Name: שלוש תרבויות ממדים: כלי ללמוד רגיל אדריכלות acinar לעומת שינוי ממאיר של תאי שד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-25T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: למדו להבדיל בין תאי שד שפירים לבין תאים ממאירים באמצעות מערכת תרבית תלת-ממדית. השיטה כוללת זריעת תאים על מטריגל וניתוח אימונוהיסטוכימי כדי לזהות שינויים פנוטיפיים ומולקולריים בחקר הסרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH R01 CA107469, R01 CA125577, וU01CA154224 לCG Kleer, האוניברסיטה של ​​סרטן מרכז התמיכה של מישיגן.

1. הכנת החומרים ותרבות מדיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גורם גדילת הפשרה מופחת (GFR) Matrigel על 4 מעלות CO / נ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחמם מדיה מלאה לשורת תאים הנדרשת על 37 ° C. MCF10A-ATCC שצוינה בתקשורת; המדיום של HME-Ham-F-12 בתוספת 5% בסרום שור עוברי, 1 מיקרוגרם / מיליליטר הידרוקורטיזון, 5 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין, 10 ng / גורם גדילה באפידרמיס מיליליטר, ו100 רעלן הכולרה ng / מיליליטר; התקשורת של SUM149-Ham-F-12 FBS בתוספת 5%, 2 הידרוקורטיזון מיקרוגרם / מיליליטר ו 5 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין; ומד&quot;א-MB-231-10% FBS-DMEM </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Precool שקופיות קאמריות 8 היטב על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מכסה המנוע בתרבית רקמה ואספקה. </li></ol> 2. שלוש ממדי תרבות ב8 היטב שקופיות קאמרית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל היטב בכל שקופית 8 היטב עם 40 μl של GFR Matrigel. הוסף את Matrigel במרכז השקופית ולאחר מכן להפיץ באמצעות פיפטה קצה P200. נסה להפיץ בצורה שווה ככל האפשר, תוך הימנעות בועות ופורשים אשר יכול להובילהיווצרות מניסקוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השקופיות ב37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO 2. בעוד Matrigel הוא החיזוק, trypsinize התאים, לאסוף ולסובב ב XG 150 בצנטריפוגה תרבית רקמה למשך 4 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים ו לדלל את 12,500 תאים / מיליליטר בתקשורת של הקו הסלולרי בהתאמה מלאה. הוספת GFR Matrigel עד 2% ולהוסיף 400 μl היטב בכל חדר שקופיות Matrigel precoated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השקופיות בחממת CO 2. תן שינויי מדיה שלמים טריים כל יום 4 עד ה 15 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול במעכבים תרופתיים: ללימודי מעכב להוסיף מעכבי מולקולה קטנים לתקשורת להשלים בזמן ציפוי אחרי שינויי תקשורת טריים בתוספת מעכבים כל שלושה ימים בזמן שהולכים וגדלו תאים על GFR Matrigel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול עם חלבון מטוהר: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט התאים הבאים על השלבים 2.1-2.3. אפשר התרבויות לגדול במשך 4 ימים ואחריו starvati סרוםל16 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 5, טיפול בתאים עם ריכוז מתאים של חלבון מטוהר ב0.1% FBS בתוספת תקשורת לתאים מורעבים בסרום. תן שינוי תקשורת טרי עם חלבון מטוהר אחרי 2 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 10 להחליף את התקשורת ממוזגת עם תקשורת HME מלאה. אפשר התרבויות לגדול לעוד 5 ימים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכתים immunofluorescence של מבני acinar גדלו על Matrigel: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן paraformaldehyde 2%, 0.5% טריטון X-100 ו100 גליצין מ&quot;מ 1x PBS, pH 7.4. הכן את חיץ immunofluorescence (IF חיץ) שכולל של 1x PBS המכילים 0.1% אלבומין בסרום שור, 0.2% X-100 טריטון, Tween-20 0.05%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בקצה פיפטה P200 כדי לשאוב את התקשורת המותנה בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את מבני acinar עם 2% paraformaldehyde