Name: ניתוח של תגובות RNA עיבוד באמצעות מערכות חינם ניידים: 3 סוף המחשוף של Pre-mRNA מצעים במבחנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: חקור חיתוך mRNA בקצה 3' במערכת חינם ניידים באמצעות תמצית גרעינית פעילה וחומרי מצע מסומנים ברדיואקטיביות. השיטה מאפשרת ניתוח תוצרי חיתוך באלקטרופורזה ג'ל רדיואקטיבית אנכית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SV הוא אסירת תודה על התמיכה במימון K22AI077353 NIH וקרן Landenberger. KR מודה בתודה מימון מ-NIH (5SC1GM083754).

<ol><li>Maniatis, T., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extensive+network+of+coupling+among+gene+expression+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An extensive network of coupling among gene expression machines.</a> Nature. 416, 499-506 (2002).</li>
<li>Wahle, E., Ruegsegger, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3%27-End+processing+of+pre-mRNA+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+microbiology+reviews%22%5BJournal%5D)">3'-End processing of pre-mRNA in eukaryotes.</a> FEMS microbiology reviews. 23, 277-295 (1999).</li>
<li>Colgan, D. F., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+regulation+of+mRNA+polyadenylation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Mechanism and regulation of mRNA polyadenylation.</a> Genes Dev. 11, 2755-2766 (1997).</li>
<li>Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+3%27+untranslated+region+in+post-transcriptional+regulation+of+protein+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+biology%22%5BJournal%5D)">The role of the 3' untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells.</a> RNA biology. 9, 563-576 (2012).</li>
<li>Danckwardt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prothrombin+3%27end+formation+signal+reveals+a+unique+architecture+that+is+sensitive+to+thrombophilic+gain-of-function+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The prothrombin 3'end formation signal reveals a unique architecture that is sensitive to thrombophilic gain-of-function mutations.</a> Blood. 104, 428-435 (2004).</li>
<li>Moreira, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+upstream+sequence+element+of+the+C2+complement+poly%28A%29+signal+activates+mRNA+3%27+end+formation+by+two+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The upstream sequence element of the C2 complement poly(A) signal activates mRNA 3' end formation by two distinct mechanisms.</a> Genes Dev. 12, 2522-2534 (1998).</li>
<li>Hall-Pogar, T., Zhang, H., Tian, B., Lutz, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+polyadenylation+of+cyclooxygenase-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Alternative polyadenylation of cyclooxygenase-2.</a> Nucleic Acids Res. 33, 2565-2579 (2005).</li>
<li>Brackenridge, S., Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+a+basal+polyadenylation+factor+by+the+upstream+sequence+element+of+the+human+lamin+B2+polyadenylation+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Recruitment of a basal polyadenylation factor by the upstream sequence element of the human lamin B2 polyadenylation signal.</a> Molecular and Cellular Biology. 20, 2660-2669 (2000).</li>
<li>Moore, C. L., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+cleavage+and+polyadenylation+of+exogenous+RNA+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Accurate cleavage and polyadenylation of exogenous RNA substrate.</a> Cell. 41, 845-855 (1985).</li>
<li>Gilmartin, G. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGilmartin%2C+GM+%22mRNA+formation+and+function%22">mRNA formation and function</a>. , Academic Press. New York. 79-98 (1997).</li>
<li>Wahle, E., Keller, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWahle%2C+E+%22RNA+Processing.+Vol.+II%22">RNA Processing. Vol. II</a>. , Oxford University Press. 1-34 (1994).</li>
<li>Chabot, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChabot%2C+B+%22RNA+Processing+Vol+I%22">RNA Processing Vol I</a>. 1, Oxford University Press. 1-29 (1994).</li>
<li>Valente, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+mRNA+3%27+end+processing+is+distinctively+regulated+by+eIF3f%2C+CDK11%2C+and+splice+factor+9G8%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">HIV-1 mRNA 3' end processing is distinctively regulated by eIF3f, CDK11, and splice factor 9G8.</a> Mol Cell. 36, 279-289 (2009).</li>
<li>Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+transcription+initiation+by+RNA+polymerase+II+in+a+soluble+extract+from+isolated+mammalian+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei.</a> Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489 (1983).</li>
<li>Aurup, H., Williams, D. M., Eckstein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%27-Fluoro-+and+2%27-amino-2%27-deoxynucleoside+5%27-triphosphates+as+substrates+for+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">2'-Fluoro- and 2'-amino-2'-deoxynucleoside 5'-triphosphates as substrates for T7 RNA polymerase.</a> Biochemistry. 31, 9636-9641 (1992).</li>
<li>Keller, W., Bienroth, S., Lang, K. M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+and+polyadenylation+factor+CPF+specifically+interacts+with+the+pre-mRNA+3%27+processing+signal+AAUAAA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Cleavage and polyadenylation factor CPF specifically interacts with the pre-mRNA 3' processing signal AAUAAA.</a> EMBO J. 10, 4241-4249 (1991).</li>
<li>Takagaki, Y., Ryner, L. C., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+factors+are+required+for+3%27-end+cleavage+of+pre-mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Four factors are required for 3'-end cleavage of pre-mRNAs.</a> Genes Dev. 3, 1711-1724 (1989).</li>
<li>Takagaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multisubunit+factor%2C+CstF%2C+is+required+for+polyadenylation+of+mammalian+pre-mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A multisubunit factor, CstF, is required for polyadenylation of mammalian pre-mRNAs.</a> Genes Dev. 4, 2112-2120 (1990).</li>
<li>Ruegsegger, U., Blank, D., Keller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pre-mRNA+cleavage+factor+Im+is+related+to+spliceosomal+SR+proteins+and+can+be+reconstituted+in+vitro+from+recombinant+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Human pre-mRNA cleavage factor Im is related to spliceosomal SR proteins and can be reconstituted in vitro from recombinant subunits.</a> Mol Cell. 1, 243-253 (1998).</li>
<li>Vries, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pre-mRNA+cleavage+factor+II%28m%29+contains+homologs+of+yeast+proteins+and+bridges+two+other+cleavage+factors%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Human pre-mRNA cleavage factor II(m) contains homologs of yeast proteins and bridges two other cleavage factors.</a> EMBO J. 19, 5895-5904 (2000).</li>
<li>Gilmartin, G. M., Nevins, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ordered+pathway+of+assembly+of+components+required+for+polyadenylation+site+recognition+and+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">An ordered pathway of assembly of components required for polyadenylation site recognition and processing.</a> Genes Dev. 3, 2180-2190 (1989).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+the+human+pre-mRNA+3%27+processing+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex.</a> Mol Cell. 33, 365-376 (2009).</li>
<li>Bentley, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rules+of+engagement%3A+co-transcriptional+recruitment+of+pre-mRNA+processing+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rules of engagement: co-transcriptional recruitment of pre-mRNA processing factors.</a> Curr Opin Cell Biol. 17, 251-256 (2005).</li>
<li>Tian, B., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+cleavage+and+polyadenylation%3A+the+long+and+short+of+it%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Alternative cleavage and polyadenylation: the long and short of it.</a> Trends Biochem Sci. 38, 312-320 (2013).</li>
<li>Ryner, L. C., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+accurate+and+efficient+mRNA+3%27+end+cleavage+and+polyadenylation+of+a+simian+virus+40+early+pre-RNA+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Requirements for accurate and efficient mRNA 3' end cleavage and polyadenylation of a simian virus 40 early pre-RNA in vitro.</a> Molecular and Cellular Biology. 7, 495-503 (1987).</li>
<li>Hirose, Y., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creatine+phosphate%2C+not+ATP%2C+is+required+for+3%27+end+cleavage+of+mammalian+pre-mRNA+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Creatine phosphate, not ATP, is required for 3' end cleavage of mammalian pre-mRNA in vitro.</a> J Biol Chem. 272, 29636-29642 (1997).</li>
<li>Ryan, K., Khleborodova, A., Pan, J., Ryan, X. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+activators+of+pre-mRNA+3%27+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Small molecule activators of pre-mRNA 3' cleavage.</a> RNA. 15, 483-492 (2009).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

