שלוש תרבויות ממדים: כלי ללמוד רגיל אדריכלות acinar לעומת שינוי ממאיר של תאי שד

המטרה הכוללת של הליך זה היא לנצל את מערכת התרבות התלת מימדית כאמצעי להבחין בין פנוטיפ השד השפיר לפנוטיפ השד הממאיר. זה מושג על ידי ציפוי ראשון של תאי הבקרה והניסוי בשלוש פעמים על שכבה של גורם גדילה מופחת מטריג'ל במגלשה של שמונה בארות. השלב השני הוא לתת שינויים מלאים וטריים במדיה עם 2% GFR Matrigel כל ארבעה ימים, מה שמאפשר למושבות דמויות אסינין לגדול במשך 10 עד 15 ימים.

לאחר מכן, תמונות ניגודיות הפאזה של ה-aser כמו מושבות הגדלות בתלת מימד נרכשות ברזולוציה של פי חמישה. השלב האחרון הוא לעבד את התרביות דמויות ה-aser לניתוח כימי של אימונו-ציטו עם סמנים מולקולריים רלוונטיים, ולאחר מכן רכישת תמונות קונפוקליות של ב-C שתי מושבות דמויות כתמים חיסוניים בחתך האמצע. בסופו של דבר, ניגודיות הפאזה והתמונות הקונפוקליות של התאים הגדלים בתרבית תלת מימדית משמשות לזיהוי שינויים פנוטיפיים ומולקולריים תאיים ובכך להבדיל בין תאי השד השפירים לתאים הממאירים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו תרביות דו מימדיות, מבחני פלישה או נדידה, הוא שהיא יכולה לסכם את ארכיטקטורת הרקמות של השד השפיר ואת אובדן הארגון שלו במהלך טרנספורמציה ממאירה. לפיכך, ניתן להשתמש ביעילות בטכניקה זו כדי להבדיל בין תאי השד השפירים לתאי השד הממאירים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום סרטן השד, כגון פגם במסלולי איתות בפנוטיפ התא, ובזיהוי מסלולים אונקוגניים או מדכאי גידול חדשים.

כדי להתחיל בניסוי, גורם גדילה מופחת או מטריגל GFR בארבע מעלות צלזיוס בן לילה. לאחר מכן, יש לחמם את מדיית ה-HME השלמה ב-37 מעלות צלזיוס ולהניח מגלשה של שמונה בארות על קרח כדי להתקרר. הוסף 40 מיקרוליטר של GFR Matrigel למרכז כל באר של השקופית שהתקררה מראש.

מורחים את הג'ל בצורה אחידה ככל האפשר באמצעות קצה פיפטה P 200, הימנעות מבועות והתפשטות יתר, מה שעלול להוביל להיווצרות מניסקוס. לאחר מכן ממצקים את הג'ל על ידי דגירה של השקופית ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 בזמן שהג'ל המטרי ממצק את עיני הטריפסין, תאי ה-HME, ואז אוספים אותם בצינור של 15 מיליליטר וסובבים את התאים בכוח הכבידה פי 150 למשך ארבע דקות, סופרים את התאים ומדללים אותם ל-12,500 תאים למיליליטר. במדיה שלמה, הוסף מטריג'ל GFR לתרחיף התא בריכוז סופי של 2% והוסף 400 מיקרוליטר מהתמיסה לכל באר של שקופית התא המקודדת מראש.

לאחר מכן הנח את השקופית בחממה עם חוצץ CO2. החלף את המדיה במדיה שלמה חדשה כל ארבעה ימים למשך 15 יום. למחקרי מעכבים, הוסף מעכבי מולקולות קטנות למדיה השלמה בזמן הציפוי, ולאחר מכן שינויים חדשים במדיה בתוספת המעכבים כל שלושה ימים כדי להתחיל תאי גדילה ומשולש עבור כל ערכת טיפול.