מוכן טרי בטמפרטורת חדר (RT) עבור 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize התאים עם 0.5% טריטון X-100 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את התרבותזמנים של שלושה עם גליצין 100 מ&quot;מ, 10-15 דקות לכל שטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסום את התאים עם 10% נסיוב עזים במאגר אם, בשם בלוק ראשוני, במשך שעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התרבויות עם עכבר אנטי 20 מיקרוגרם / עז מיליליטר F (ab &#39;) 2 שבר במאגר בלוק העיקרי ל30 דקות. שלב זה חשוב כדי לחסום את מיני IgG עכבר immunoreactive בMatrigel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם נוגדן ראשוני בפתרון החסימה השני (עכבר אנטי +20 / מיליליטר עז בלוק ראשי מיקרוגרם F (ab &#39;) 2 שבר) O / N ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים עם חיץ IF עבור 10-15 דקות כל אחד עם נדנדה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם נוגדני ניאון מצומדות משניים בIF חיץ 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3x לשטוף 10 דקות כל אחד עם חיץ IF עם נדנדה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר השקופיות עם מגיב אנטי לדעוך מכיל DAPI לדמיין את הגרעינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר השקופיות לייבוש O / N ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכישת תמונה: לרכוש תמונות confocal במיל המושבהdsection של תאים שגודל על גבי Matrigel. לקבלת מידע נוסף לרכוש סדרה של סעיפים אופטיים לאורך כל אורכו של מבנה acinar ידי לערום Z. </li></ol></li></ol> 3. שלוש ממדי תרבות ב2 היטב לשכת שקופיות לimmunoblotting <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Precool שקופיות קאמריות 2 היטב על קרח. בצע את פעולות 2.1-2.4 דרוג את ריאגנטים לחדר שקופיות למשל מעיל 2 היטב עם 160 μl של Matrigel ולהוסיף 1.6 מיליליטר של התא / Matrigel לערבב היטב בכל השקופית 2 היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר מבני acinar מMatrigel באמצעות ערכת קצירת תא תרבות 3D זמינה המסחרית בעקבות הוראות יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את המאגרים לשטוף תא וקציר התא ל1x וprecool עד 4 ° C. כביסה ודחיקה של Matrigel צריכה להתבצע על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף מבני acinar 3x באמצעות החיץ לשטוף תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף acini ל15 צינורות צנטריפוגה מיליליטר באמצעות bu קצירת תאffer ואחריו 30 דגירה דקות על כיסא נדנדה ב 4 ° C. מערבבים את ההשעיה גם עם טפטפת 1 מיליליטר. זה ישבור את Matrigel בחתיכות קטנות ולשחרר את רוב התאים במאגר קצירת תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה התאים ב XG 200 בצנטריפוגה בתרבות. הסר את השכבה הצפה של הידרוג&#39;ל מתאי pelleted עם קצה פיפטה P200. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend lysates בחיץ מדגם SDS מצורף לערכה. יכול לשמש גם מאגר תמוגה ריפה. </li></ol> 4. כימות של הפנוטיפ שד שפיר לעומת ממאיר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים בtriplicates עבור כל קבוצת טיפול בעקבות צעדי 2.1-2.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את התמונות בניגוד שלב של מבני acinar מכל הטוב ב5X או 10X רזולוציה באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב מצורף למחלף שקופיות ומחשב. קח את התמונות על ידי העברת השקופיות מפריים אחד למשנהו ובכך מכסים את כולו גם של שקופית תאיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את המספר הכולל של מבני acinar,מספר acini אחת עגול ושטוח ומספר מבני multiacinar או המבנים גדל באקראי חסר ארגון ועם תהליכי הסתעפות הבוקעים ממנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את אחוז המבנים בודדים עגולים acinar השטוח לעומת המבנים ממאירים ועלילה כגרף עמודות. לחשב את המשמעות על ידי מבחן t של הסטודנט. </li></ol>