התגובה במבחנה &#39;מראש mRNA 3 מחשוף, שבוצעה בתמציות גרעיניות תא הלה או עם גורמי מחשוף מופרדים מתמציות אלה, אפשרה זיהוי של גורמי מחשוף הליבה והמכלולים העיקריים שלהם 16-21. לאחרונה חלבונים רבים יותר הקשורות לגורמים אלה זוהו 22, והתגובה במבחנה יכולה להמשיך ולשפוך אור על כמה חלבונים אלה תורמים לתגובה. אולי בגלל התגובה in vivo נראית 23 cotranscriptional, או משום שכמה גורמים תורמים עלולים ללכת לאיבוד בעת חילוץ ודיאליזה, היעילו...

ביוסינתזה של רוב RNAs הבוגר אוקריוטים הודעה (mRNAs) דורשת מספר שינויים לאחר תעתיק כגון מכסת, שחבור וpolyadenylation. שינויים אלה הם בדרך כלל בשילוב כדי להבטיח עיבוד נכון 1 ומאוד להגדיל את היציבות של mRNA. 3 &#39;היווצרות סוף מראש mRNAs יונקים מופקת על ידי מחשוף endonucleolytic של RNA המתהווה אחריו תוספת של שאריות adenylate ל5&#39; ביקע מוצר על ידי פולי פולימראז (א) (PAP) 2-4. ביונקים, מחשוף מושגת על ידי חלבון מורכב multicomponent, של כ 800 kDa, אשר מרכיב על רצפים מראש RNA ספציפיים. פולי () רצף אות, AAUAAA רצף hexanucleotide הקנונית השמור ביותר, מכוונים את אתר המחשוף בכ 10-30 NT במורד הזרם. אתר זה מוכר במיוחד על ידי גורם המחשוף וpolyadenylation הסגוליות (CPSF) ומקטע KD 73 שלCSPF מכיל את פעילות endonuclease. גורם גירוי המחשוף (CstF) נקשר יותר מנוון רצף אלמנט GU-U או עשיר במורד הזרם של פולי (א &#39;) באתר. נדרשו גם למחשוף הוא גורם היונקים המחשוף אני (CFIm), וגורם היונקים המחשוף השני (CFII). CFIm נקשר אתרי UGUA (N) הספציפיים באלמנטים במעלה הזרם רצף (שימושים) שהוגדרו עבור מספר גנים ונראה שהם מעורבים בתהליכים פיסיולוגיים חשובים 5-8. במבחנה, תגובות עיבוד RNA מנותחות בדרך כלל על ידי השימוש במצעי RNA רדיואקטיבי 9-12. אלה עשויים להיות מסונתזים על ידי שעתוק נגר מT7 אמרגן bacteriophage או SP6. כאשר לומדים אתר polyadenylation שלא אפיין בעבר, יש צורך להשתמש בהדנ&quot;א הגנומי ולא cDNA כדי ליצור את מצע RNA, כרצפים במורד הזרם חשובים לא יכולים להיות נוכחים בcDNA. מצעי עיצוב לכלול לפחות 150 upstrea NTמ &#39;ו50 NT במורד הזרם מאתר המחשוף / סיום על mRNA הבוגר. מוצר המחשוף נודד מהר יותר מאשר המצע; עם זאת, בגלל שברים אחרים עלולים להיווצר על ידי פעולת nuclease שאינו ספציפית, את הספציפיות של התגובה צריכה להיות מאומתת על ידי תלותה ברצפי עיבוד אותות הנכונים. לכן, מצעי RNA עם מוטציה נקודתית ברצף AAUAAA (למשל AAGAAA) ישמשו כביקורת שלילית לתגובת המחשוף. בהתחשב בעובדה שכמות קטנה של RNA רדיואקטיבי משמשת לתגובות המחשוף, RNases הווה בשפע הגבוה ביותר בתמציות הגרעיניות יכולה להיות בעייתית, ולהגביל את הבחירה של החומר המוצא להכנת תמצית. תאי הלה נוטים להכיל רמות נמוכות של RNases אנדוגני, ובכך לבצע גם במבחנים אלה. מחשוף endonucleolytic של מצעי RNA in vivo ו במבחנה ומייד אחריו פולי (א) בנוסף לכך, ה &#39;ים ביניים ביקע אינם נוכחים בכמויות לזיהוי. לכן, כדי ללמוד או רצף RNA ספציפי או חלבונים מעורבים בתגובת מחשוף, ניסויים נעשים בתנאים המונעים polyadenylation התרחשות. אין תלות של מחשוף בpolyadenylation, או להיפך, ולכן אחד לא יכול לעצור polyadenylation מבלי לפגוע בתגובת המחשוף. לפיכך, ה-ATP מוחלפת אנלוגי שרשרת סיום שחסרת ​​קבוצת הידרוקסיל &#39;3, כך שרק נוקלאוטיד יחיד יכול להיות משולב באתר פולי () ורק RNA ביקע ניתן לאתרם. בהתחשב במורכבות וברמה גבוהה של ייחוד של סוג זה של assay, אנו מתארים פרוטוקול וידאו מפורט ללמוד מחשוף endonucleolytic ידי מכונות מחשוף / midi () של מבשרי ה-mRNA במבחנה. אנו מתארים כיצד להכין תמציות גרעיניות המוסמכות, לייצר מצעי RNA רדיואקטיבי, לבצע את תגובת הביקוע, ולנתח ולפרש את התוצאהמוצרי ing. איור 1 מציג דוגמא של RNAs מצע קידוד לסוף &#39;3 ​​של HIV-1 מראש mRNAs לשמש לassay מחשוף. סוף &#39;3 ​​של הגנום RNA HIV מורכב מהרבה רצפים רגולטוריים חשובים כגון אתר פולי (א&#39;), אזור עשיר G + U, ואת אלמנט שימוש, אשר כולם הכרחיות להתבגרות יעילה של תעתיקי mRNA הנגיפי 13 . בדוגמא זו שהיינו מצפה מצע RNA הקלט להיות 338 NT ועל מחשוף 237 NT. אם polyadenylation הורשה להתרחש, כתם של מוצרים יהיה נצפה בין 237 ו437 NT.

