לאסוף את הג'ל, לחץ עליו בחוזקה נייר סינון והפוך אותו. לחץ בחוזקה על הזכוכית כדי לוודא שהג'ל נאחז במלואו על ידי הנייר.
לאחר מכן קלף לאט את נייר הסינון כשהג'ל מחובר. עטפו את הצד החשוף של הג'ל בניילון והדביקו את הניילון לנייר הסינון בצד השני. סיים בהכנסת הג'ל למייבש למשך 15 דקות כשנייר הסינון פונה לשואב.
מאוחר יותר, נתח את הג'ל על ידי חשיפתו לסרט או להדמיית פוספו. השסוע. מצע RNA הוא הרצועה הנודדת האיטית ביותר בחלק העליון של הג'ל.
המוצר הספציפי השסוע המסומן בחץ מודגש, פועל מהר יותר בג'ל בגודל הצפוי. תוצר זה נעדר מהבקרה עם מוטציה נקודתית ברצף האבקה. כימות פעילות המחשוף נקבע באמצעות תרשים מטרי DS.
השוואת היחס בין RNA שסוע לשסוע, מנורמל לביקורת RNA שסוע. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו בדיקת פוליאדנילציה כדי לענות על שאלות נוספות כגון הפעילות של פולימראז polyA. בדיקה זו נעשית על ידי שינוי תנאי התגובה כגון הוספת מגנזיום והסרת EDTA.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מתמקד בבחינה של שברים של mRNA מסוג prime three in vitro, תהליך חיוני בהבשלת RNA. השיטה כוללת שימוש בתמצית גרעינית פעילה תעתוקית ובסובסטרטים של RNA המסומנים רדיואקטיבית לצורך ניתוח תגובות השבירה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביולוגיה של RNA
- ביולוגיה מולקולרית
- ביוכימיה
רקע
- RNA polymerase II מסנתז RNA מקדים הממשיך מעבר לקצה ה-3' של ה-mRNA הבשל.
- קומפלקס השחלוף (cleavage complex) קובע את האתר ליצירת ה-RNA הבשל.
- תהליכים המתרחשים במקביל לשעתוק (Cotranscriptional processes) חיוניים להבשלת ה-RNA.
- הבנת תגובות השחלוף יכולה לספק תובנות לגבי מנגנוני עיבוד ה-RNA.
מטרת המחקר
- בחינת שסוע mRNA בעמדה ראשונית שלישית in vitro.
- הבנת תפקידם של תמרירי גרעין בעיבוד RNA.
- ניתוח תוצרי תגובות השסוע באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל.
שיטות שהשמשו
- הכנת תמצית גרעינית פעילה תעתוקית מתאים שגודלו בתרחיף.
- סינתזה של סובסטראטי RNA המסומנים רדיואקטיבית באמצעות תעתוק in vitro.
- טהרת ג'ל של סובסטראטי RNA המסומנים.
- הרכבת תגובות שס עם תמצית גרעינית וסובסטראטי RNA מסומנים.
תוצאות עיקריות
- נצפתה שחייה מוצלחת של שלושה סובסטראטים של mRNA' בקצה ה-3'.
- התוצאות נותחו באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל רדיואקטיבי אנכי.
- זוהו סובסטראטים ששוחו על ידי UNC ומוצרי שחייה.
- המתודולוגיה מספקת מסגרת לחקר תגובות שחייה של RNA.
מסקנות
- מחקר זה מתווה שיטה מהימנה לבחינת שסוע mRNA in vitro.
- הבנת מנגנוני השסוע יכולה להעמיק את הידע על עיבוד RNA.