<ol><li>Arendt, L. M., Rudnick, J. A., Keller, P. J., Kuperwasser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stroma+in+breast+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Stroma in breast development and disease.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 21, 11-18 (2009).</li>
<li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30, 256-268 (2003).</li>
<li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nat. Methods. 4, 359-365 (2007).</li>
<li>Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+overlay+culture+models+of+human+breast+cancer+reveal+a+critical+sensitivity+to+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 332, 821-828 (2010).</li>
<li>Rosen, P. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRosen%2C+PP+%22Rosen%27s+breast+pathology%22">Rosen's breast pathology</a>. Rosen, P. , 3rd edition, Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia, PA. (2008).</li>
<li>Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+the+microenvironment+in+breast+cancer+progression%3A+recapitulation+of+mammary+tumorigenesis+using+a+unique+human+mammary+epithelial+cell+model+and+a+three-dimensional+culture+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay.</a> Biochem. Cell Biol. 74, 833-851 (1996).</li>
<li>Kenny, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphologies+of+breast+cancer+cell+lines+in+three-dimensional+assays+correlate+with+their+profiles+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression.</a> Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).</li>
<li>Pal, A., Huang, W., Li, X., Toy, K. A., Nikolovska-Coleska, Z., Kleer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCN6+modulates+BMP+signaling+via+the+Smad-independent+TAK1%2Fp38+pathway%2C+acting+to+suppress+metastasis+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">CCN6 modulates BMP signaling via the Smad-independent TAK1/p38 pathway, acting to suppress metastasis of breast cancer.</a> Cancer Res. 15, 4818-4828 (2012).</li>
<li>Pal, A., Huang, W., Toy, K. A., Kleer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCN6+knockdown+disrupts+acinar+organization+of+breast+cells+in+three-dimensional+cultures+through+up-regulation+of+type+III+TGF-%CE%B2+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">CCN6 knockdown disrupts acinar organization of breast cells in three-dimensional cultures through up-regulation of type III TGF-β receptor.</a> Neoplasia. 14, 1067-1074 (2012).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+reversion+or+death+of+cancer+cells+by+altering+signaling+pathways+in+three-dimensional+contexts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Phenotypic reversion or death of cancer cells by altering signaling pathways in three-dimensional contexts.</a> J. Natl. Cancer Inst. 94, 1494-1503 (2002).</li>
<li>Weaver, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversion+of+the+malignant+phenotype+of+human+breast+cells+in+three-dimensional+culture+and+in+vivo+by+integrin+blocking+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies.</a> J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+co-culture+models+to+study+prostate+cancer+growth%2C+progression%2C+and+metastasis+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional co-culture models to study prostate cancer growth, progression, and metastasis to bone.</a> Semin. Cancer Biol. 15, 353-364 (2005).</li>
<li>Vaughan, M. B., Ramirez, R. D., Wright, W. E., Minna, J. D., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+model+of+differentiation+of+immortalized+human+bronchial+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional model of differentiation of immortalized human bronchial epithelial cells.</a> Differentiation. 74, 141-148 (2006).</li>
<li>Fata, J. E., Werb, Z., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mammary+gland+branching+morphogenesis+by+the+extracellular+matrix+and+its+remodeling+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of mammary gland branching morphogenesis by the extracellular matrix and its remodeling enzymes.</a> Breast Cancer Res. 6, 1-11 (2004).</li>
<li>Luca, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+the+3D+microenvironment+on+phenotype%2C+gene+expression%2C+and+EGFR+inhibition+of+colorectal+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines.</a> PLoS One. 8, 1-11 (2013).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