<table><tbody><tr><td>בקבוק Celstir 1 L</td><td>Wheaton</td><td>356884</td><td>גדלים שונים זמינים</td></tr><tr><td>4 מצבים מערבל במהירות איטית</td><td>VWR</td><td>12621-076</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה דלי מתנדנדת</td><td>בקמן קולטר</td><td></td><td>אלגרה x-15R עם SX4500 רוטור</td></tr><tr><td>אולטרה-צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td></td><td>אופטימה L-100 XP Ultra עם SW41 רוטור</td></tr><tr><td>צנטריפוגה שולחנית 5417R</td><td>אינקובטור</td><td></td>תרמומיקסר Eppendorf מקרר Eppendorf 250 מ"ל צינורות חרוטיים קורנינג <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>430776</td><td></td></tr><tr><td></td><td>50 מ"ל צינורות צנטריפוגה</td> BD <td>Falcon</td> 352098 <td></td></tr><tr><td>Ultraclear</td><td>בקמן קולטר</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>JOKLIK שונה MEM</td><td>Lonza</td><td>04-719Q</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Atlas</td><td>F-0500-A</td><td>מומת בחום</td></tr><tr><td>L-glut:pen:strep</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>400-110</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH 8.0</td><td>Mediatech</td><td>46-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>פישר</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>MP ביו-רפואי</td><td>194844</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Alexis Biomedicals</td><td>280-001-G-010</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>פישר</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>5 M תמיסת נתרן כלורי</td><td>Mediatech</td><td>46-032-CV</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M תמיסת</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889-100 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום גופרתי</td><td>פישר</td><td>A702-500</td><td></td></tr><tr><td>טבליות קוקטייל מעכב פרוטאז ללא EDTA רוש</td><td></td><td>04 693 132 001</td><td></td></tr><tr><td>ערכת קלטות דיאליזה Slide-A-Lyzer</td><td>Thermo Scientific</td><td>66372</td><td>MWCO 7,000 0.5 מ"ל-3 מ"</td></tr><tr><td>ל 15 מ"ל סט מטחנת רקמות Dounce</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9938-1SET</td><td>גדלים שונים זמינים</td></tr><tr><td>הרחב ערכת PCR בנאמנות גבוהה</td><td>Roche</td><td>11 732 650 001</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP Mix</td><td>Invitrogen</td><td>Y02256</td><td>10 mM כל נוקלאוטיד</td></tr><tr><td>ערכת MaxiScript SP6/T7</td><td>אמביון</td><td>AM1322</td><td></td></tr><tr><td>m7G(5')ppp(5') G כובע RNA</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>S1404S</td><td></td></tr><tr><td>תבנית סמן המאה בתוספת</td><td>אמביון</td><td>AM7782</td><td></td></tr><tr><td>Easytides UTP [&alpha;-32P] 250 &mu; Ci</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU507H250UC</td><td></td></tr><tr><td>מאגר טעינת ג'ל II</td><td>אמביון</td><td>8546G</td><td></td></tr><tr><td>DEPC מים מטופלים</td><td>אמביון</td><td>AM9906</td><td></td></tr><tr><td>10x TAE</td><td>פישר</td><td>BP13354</td><td></td></tr><tr><td>10x TBE</td><td>אמרסקו מדעי החיים</td><td>0658-4L</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>פישר</td><td>BP399-20</td><td></td></tr><tr><td>אוריאה</td><td>פישר</td><td>BP169-212</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום פרסולפט</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher</td><td>BP150-20</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום אצטט</td><td>פישר</td><td>A637-500</td><td></td></tr><tr><td>40% 19:1 אקרילאמיד: ביס-אקרילאמיד</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0144</td><td></td></tr><tr><td>גליקוגן</td><td>רוש</td><td>10 901 393 001</td><td></td></tr><tr><td>100% אתנול מוחלט 200 הוכחה</td><td>Acros</td><td>61509-0040</td><td></td></tr><tr><td>פנול חומצה: כלורופורם</td><td>אמביון</td><td>9720</td><td>לנוזל</td></tr><tr><td>זינוק</td> RNA <td>פישר</td><td>SX18-4</td><td></td></tr><tr><td>מעכב Rnase</td><td>Promega</td><td>N261B</td><td></td></tr><tr><td>אלכוהול פוליוויניל- PVA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136-250G</td><td></td></tr><tr><td>קריאטין פוספט</td><td>Calbiochem</td><td>2380</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dATP</td><td>Fisher</td><td>BP2560-4</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Acros</td><td>23042-5000</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Fisher</td><td>BP1700-100</td><td></td></tr><tr><td>יחידת רצף מתכווננת</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z351881-1EA</td><td></td></tr><tr><td>קליפס קלסר</td><td>Office Depot</td><td>838-056</td><td></td></tr><tr><td>20 ס"מ x 42 ס"מ לוחות זכוכית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z352543</td><td>1 סט</td></tr><tr><td>לוחות זכוכית 20 ס"מ x 22 ס"מ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z35252-7</td><td>1 סט</td></tr><tr><td>20 ס"מ x 42 ס"מ לוחות קירור אלומיניום</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z352667</td><td>1 EA</td></tr><tr><td>0.4 מ"מ x 22 ס"מ מרווחים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z35230-6</td><td>1 SET</td></tr><tr><td>מרווחים 0.4 מ"מ x 42 ס"מ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z352314-1</td><td>1 SET</td></tr><tr><td>מסרק 8 בארות</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z35195-4</td><td>1 EA</td></tr><tr><td>מסרק 16 בארות</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z351962</td><td>1 EA</td></tr><tr><td>32 בארות מסרק</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z351970</td><td>1 EA</td></tr><tr><td>ציפוי דוחה ג'ל</td><td>C.B.S. Scientific</td><td>SGR-0401</td><td>או SGR-0101 לבקבוק בודד</td></tr><tr><td>טיפים לטעינת ג'ל</td><td>Rainin</td><td>GT-10-4</td><td>0.1-10 &mu; l</td></tr><tr><td>רצף PowerPac HV</td><td>Bio-Rad</td><td>PowerPac HV</td><td>5,000 V/500 mA/400 W</td></tr><tr><td>מייבש ג'ל דגם 583</td><td>Bio-Rad</td><td>דגם 583</td><td></td></tr><tr><td>משאבת ואקום הידרוטק למייבש ג'ל</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glogos II סמני זוהר בחושך</td> סרט <td>420201</td><td></td><td>אג'ילנט</td></tr><tr><td>8 x 10</td><td>סרט Midsci</td><td>BX810</td><td></td></tr><tr><td>14 x 17</td><td>Phoenix</td><td>F-BX1417</td><td></td></tr><tr><td>קלטת Autoradiography פישר</td><td></td><td>FBCA 1417</td><td>8 x 10 גודל זמין</td></tr></tbody></table>