צלם תמונות ניגודיות פאזה של מבני אסר מכל באר ברזולוציה של פי חמישה באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה המחובר למעביר שקופיות ומחשב. צלם את התמונות על ידי הזזת השקופית ממסגרת אחת לאחרת, המכסה את כל הבאר של המגלשה התאית לרוחב. ספור את המספר הכולל של מבני אזר, את מספר האסינין השטוח העגול היחיד ואת מספר המבנים הרב-אסרים או המבנים הגדלים באקראי חסרי ארגון.

ועם תהליכי הסתעפות נובעים, חשב את האחוז של מבני אסר שטוחים עגולים בודדים לעומת מבנים ממאירים ושרטט את המידע. כגרף עמודות. חשב את המובהקות על ידי מבחן T של תלמיד לא מזווג דו-זנבי.

הכן ריאגנטים לצביעה אימונופלואורסצנטית כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר מכן, השתמש בפיפטה P 200 כדי לשאוב בזהירות את המדיה הממוזגת. לאחר מכן תקן את ה- ASIN או המבנים עם פורמלדהיד טרי של 2% פרה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות לאחר הקיבוע, חלחל את התאים עם 0.5% טריטון X 100 למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן שטפו את התרבויות שלוש פעמים עם 100 מילימטר גליצין למשך 10 עד 15 דקות לכל שטיפה. לאחר מכן, חסום את התאים במאגר הבלוק הראשוני למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן דגרו את התרביות ב-20 מיקרוגרם למיליליטר של עיזים נגד עכברים שני שברים במאגר בלוק ראשוני, הנקרא גם פתרון החסימה השני למשך 30 דקות כדי לחסום את מין ה-IgG של עכבר האמינו במטריג'ל.

לאחר החסימה, דגרו על התאים עם נוגדן ראשוני בתמיסת חסימה שנייה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. שטפו את התאים שלוש פעמים עם מאגר אימונופלואורסצנטי או שאני חוצץ עם נדנוד עדין למשך 10 עד 15 דקות לכל שטיפה. לאחר מכן דגרו על התאים עם נוגדנים משניים מצומדים פלואורסצנטיים במאגר F למשך 45 דקות.

לאחר מכן, שטפו את התאים שלוש פעמים למשך 10 דקות כל אחד עם מאגר F ונדנוד עדין. הרכיבו את השקופיות עם DPI המכיל מגיב נגד דהייה כדי לדמיין את הגרעינים. הניחו לשקופיות להתייבש למשך הלילה בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן רכשו תמונות קונפוקליות בחלק האמצעי של המושבה של תאים הגדלים על גבי המטריגל וסדרה של חתכים אופטיים לכל אורך מבנה האסנר על ידי ערימת z תמונות קונפוקליות של תאי HME מוכתם DPI ו-C CN שישה תאי נוקדאון ביום החמישי מראים שתאי נוקדאון חסרי ארגון. ביום ה-15, תאי הבקרה נעצרים עם ASIN או מבנים מובחנים ולומן מוגדר היטב המתפצל מתאי הנוקדאון, המציגים פנוטיפ מסועף פולשני וצינורי. צביעה אימונו-פלואורסצנטית מראה אובדן ביטוי של למינין v אלפא שש אינטגרין והרין ECA המצביע על שיבוש בקרום הבסיס, אובדן קוטביות הבסיס ומגע תאי התא בהתאמה.

בתאים ממאירים, תאי בקרה מציגים שכבה שלמה סביב הביטוי הבסיסי של אלפא שש אינטגרין ביטוי אפיקלי של GM אחד 30 ו-eca. כאן בצומת תאי התא, הפנוטיפ הממאיר של CCN שישה תאי HME נוקדאון התהפך עם טיפול אקסוגני של CCN רקומביננטי אנושי מטוהר שישה חלבונים שני קווי תאי שד גרורתיים מאוד, כ-1 49 ו-M-D-A-M-B 2 31. טופלו במעכבי P 38 map kinase, SB 2 0 3 8 50 ו- SB 2 0 2 1 90, אשר הפחיתו התנהגות ממאירה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לגדל תאי שד בתרבית תלת מימדית ולהשתמש ביעילות בגידול דמוי סינו על מטריג'ל כקריאה כדי להבדיל בין פנוטיפים שפירים לממאירים של תאי שד.