שתארנו כאן התרבות תלת ממדים של תאי אפיתל שד על קרום במרתף מחדש ואת השימושיות של מערכת זו כדי להבדיל בין פנוטיפ שפיר בשד לעומת ממאיר. גם מערכת זו יכולה לשמש לתרבות סוגי תאים שונים מרקמות בלוטות אחרות וכבר דווחה כי שימשה בהצלחה לאפיתל ערמונית התרבות, אפיתל הסימפונות, ותאי האפיתל של בלוטת התריס, עד כמה שם 12-14. חשיבותה של תרבות 3D טמונה בעובדה שמדובר בדגם מבחינה פיזיולוגית רלוונטי. תרבות 3D מספקת אמצעי כדי להשיג תובנות המנגנונים המולקולריים המובילים לשיבוש ארכיטקטורת הבלו...

שלוש תרבות ממדי (3D) של תאי אפיתל שד על קרום במרתף מחדש היא מערכת מודל חשובה ללמוד את הפנוטיפ המורכב והאיתות קשורה של שד נורמלי וסרטן השד 2,3. היחידה התפקודית של שד היא יחידת מסוף צינור lobular (TDLU) אשר מורכבת מצינור קטן שסניפים לacini. Acini הם מבנים מאורגנים מאוד, מורכב משתי שכבות תאים, תאי אפיתל וmyoepithelial, אשר מוקפות בקרום במרתף 5. התכונות הייחודיות ביותר של acini הנורמלי הן קיטוב סלולארי, קובץ מצורף לקרום במרתף המשמש כבסיס וקשר מיוחד תאי תאים. ארגון מורכב זו מופר בקרצינומות פולשנית. תרבויות 2D בשימוש נרחב, שבו תאים גדלים כמו monolayers, אל תאפשר להיווצרות של acini. לפיכך, תרבות monolayer חסרה במתן מערכת כדי ללכוד את מערכת היחסים המורכבות שבין תאי האפיתלבשד נורמלי והסרת הפיקוח שלהם בסרטן השד. תרבויות אפיתל monotypic תפקודיות של תאי שד פותחו במספר מעבדות 2,3. תרבות 3D כוללת את הצמיחה של תאי שד על Matrigel, שהוא תמצית solubilized שמקורם בתאי סרקומה עכבר Engelbreth-Holm-נחיל והוא זמין באופן מסחרי. מצע 3D אחר כמו קולגן אני גם נמצא בשימוש. יכולים להיות מתורבת תאי השד ב-3D ​​על ידי assay 3D המשובץ, שבו תאים בתרבית מוטבעת בMatrigel 2. לחלופין, יכולים להיות מתורבת תאים על ידי 3D על assay העליון, המכונים גם assay כיסוי 3D, אשר הוא עלות האפקטיבית כפי שהוא דורש נפח קטן יותר של Matrigel, ומאפשר ניטור זמן לשגות של הקמת מושבה על ידי הדמיה בניגוד שלב והוא אידיאלי באתר הדמיה 2 -3. 3D על assay העליון נעשה שימוש כדי להגדיר את המתאם בין פנוטיפ acinar ופרופיל ביטוי גני 7. תרבות 3D ניתן effectivאיליי משמש להבחנה בין תאים נורמלים ושפירים מקרצינומה פולשנית. תאי שד נורמלים ושפירים בצורת צמיחה נעצרה מבנים מקוטבים עם לומן מוגדר היטב במרכז בMatrigel ואילו תאי קרצינומה פולשנית לגדול בשפע ואקראי ללא סליקה של לומן. E6/E7 הונצח תאים אנושיים אפיתל החלב וקו סלולרי MCF10A, שהוא קו סלולרי הונצח באופן ספונטני שבודד מחולה 36 שנה ישנה עם שינויי fibrocystic, שימש בהצלחה לשחזר את הפנוטיפ שפיר בשד ב3D 3,8 ושמש מערכת מודל ללמוד את התפקיד המדכא בשעור וגידול של מספר מולקולות 8,9. יכול להיות מהונדסים לתאים שפירים אלה כדי לתפעל גן (ים) של עניין על ידי ההקדמה של lentivirus / רטרווירוס. אם הגן (ים) של עניין הוא מדכאי סרטן, מציאה shRNA תיווך תוביל לשינוי ממאיר ואילו אם הגן של עניין הוא ביטוי יתר של אונקוגן בתאים שפיריםצריך להראות פנוטיפ ממאיר. בשני המקרים מבני acinar נוצרו ב3D יכולים ללכוד את השינוי הממאיר. תאים בודדים שפירים מצופים ב3D להתחיל להתרבות וליצור סביב מבנים כדוריים. ביום 5-8 במצטבר כדורי זה של תאים להתמיין לשכבה המקיפה מקוטבת של תאים שנמצאת במגע עם Matrigel, ומסה פנימית של תאים פחות מקוטבים, אשר חוסר מגע עם Matrigel. בימים הקרובים 10-15 התאים הפנימיים יתחילו למות על ידי אפופטוזיס להרכיב לומן ברור. התאים הממאירים יגדלו באקראי לאבד את הקוטביות שלהם. תאים מאוד ממאירים בדרך כלל בצורת הסתעפות מבנים. הבדלים אלה בפנוטיפ יכולים להיות שנתפסו על ידי הדמיה בניגוד שלב זמן לשגות ועל ידי באתר immunostaining עם סמנים מולקולריים רלוונטיים. הסמנים הנפוצים ביותר הם אלפא 6 integrin, סמן קוטביות בסיסי, בשילוב עם סמן התפשטות phospho-היסטון 3 וapoptotסמן ic ביקע caspase-3. זו האחרונה היא חשובה כדי לקבוע אם יש היווצרות לומן במרכז acini, תכונה של תאי שד נורמלים ושפירים. סמני קוטביות וקשר תאי תאים אחרים כוללים GM130, laminin, ERM, E-cadherin. לחלופין יכולות להיות מהונדסות שורות תאי סרטן השד כדי לתפעל את הגן של עניין. במקרה הזה חזרה לצמיחה יותר נעצרה פנוטיפ השפיר יכול לשמש כהקריא להבחין בין פנוטיפ הסרטן. גם תרבות 3D ניתן להשתמש בזהירות כדי להתוות את מסלולי האיתות מעורבים בשינוי ממאיר 10-11. שימוש שהוזכר לעיל לקרוא-outs, מעכבים תרופתיים, נוגדני חסימה או חלבונים רקומביננטיים יכול לשמש להיות להצביע באיתות המולקולרית המובילה לשינוי ממאיר. עם מאמצים מתמשכים ממעבדות שונות שניתן לחלץ התאים מ3D לבודד RNA וגם להכין lysates לimmunoblotting אימונוגלובולינnoprecipitation. אסטרטגיות אלה מתוארות בשלבים ובאופן מפורט בפרוטוקול.