ניתוח של תגובות rna עיבוד באמצעות מערכות חינם ניידים: 3 &#39;סוף המחשוף של pre-mrna מצעים<em&gt; במבחנה</em

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

סוף &#39;3 של mRNAs היונקים לא נוצר על ידי הפסקה פתאומית של שעתוק על ידי RNA פולימראז II (RNPII). במקום זאת, RNPII מסנתז mRNA המבשר מעבר לסוף RNAs הבוגר, ותהליך פעיל של פעילות endonuclease נדרש באתר ספציפי. מחשוף של RNA המבשר בדרך כלל מתרחש 10-30 NT במורד הזרם מאתר הקונצנזוס הפולה (AAUAAA) לאחר dinucleotides קליפורניה. חלבונים ממתחם המחשוף, חלבון מורכב multifactorial של כ 800 kDa, להשיג פעילות nuclease הספציפית הזה. רצפי הרנ&quot;א ספציפיים מעלה או במורדו של האתר הפולה לשלוט על הגיוס של מתחם המחשוף. מייד לאחר מחשוף, טרום mRNAs הם polyadenylated ידי פולימראז הפולה (PAP) כדי לייצר להבשיל הודעות RNA יציבים. עיבוד של סוף &#39;3 של תעתיק הרנ&quot;א ניתן ללמוד באמצעות תמציות גרעיניות סלולריות עם מצעי RNA רדיואקטיבי ספציפיים. לסיכום, 32 ארוכים &lt;/ Sup&gt; RNA מבשר uncleaved P-שכותרתו הודגרו עם תמציות גרעיניות במבחנה, ומחשוף נבחנים על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה וautoradiography. כאשר מחשוף ראוי מתרחש, קצר יותר 5 &#39;ביקע מוצר מזוהה וכימות. כאן, אנו מתארים assay המחשוף בפירוט משתמשים, כדוגמא, עיבוד הסוף &#39;3 של HIV-1 mRNAs.