- התוצאות תורמות לתחום הרחב של ביולוגיית ה-RNA.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הבנת עיבוד הקצה' 3 של ה-RNA היא קריטית לאישור יעדי טיפול בתרופות מבוססות RNA, שבהם הבשלה מדויקת של התמליל משפיעה על רמות ביטוי החלבון ועל תוצאות תפקודיות. בדיקת השחלה (cleavage) זו in vitro מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית על ידי בידוד הדרישות הביוכימיות לעיבוד מדויק של pre-mRNA, ובכך תומכת בביטחון ניבוי לגבי מעורבות היעד. השיטה מספקת מערכת כמותית הניתנת לשחזור להערכת האופן שבו הפרעות גנטיות או פרמקולוגיות משפיעות על יציבות ותפקוד ה-RNA, ובכך מסייעת לקבלת החלטות בשלבי הגילוי המוקדמים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של מנגנוני עיבוד RNA כדי לתקף יעדים ספציפיים לתמליל המעורבים בבקרה של ביטוי גנים.
- ערך תפעולי: מספק מערכת מבוקרת להערכה של האופן שבו מוטציות באותות פוליאדנילציה משפיעות על יעילות השבירה ועל יציבות ה-RNA.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר קריאות כמותיות של תוצרי פיסול (cleavage products) כדי לתמוך בסטנדרטיזציה של בדיקה לסריקת מודולטורים של גורמי עיבוד RNA.
- ערך תפעולי: משתמש בזיהוי מבוסס ג'ל כדי להבטיח הדירות ויכולת הרחבה על פני מגוון סובסטראטים של RNA ותנאים ניסיוניים.
מחקר תרגומי ו-Preclinical
- ערך מדעי: תומך במידול רלוונטי למחלות על ידי קישור פגמים בעיבוד RNA לאיזופורמים שגויים של תמלילים הנצפים במצבים פתולוגיים.
- ערך תפעולי: מאפשר רציפות מגילוי מנגנוני ועד לתיקוף פרה-קליני, על ידי הגדרת ספי תגובה ביוכימיים להבשלה פונקציונלית של RNA.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
הבדיקה משתלבת ברצף של שלבי הגילוי המוקדמים, שבהם תיקוף של מטרת ה-RNA מקדים את זיהוי המולקולה המובילה (lead) ואת ההערכה הפרה-קלינית, וזאת על ידי הבהרת ההשפעה הפונקציונלית של עיבוד התעתוק על תפוקת החלבון.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי אלמנטים רגולטוריים של RNA ובצמצום סיכונים מכניסטיים של מטרות המעורבות בהבשלת mRNA.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה באמצעות הכנה סטנדרטית של סובסטרט וזיהוי כמותי של התוצר באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל.
- אנליזה: מאפשרת השוואה של יעילות השחור (cleavage) בין תנאים שונים באמצעות יחסי תוצר-סובסטרט מנורמלים לצורך תיעדוף מטרות מבוסס נתונים.
- מחקר תרגומי: מקשר לעבודה פרה-קלינית על ידי הגדרת כשירות העיבוד כסמן ביולוגי להתאמה לטיפול מבוסס RNA.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כפלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר להערכת שיטות התמרה המכוונות ל-RNA במספר תוכניות ומחלקות של מטרות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות RNA על ידי הפחתת העמימות במנגנוני עיבוד התמלילים.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזוריות באמצעות הכנה סטנדרטית של תמצית גרעין וכמות של סובסטרט מסומן.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות לגבי המשך או הפסקת התהליך (go/no-go) על ידי קישור דיוק עיבוד ה-RNA לביטוי החלבון המצופה ולתוצאות תפקודיות.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר קידום מותאם סיכונים על ידי זיהוי מטרות בעלות פרופילי הבשלה של RNA חסונים וניתנים לוויסות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביולוגיה מולקולרית, ביוכימיה של RNA וטכניקות סימון רדיואקטיבי.
- תלוי בתשתיות של אולטרה-צנטריפוגציה, אלקטרופורזה של ג'ל ואוטורדיוגרפיה לצורך הכנת תמריות גרעיניות וזיהוי תוצרים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים בעיצוב הסובסטרט, בתנאי התגובה ובשיטות הכימות כדי להבטיח השוואתיות.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום הבדיקה על סובסטראטים שונים של RNA או מערכות רלוונטיות למחלות.
- מוגבל בשל המורכבות הטכנית של בידוד תמריות גרעיניות והצורך באופטימיזציה קפדנית למניעת פירוק לא ספציפי.