<table><tbody><tr><td>גורם גדילה מופחת Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td>הימנע מהפשרה חוזרת בהקפאה&nbsp;</td></tr><tr><td>מגלשות זכוכית Lab-Tek 8 בארות</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>177402</td><td>Precool על קרח&nbsp;</td></tr><tr><td>מגלשות תא זכוכית Lab-Tek 2-well&nbsp;</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>177380</td><td>Precool על קרח&nbsp;</td></tr><tr><td>עז נגד עכבר F(ab&acute;)2 fragment</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-006-006</td><td></td></tr><tr><td>סרום עזים רגיל</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>נוגדנים מצומדים פלואורסצנטיים של Alexa</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td></td><td>אנא עיין באתר בדיקות מולקולריות</td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI</td><td>Molecular</td><td>Probes P36935</td><td></td></tr><tr><td>3D Culture Cell ערכת קציר</td><td>Trevigen</td><td>3448-020-k</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Apha-6-integrin</td><td>Fisher Scientific</td><td>MAB1378</td><td>דילול 1:100 עבור IF</td></tr><tr><td>Anti-GM130</td><td>BD Biosciences</td><td>610822</td><td>דילול 1:100 עבור IF</td></tr><tr><td>אנטי-פוספו-היסטון 3 (Ser10)FITC מצומד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>16-222</td><td>1:100 דילול עבור IF</td></tr><tr><td>אנטי-קספאז 3 (Asp 175)</td><td>תא איתות</td><td>9661s</td><td>דילול 1:50 עבור IF</td></tr><tr><td>Anti-E-cadherin</td><td>BD Biosciences</td><td>610181</td><td>דילול 1:200 עבור IF</td></tr></tbody></table>

שלוש תרבויות ממדים: כלי ללמוד רגיל אדריכלות acinar לעומת שינוי ממאיר של תאי שד

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

קרצינומות שד פולשני הן קבוצה של גידולי אפיתל ממאירים מאופיינת בחדירה לרקמות סמוכות ונטייה לגרורות. משחק הגומלין של אותות בין תאים סרטניים והמיקרו שלהם השפעה חזקה על צמיחת סרטן השד והתנהגות 1 ביולוגית. עם זאת, רובם של אותות הבאים מהמטריצה ​​תאית אבדו או את הרלוונטיות שלהם היא understudied כאשר תאים גדלים בשתי תרבות ממדית (2D) כשכבה. בשנים האחרונות, שלוש תרבות ממדים (3D) בקרום במרתף מחדש התפתחה כשיטת בחירה לשחזר את ארכיטקטורת הרקמה של תאים בשד שפירים וממאירים. תאים שגודלו ב3D לשמר את הרמזים החשובים מהמטריצה ​​תאית ולספק לשעבר vivo 2,3 מערכת רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. ראוי לציין, שיש ראיות הולכות ומצטברים מצביעים על כך שהתאים מתנהגים בצורה שונה כאשר גדלו ב3D לעומת 4 2D. תרבות 3Dניתן להשתמש ביעילות כאמצעי לבדל את הפנוטיפ הממאיר מפנוטיפ שפיר בשד ושבסיס האיתות התאית ומולקולרית מעורב 3. אחד מסימני ההיכר של תאי אפיתל השפירים הוא שהם מקוטבים כך שהציטופלסמה הפסגה היא לכיוון הלום וציטופלסמה הבסיסית נשענת על הקרום במרתף. קוטביות apico-הבסיסי הזה אבוד, בקרצינומות שד פולשני, המתאפיינים בחוסר ארגון והיווצרות anastomosing והסתעפות צינוריות שאקראי מחלחל stroma סביב סלולריים. הבדלים אלה בין histopathological בלוטה שפירה וקרצינומה פולשנית יכולים להיות מועתק ב3D 6,7. שימוש בקריאת פסקי המתאימים כמו לכמת את מבני acinar סיבוב בודדים, או דיפרנציאלי ביטוי של סמנים מולקולריים תוקף להתפשטות תאים, קוטביות ואפופטוזיס בשילוב עם טכניקות אחרות מולקולריות וביולוגיה של תא, תרבות 3Dדואר יכול לספק כלי חשוב כדי להבין טוב יותר את השינויים התאיים בשינוי ממאיר ומגדיר את האיתות אחראית.

תרבות 3D ניתן להשתמש ביעילות כדי לבדל את הפנוטיפ ממאיר של תאי אפיתל שד אנושיים מהשד השפיר. תאים שפירים יחיד מצופים על Matrigel לגדול כמבנים כדוריים מאורגנים שיכול בקלות להיות צילמו כacini שטוח סיבוב בודד במישור אחד באמצעות הדמיה בניגוד שלב. התאים הממאירים בודדים מצופים על Matrigel לגדול באקראי, להראות מקדמת שבירה גבוהה מאוד וקשה לתדמיתה במישור אחד. כפי שניתן לראות בתרשים 1, HME השפיר ותאי MCF10A יוצרים acini מחפש כדורי ואילו שורות תאי שד גרורתי מאוד SUM149 ומד&quo...

שלוש תרבות ממדית של תאי אפיתל החלב בקרום במרתף מחדש היא שיטה שימושית לשחזר את ארכיטקטורת vivo של השד השפיר, וכדי לבדל את הפנוטיפ הממאיר מפנוטיפ שפיר בשד. חשוב מכך, מערכת זו יכולה להיות מיושמת ללמוד קרצינומות פולשני ברקמות אחרות.