תוצאות נציג של assay מחשוף של פולי RNA () אתרים של HIV-1 (איור 2). אנחנו יכולים לראות את מצע RNA uncleaved, המהווה את הלהקה הנודדת האיטית ביותר בחלק העליון של הג&#39;ל. המוצר ביקע הספציפי הוא להקת שבר קצרה יותר האינטנסיבית ביותר שפועלת מהר יותר בג&#39;ל בגודל הצפוי, ודווקא נעדר מassay המחשוף של mutpoly () שליטה המכיל מוטציה נקודתית ברצף הפולה RNA (mutPolyA) מצע. מוצרים פגומים של מצע הקלט עשויים לעתים להיות שנצפו. כימות של פעילות המחשוף עשויה להיקבע על ידי עלילת de...

RNA פולימראז II מסנתז RNA מבשר שמשתרע מעבר לקצה &#39;3 של ה-mRNA הבוגרת. סוף RNA הבוגר מופק cotranscriptionally, באתר מוכתב על ידי רצפי הרנ&quot;א, באמצעות פעילות endonuclease של מתחם המחשוף. הנה, אנחנו פירוט את השיטה ללמוד תגובות מחשוף במבחנה.

ניתוח של תגובות RNA עיבוד באמצעות מערכות חינם ניידים: 3 &#39;סוף המחשוף של Pre-mRNA מצעים<em&gt; במבחנה</em

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לבחון בהצלחה שסוף mRNA ראשוני in vitro. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת תמצית גרעינית פעילה תעתוקית מתאים שגודלו בתרחיף. השלב השני של ההליך הוא הכנת מצעי RNA מסומנים רדיואקטיבית באמצעות תעתוק in vitro.השלב השלישי הוא טיהור בגל של תַּסריטי ה-RNA המסומנים. השלב הסופי הוא הרכבת תגובת השבוב, הכוללת את התמצית הגרעינית ואת תַּסריט ה-RNA המסומן. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות שלושה סוגי mRNA ראשוני, תַּסריטים שלא שובבו על ידי UNC, ומוצר שבוב באמצעות אלקטרופורזה רדיואקטיבית אנכית בג'ל.הדגמה חזותית של שיטה זו היא חשובה; למרות שהיא מבוצעת מאז שנות ה-80, ביצועה אינו פשוט כיוון שישנם שלבים ספציפיים רבים לאורך הפרוטוקול המהווים אתגר. השתמשו בתאים שטופים, שהועברו למשקע ומוכנים לליזיס. כדי להתחיל בפרוטוקול זה, הוסיפו למשקע התאים באפר עם DTT טרי.הוסיפו חמישה נפחים של CPV מוערך והשתמשו בפיפט כדי לפרק את המשקע (pellet) והניחו לתמיחה להתקרר על קרח. לאחר 10 דקות, סובבו את התאים במהירות גבוהה (spin down) בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס בצנטריפוגה עם רותברים נתיבים (swinging bucket). שאבו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) מהצנטריפוגה.המשקע יספוג חלק מהתמיסה ויגדל בנפחו. לאחר מכן, הוסיפו נפח שווה (CPV) של בופר A, ופרקו בעדינות את המשקע באמצעות טיפ של פיפטה. שפכו את התוך-נתלה לתוך הומוגניזטור מקורר, ובחמש עד 12 תנועות של עקת דחוסה, רסקו את התאים.הוצאו אליקוט קטן, הוסיפו trypan blue ובדקו את התאים כדי לקבוע את מידת השלמות של הליזיס. במידת הצורך, המשיכו בהומוגניזציה של התאים עד ש-90% מהם יעברו ליזיס, אך הימנעו מפעולה מוגברת מדי. כעת העבירו את הליזאט למבובת אולטרה-צנטריפוגה שקופה במיוחד (ultra clear).רשמו את הנפח הכולל וסובבו את הדגימה כפי שנעשה קודם לכן. שאבו את העליל העכור ושמרו אותו על קרח. עבור ניתוח של הציטוזול, הקפידו לא להפריע למשקע.הוא מכיל את הגרעינים. לאחר מכן, סבבו את המשקע במהירות גבוהה למשך 15 דקות. הסירו את הנפח הקטן של העילאי שנותר ואספו אותו יחד עם דגימת הציטוזול.לאחר מכן קבעו את נפח הגרעינים של ה-PACT. הוסיפו למשקע נפח שווה של buffer C. לאחר מכן, פזרו את המשקע באמצעות פיפטה בתוך הומוגניזטור נקי.בצע חמישה עד 10 תנועות דחיסה חזקות בעזרת עלי פסטל (pestle) כדי להשעות את המשקע. העבר את ההומוגנאט למבחנה מקוררת וערבב באמצעות הפיכה למשך 30 דקות.ניתן להשתמש בערבוב מגנטי בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. אם הנפח גדול מספיק, העבירו את הליזט לשפופרת אולטרצנטריפוגה מסוג UltraClear, וסובבו אותה במהירות גבוהה למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. בערך ב-25,000 gs, הנוזל העליון (supernatant) הוא התמצית הגרעינית.בהתאם לפרוטוקול הכתוב, השלימו את הדיאליזה ממיקרוגרם אחד בלבד של תבנית. הכינו את הגשוש (probe) באמצעות תעתוק in vitro תוך שימוש בערכה עם פרומטור תואם SP6 או T7. בעת טעינת הג'ל, השתמשו ב-3 µL של מרקר ובכל 25 µL של התגובה עבור כל תסבך RNA.