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש במערכת תרבית תלת-ממדית כאמצעי להבחנה בין פנוטיפ שפיר של רקמת שד לבין פנוטיפ ממאיר של רקמת שד. הדבר משיג על ידי זריעה ראשונית של תאי ביקורת ותאי ניסוי בשלוש חזרות על שכבה של Matrigel עם ריכוז מופחת של גורמי גדילה, בתוך שקופית עם תאי תרבית בעלת שמונה בארות. השלב השני הוא החלפת המצע למצע מלא וטרי עם 2% GFR Matrigel מדי ארבעה ימים, כדי לאפשר למושבות דמויות-acinus לגדול במשך 10 עד 15 ימים.בשלב הבא, נרכשות תמונות בניגוד מופע (phase contrast) של המושבות דמויות ה-aser שגדלו בתרבית תלת-ממדית ברזולוציה של five x. השלב הסופי הוא עיבוד התרביות דמויות ה-aser לצורך אנליזה אימונו-ציטוכימית עם סממנים מולקולריים רלוונטיים, ולאחריה רכישת תמונות קונפוקאליות של מושבות דמויות aser עם צביעה אימונו-C two בחיתוך רוחבי. לבסוף, תמונות הניגוד מופע והתמונות הקונפוקאליות של התאים שגדלו בתרבית תלת-ממדית משמשות לזיהוי שינויים פנוטיפיים ומולקולריים תאיים, ובכך להבחין בין תאי שד שפירים לתאים ממאירים.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תרביות דו-ממדיות או בדיקות פלישה או הגירה, הוא היכולת לשחזר את ארכיטקטורת הרקמה של השד השפיר ואת אובדן הארגון שלה במהלך התמרה ממאירה. לפיכך, ניתן להשתמש בטכניקה זו ביעילות כדי להבדיל בין תאי שד שפירים לתאי שד ממאירים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח בתחום סרטן השד, כגון פגמים במסלולי איתות המשפיעים על הפנוטיפ התאי, ובזיהוי מסלולים אונקוגניים חדשים ו/או מסלולים למדכאי גידולים.כדי להתחיל בניסוי, הפשירו מטריג'ל דל בגורמי גדילה (growth factor reduced או GFR matrigel) בטמפרטורה של 4°C למשך לילה. לאחר מכן, חממו מצע גידול HME מלא ל-37°C והניחו סלייד בעל שמונה תאים על קרח לקירור. הוסיפו 40 µL של GFR Matrigel למרכזו של כל תא בסלייד שהוקרר מראש.פרוס את הג'ל באופן אחיד ככל האפשר באמצעות טיפ של פפיט P 200, תוך הימנעות מבועות ומפריסה מרובה, שעלולה להוביל להיווצרות מניסקוס. לאחר מכן, הקשה את ה-matrigel על ידי דגירה של השקופית ב-37 °C ו-5% CO2. בזמן שה-matrigel מתקשה, השתמש בטריפסין עבור תאי ה-HME, אסוף אותם לשפופרת של 15 mL וסבב את התאים ב-150 ×g למשך ארבע דקות; ספור את התאים ודלל אותם לריכוז של 12,500 תאים למל בתוך מצע גידול מלא. הוסף GFR matrigel לתמיחת התאים בריכוז סופי של 2%, והוסף 400 µL מהתמיסה לכל באר בשקופית התאים (chamber slide) המקודדת מראש.לאחר מכן, הניחו את הזריקה באינקובטור עם באפר CO2. החליפו את המצע במצע מלא וטרי every four days למשך 15 ימים. לצורך מחקרי מעכבים, הוסיפו מעכבים של מולקולות קטנות למצע המלא בזמן הזריעה, ולאחר מכן בצעו החלפות של מצע טרי בתוספת המעכבים כל שלושה ימים כדי להתחיל את גידול התאים, ובצעו כפילויות של שלושה (triplicates) עבור כל קבוצת טיפול.דגמו תמונות בניגודיות פאזה (phase contrast) של מבני aser מכל באר ברזולוציה של five x, באמצעות מיקרוסקופ בניגודיות פאזה המחובר למזיז סליידים ולמחשב. צלמו את התמונות על ידי הזזת הסלייד ממסגרת אחת לשנייה, כך שכל רוחב הבאר בסלייד המובנה (chambered slide) יכוסה. ספרו את המספר הכולל של מבני aser, את מספר ה-asinine העגולים, השטוחים והבודדים, ואת מספר מבני ה-aser המרובים או מבנים הגדלים באופן אקראי וללא ארגון.