מנעו בנוסף זיהום צולב על ידי ריווח בין נתיבי תמלילים בעלי גודל דומה. הריצו את הג'ל כך שגשש של 600 נוקלאוטידים ירוץ בהספק של 25 watts למשך כשעתיים לאחר מכן. כדי לסמן את מיקום פסי הג'ל, האירו את הסרט החשוף באמצעות קופסת אור והניחו את הג'ל העטוף מעליו.יישרו את סימון ה-auto rad ואת הסימון החשוף על הסרט. לאחר מכן, סמנו את מיקומי הפסים בעזרת טוש שחור לצורך הסרת הפסים. פתחו את הג'ל, ובאמצעות להב נקי חתכו את מקטעי הפסים מהג'ל. העבירו כל מקטע לשפופרת נפרדת ובצעו אלוציה של ה-RNA בהתאם לנוהלים הסטנדרטיים.לאחר הכנת כל الريאגנטים, חממו את ה-RNA המסומן ל-80 °C למשך שתי דקות. לאחר מכן, העבירו את ה-RNA לקרח, בצעו vortex עם 10% PVA, וסבבו ב центריפוגה במהירות גבוהה למשך מספר דקות להסרת בועות; לאחר מכן, המשיכו בהכנת תערובות ה-master mix עבור כל תגובה. עבור כל תגובה, העבירו 5.25 µL של master mix one.בשלב הבא, הוסיפו 6.25 µL מתערובת התמצית הגרעינית. לאחר מכן, הוסיפו 1 µL של סובסטרט RNA מסומן המדולל לריכוז סופי של 50 amM. בכל תגובה נעשה שימוש בפחות מ-5 amM של RNA מסומן.כעת, ערבבו בעדינות במכשיר vortex וסבבו במהירות במערך צנטריפוגה (spin down) את תערובות התגובה. המתינו להשלמת התגובה למשך עד שעתיים בטמפרטורה של 30 °C. מעקב אחר מהלך התגובה לאורך זמן יניב את התוצאות הטובות ביותר. לאחר שימוש ב-proteinase K לעיכול החלבון בתגובה ולאחר טיהור התגובה באמצעות שיטת הפנול-כלורופורם, הריצו את התוצרים על ג'ל של 6% PAGE; טענו שלושה µL של סמן (marker) או חמישה µL של תוצר תגובה אחד לכל נתיב.לאחר מכן הרצו את הג'ל ומאוחר יותר פרקו בזהירות את מכשיר הג'ל. כדי לאסוף את הג'ל, הצמידו נייר סינון בחוזקה אליו והפכו אותו. לחצו בחוזקה על הזכוכית כדי להבטיח שהג'ל נצמד לחלוטין לנייר.לאחר מכן, קלפו באיטיות את נייר הסינון כשהג'ל מודבק אליו. עטפו את הצד החשוף של הג'ל בניילון והדביקו את העטיפה לנייר הסינון בצד השני. לסיום, הכניסו את הג'ל למייבש למשך 15 דקות, כאשר נייר הסינון פונה לכיוון הוואקום.מאוחר יותר, נתח את הג'ל על ידי חשיפתו לסרט או למכשיר דימות זירחני (phospho imager). ת substrat ה-RNA שנחתך הוא הפס בעל המהירות האיטית ביותר בראש הג'ל.תוצר הפיצול הספציפי המסומן בחץ מודגש, רץ מהר יותר בג'ל בגודל הצפוי. תוצר זה אינו קיים בביקורת עם מוטציה נקודית ברצף ה-pollier. כימות פעילות הפיצול נקבע באמצעות תרשים מדד DS.השוואת היחס בין RNA שעבר שס (cleaved) לבין RNA שעבר שס, בנורמליזציה לבקרת ה-RNA השסוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון בדיקת פוליאדנילציה, כדי לענות על שאלות נוספות כגון פעילות של polyA polymerase. בדיקה זו מבוצעת על ידי שינוי תנאי התגובה, כגון הוספת מגנזיום והסרת EDTA.

analysis-rna-processing-reactions-using-cell-free-systems-3-end

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

במאמר זה אנו מתארים שיטה פשוטה קצירת של תאים בודדים מתרבויות עכברוש העיקרי העצבית וניתוח transcriptome הבאים באמצעות הגברה ארנה. גישה זו היא להכליל לכל סוג תא.