ובעזרת תהליכי הסתעפות הנובעים מהם, חשבו את אחוז המבנים השטוחים של aser בעלי סיבוב בודד לעומת מבנים ממאירים, והציגו את המידע בגרף עמודות. חשבו את המובהקות באמצעות מבחן t של student לא מזווג דו-זנבי.הכינו את הריאגנטים לצביעה באימונופלואורסצנציה כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף. לאחר מכן, השתמשו בפיפט P 200 כדי לשאוב בזהירות את המדיום המותנה. לאחר מכן, קבעו את ה-ASIN או את המבנים באמצעות 2% paraformaldehyde שהוכן טרי בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות; לאחר הקיבוע, בצעו פרמיאביליזציה לתאים באמצעות 0.5% tritton X 100 למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן, שטפו את התרביות שלוש פעמים עם 100 millimeter glycine למשך 10 עד 15 דקות לכל שטיפה. לאחר מכן, חסמו את התאים בבופר חסימה ראשוני (primary block buffer) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, דגרו את התרביות ב-20 micrograms per milliliter של goat anti mouse fab two fragment בבופר חסימה ראשוני, הנקרא גם תמיסת החסימה השנייה, למשך 30 דקות כדי לחסום את מיני ה-mouse IgG המגיבים לאמינו במטריג'ל (matrigel).לאחר החסימה, דגרו את התאים עם נוגדן ראשוני בתמיסת חסימה שנייה למשך הלילה בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס. שטפו את התאים שלוש פעמים עם באפר אימונופלורסצנציה או I buffer תוך כדי נעירה עדינה למשך 10 עד 15 דקות עבור כל שטיפה. לאחר מכן, דגרו את התאים עם נוגדים שניים המשוערים עם פלואורופור ב-if F buffer למשך 45 דקות.בשלב הבא, שטפו את התאים שלוש פעמים למשך 10 דקות בכל פעם עם בופר if תוך כדי ניעור עדין. הרכיבו את השקופיות עם DPI המכיל ריאגנט למניעת דהייה (anti fade) כדי להדגים את הגרעינים. השאירו את השקופיות להתייבש למשך לילה בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, רכשו תמונות קונפוקליות בחלק המרכזי של המושבה של תאים הגדלים על גבי ה-matrigel וסדרה של חתכים אופטיים לאורך כל מבנה ה-asner על ידי z stacking של תמונות קונפוקליות של תאי HME בשליטה ותאי C CN six knockdown שנצבעו ב-DPI; ביום החמישי נראה כי לתאי ה-knockdown חסר ארגון. ביום ה-15, תאי השליטה עוברים מעצר גדילה עם מבני ASIN מובחנים ולומן מוגדר היטב, בניגוד לתאי ה-knockdown, המציגים פנוטיפ צינורי ומסתעף פולשני. צביעה אימונופלורסצנטית מראה אובדן ביטוי של laminin v alpha six integrin ו-ECA herrin, המעידים על שיבוש של ממברנת הבסיס, אובדן פולריות בסיסלית ואובדן מגע בין-תאי, בהתאמה.בתאים ממאירים, תאי בקרה מציגים שכבה שלמה סביב הביטוי הבזאלי של alpha six integrin, ביטוי אפקלי של GM one 30 ו-eca. כאן, בצומת התא-תא, הפנוטיפ הממאיר של תאי HME עם knockdown של CCN six הופך עם טיפול חיצוני בחלבון CCN six רקומיבננטי אנושי מנוקה. שני קווי תאי שד גרורתיים מאוד, some 1 49 ו-M-D-A-M-B 2 31, טופלו במעכבי P 38 map kinase, SB 2 0 3 8 50 ו-SB 2 0 2 1 90, אשר הפחיתו את ההתנהגות הממאירה.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לגדל תאי שד בתרבית תלת-ממדית (3D culture), וכיצד להשתמש ביעילות בצמיחה דמוית-סינואיד (sino like growth) על matrigel כמדד להבחנה בין פנוטיפים של תאי שד שפירים לממאירים.