ניתוח Transcriptome של תאים בודדים

חסינות CRISPR / קאש מערכות לתווך אדפטיבית בחיידקי חיידקים קדומים. חלבוני CAS רבים הציעו לפעול כendoribonucleases פועל על מבשרי crRNA של משתנה אורך. כאן אנו מדגימים שלוש גישות שונות כדי להפיק את המצעים מראש crRNA לניתוח פעילות ביוכימית endonuclease קאש.

דור מצע לEndonucleases של מערכות CRISPR / קאש

אנו מתארים כאן שיטת הארכת פריימר מבוססת פלואורסצנטיות לקביעת נקודות התחלה של שעתוק מתעתיקי חיידקים ועיבוד RNA in vivo באמצעות רצף ג'ל אוטומטי.

טכניקת הארכת פריימר בהתבסס הקרינה לקביעת נקודות התחלת תעתיק ומחשוף אתרים של RNases In vivo

פרוטוקול זה מתאר שיטת ה-pre-mRNA מיפוי 3' עיבוד אתרי קצה.

3' סיום רצף ספריית הכנה עם א-seq2

שני שונים 3' מהירה הגברה של הקצוות cDNA (3' מירוץ) פרוטוקולים שתואר כאן הופכים את השימוש של שני polymerases דנ א שונים כדי למפות רצפים הכוללים קטע של מסגרת קריאה פתוחה (ORF) על stop codon, את כולה 3' UTR של תעתיק באמצעות ה-RNA להשיג שורות תאים סרטן שונים.

התאמת 3' הגברה מהירה של CDNA מסתיים למפות תעתיקים של סרטן

מתחמי RNA/חלבון מטוהרים באמצעות אסטרטגיה botin-streptavidin הם eluted פתרון תחת תנאים denaturing בטופס אינו מתאים עוד טיהור, אנליזה פונקציונלית. כאן, אנו מתארים שינוי של אסטרטגיה זו אשר מנצל מקשר צילום-cleavable RNA, צעד • UV-תנאי עדין, מניב את מתחמי ה-RNA/חלבון המקורי והמלא.

צעד אחר צעד טיהור של מתחמי Macromolecular בעזרת RNA המצורפת ביוטין, מקשר צילום-cleavable

כאן, אנו מתארים את ההרכבה של RNA פולימראז II (Pol II) מתחמי התארכות הדורשים רק די-אן-איי סינתטי ו-RNA olig, ומטוהרים פול II. מתחמי אלה שימושיים עבור מנגנוני לימוד בבסיס עיבוד שכונתיות של התעתיקים הקשורים למכלול התארכות פול השני.

RNA מלאכותי פולימראז השני מכלולי התארכות לניתוח אירועים בעיבוד RNA

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור הפצילות תלויי-RNA של רנ א. זה מאפשר ניתוח מהיר ותלוי האתר של RNA 2 '-או-מתילציה. גישה זו יכולה לשמש להערכה ראשונית או מרכזית של פעילות הסנחנה.

ניתוח מותנה של rRNA 2 '-או-מתילציה

אנו מציגים פרוטוקול למדידת דינמיקה מיקרו-אלפית השנייה על ספקטרוסקופיית RNA עם תווית N של 13C/15עם תווית N עם ספקטרוסקופיית פיזור הרפיה של 1H R1ρ.  המוקד של פרוטוקול זה טמון הכנה מדגם טוהר גבוהה והגדרת ניסויי NMR.

היבטים מעשיים של הכנת מדגם והגדרת 1H R1ρ הרפיה ניסויים של RNA

המבנה המשני של ה-RNA נצפה בעיקר ב-RNA בוגר בשיטות בדיקת מבנה. רצף מעקב מבנה קו-טרנספריפליונלי (CoSTseq) מאחד את ריצת הגרעין, ששימשה לחקר מיקום הפולימראז על RNA מתהווה, עם חקירת מבנה. כך CoSTseq מאפשר תצפית על מבנה ה-RNA המשני ב-RNA תחת שעתוק פעיל.

ניתוח השוואתי של מבנה RNA של תעתיקים צעירים ובוגרים ב-Saccharomyces cerevisiae

חקור חיתוך mRNA בקצה 3' במערכת חינם ניידים באמצעות תמצית גרעינית פעילה וחומרי מצע מסומנים ברדיואקטיביות. השיטה מאפשרת ניתוח תוצרי חיתוך באלקטרופורזה ג'ל רדיואקטיבית אנכית.

ניתוח של תגובות RNA עיבוד באמצעות מערכות חינם ניידים: 3 'סוף המחשוף של Pre-mRNA מצעים

גלה סרטונים נוספים