three-dimensional-cultures-tool-to-study-normal-acinar-architecture

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

Assay כדי למדוד כמותית הפיכת גורם הגדילה (TGF)-β-Induced הפלישה ב 3 מימדי ג'ל קולגן מתואר. Assay זו מנצלת את הסדרה MCF10A של שורות תאים, המייצגים שלבים שונים של התפתחות סרטן השד. שיטה זו יכולה להיות מאומץ לשימוש עם שורות תאים אחרים עשוי לשמש כדי לחקור activators פוטנציאליים אחרים או מעכבי הפלישה.

Assay Spheroid למדוד TGF-β-Induced Invasion

סרטון זה מתאר את הטכניקה של תרבית תלת-ממדית של תאי קרצינומה ריאתיים כדי לחקור את אינטראקציות התא-מטריצה. בפרוטוקול, נבצע את התרבית התלת-ממדית של תאי קרצינומה ריאתיים TUM622 כדי לחקור את הפוטנציאל של יצירת אורגנואידים במבחנה.

תרבית תלת-ממדית של תאי קרצינומה של ריאות: שיטה לחקר אינטראקציות בין תאים למטריצות

בשיטות סטנדרטיות תרבות תאים נלקחים מתוך הסביבה הפיזיולוגית שלהם וגדלו על משטח הפלסטיק של מנה. כדי לחקור את התנהגותם של תאים במח עצם אנושיים ראשוניים שיצרנו מערכת תרבות 3-D בו תאים גדלים בתנאים משחזרים microenvironment יליד הרקמות.

דגם תרבות רקמות תלת ממדי למחקר עיקרי עצם אדם מח וממאיר שלו

מאמר זה מספק מתודולוגיות מפורטות לשימוש במבחנים תלת ממדי (3D) לכמת פלישת תאי סרטן השד. באופן ספציפי, אנו דנים בהליכים הנדרשים להקמת מבחני כאלה, כימות, וניתוח נתונים, וכן שיטות לבדיקת ההפסד של שלמות קרום המתרחש כאשר תאים לפלוש.

כימות של הפולשנות תאי סרטן השד תוך שימוש במודל תלת ממדים (3D)

כאן אנו מציגים פרוטוקול לתרבית משותפת בתלת מימד, שימושי לחקירת אינטראקציות רב-תאיות ואפנון תלוי מטריצה חוץ-תאית של התנהגות תאי סרטן. במודל ניסיוני זה, תאים סרטניים מתורבתים על ג'ל קולגן המשובץ בפיברובלסטים הקשורים לסרטן אנושי.

מודל שיתוף תרבות תלת-ממדי לגידול אינטראקציה-סטרומה

אנו מדגימים שיטה ליצירת פונדקאיות תלת מימדיות לסרטן השד, שניתן לתרבית באמצעות מערכת ביו-ריאקטור זלוף כדי לספק חמצן וחומרים מזינים. לאחר הגדילה, הפונדקאיות מקובעות ומעובדות לפרפין להערכת פרמטרים מעניינים. מוסברת ההערכה של פרמטר אחד כזה, צפיפות התאים.

הכנה וניתוח של<em&gt; במבחנה</em&gt; שלושה שד ממדי המחליפים קרצינומה

תאי סרטן מוטבעים בג'ל קולגן ולאחר מכן נדחקים בג'ל פיברין תאי כדי ליצור מערכת תרבית תלת מימדית שבה ניתן לנטר את הפולשניות והיווצרות גידולי לווין.

תלת ממדי Assay תרבות לחקור הפולשנות תאים סרטניים היווצרות גידולים בלוויין

כאן, אנו מתארים שיטה תלת מימדי התרבות לנתח המורפולוגיה של ראשי תאים סרטניים בשד, כמו גם כדי לחקור את יחסי הגומלין ישירים ועקיפים ומונוציטים לבין התוצאות כגון קולגן השפלה, גיוס תאים חיסוניים, תא הפלישה, קידום של דלקת הקשורים לסרטן.

ניתוח התקשורת בין ומונוציטים ו תאים סרטניים בשד ראשי במטריצה חוץ-תאית לחלץ (ECME)-מבוסס מערכת תלת מימדי

פרוטוקול זה מספק כלים ניסיוניים במבחנה כדי להעריך את הטרנספורמציה של תאי אם אנושיים. מתוארים שלבים מפורטים לקצב התפשטות תאים, יכולת צמיחה בלתי תלויה בעיגון והפצה של שושלת תאים בתרבויות תלת-מימד עם מטריצת קרום מרתף.

הערכה במבחנה של טרנספורמציה אונקוגנית בתאי אפיתל ממ"ר אנושיים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הקמתן של תרביות תלת-ממדיות 'על גבי' של קו תאי אפיתל שד ללא טרנספורמציה, MCF10A, ששונה כדי לחקור טרנספורמציה המושרה על-ידי גורם מפעיל טסיות (PAF). אימונו-פלואורסצנציה שימשה להערכת השינוי ונדונה בפירוט.

מתווך פוספוליפידים המושרה טרנספורמציה בתרבויות תלת מימדיות

למדו להבדיל בין תאי שד שפירים לבין תאים ממאירים באמצעות מערכת תרבית תלת-ממדית. השיטה כוללת זריעת תאים על מטריגל וניתוח אימונוהיסטוכימי כדי לזהות שינויים פנוטיפיים ומולקולריים בחקר הסרטן.

שלוש תרבויות ממדים: כלי ללמוד רגיל אדריכלות acinar לעומת שינוי ממאיר של תאי שד

גלה סרטונים נוספים